趙騰蛟　　趙亞君袁博　　舍雅麗　　李長天　　張敏孫亞敏作者單位：70000　　蘭州　甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；甘肅省人民醫(yī)院病理科；70050　　蘭州　蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科

iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達及臨床意義

趙騰蛟1趙亞君1袁博1舍雅麗1李長天1張敏2孫亞敏3
作者單位：730000蘭州1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2甘肅省人民醫(yī)院病理科；730050蘭州3蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科

【摘要】目的 探討誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達及臨床意義。方法 用Evision兩步法免疫組化檢測31例胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤及其癌旁正常組織中的iNOS表達，并分析其與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤及癌旁正常組織中的陽性表達率分別為64.5%（20/31）和29.03%（9/31）。iNOS的表達與臨床分期、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染相關(guān)（P＜0.05）；而與年齡、性別、LDH水平無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論 iNOS可能參與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為評估其生物學(xué)行為的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】胃淋巴瘤；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤；免疫組化；表達；臨床意義

胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤是一組最常見的結(jié)外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤，為一個獨立亞型，診斷難度大，已有研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）密切相關(guān)［1］。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）可分為兩型，即構(gòu)成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），iNOS是催化一氧化氮（NO）重要的同工酶之一，被認為是NO合成的關(guān)鍵酶，在靜息狀態(tài)下，iNOS基因不表達，而在病理狀態(tài)下，可以產(chǎn)生大量的NO［2］。本研究通過Envision兩步法免疫組化檢測iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達情況，探討iNOS表達與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系。

1　　資料與方法

1.1一般資料

收集2008年9月至2015年10月甘肅省人民醫(yī)院病理科及蘭州軍區(qū)總醫(yī)院病理科確診的胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤31例癌組織及癌旁正常組織，制作成石蠟標(biāo)本。其中男性16例，女性15例；年齡22～78歲（中位年齡48歲），其中＜45歲者15例，≥45歲者16例。診斷符合《淋巴瘤病理診斷》［3，4］，臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期19例；Hp陰性11例，陽性20例。所有患者標(biāo)本采集均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。病理活檢前均未進行抗腫瘤化療或者放療。所有組織標(biāo)本均經(jīng)過10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚4 μm，行HE和免疫組化染色。

1.2主要試劑及檢測方法

兔抗人iNOS多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司（由北京中杉金橋生物技術(shù)公司進口分裝），Envision兩步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，按試劑盒說明書操作，iNOS工作濃度為1∶50，所有切片均采用微波修復(fù)抗原。以PBS替代一抗作陰性對照。

將4 μm石蠟切片脫蠟，3%過氧化氫10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，胰酶修復(fù)20 min，10%山羊血清室溫封閉20 min，iNOS抗體（1∶50）濕盒中4℃冰箱過夜，滴加二抗、三抗室溫下濕盒內(nèi)孵育各20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、封片。

1.3結(jié)果判定

由兩位經(jīng)驗豐富的病理科高年資主治醫(yī)師采用雙盲法讀片，光鏡下觀察整個切片，每例切片隨機選擇5個高倍鏡視野進行結(jié)果判定，每個視野計數(shù)100個細胞，每例標(biāo)本計數(shù)3張切片。免疫組化陽性染色為細胞核和（或）細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯棕黃色或棕褐色顆粒。參照二級計分法：⑴陽性細胞百分率≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%為4分，無陽性細胞計0分；⑵細胞染色強度無染色計0分，弱染色（淺黃色）計1分，中等染色（棕黃色）計2分，強染色（棕褐色）計3分。兩項得分相乘：0分設(shè)為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）；設(shè)≤4分為低表達，＞4分為高表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。組間比較用Χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達

在高倍顯微鏡（×400）下iNOS陽性表達位于細胞核和細胞質(zhì)，但在細胞質(zhì)內(nèi)明顯表達，呈棕黃色或棕褐色（見圖1）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達率分別為64.5%（20/31）和29.03%（9/31），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1　iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達（Envision×400）

表1　iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的表達情況［n（%）］

2.2iNOS陽性表達與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系

iNOS陽性表達與臨床分期及Hp感染有關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、LDH水平無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2　iNOS陽性表達與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

3　　討論

胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤是一種由慢性炎癥繼發(fā)的淋巴組織發(fā)生的低度惡性B細胞淋巴瘤，也是一種最常見的結(jié)外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤，與脾邊緣區(qū)淋巴瘤和淋巴結(jié)邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤在免疫表型、形態(tài)及遺傳特征上都具有相同之處，可發(fā)生于全身多個部位，如眼附屬器、肺部、甲狀腺、胃腸道、乳腺、腦、皮膚、生殖器、腎臟、膀胱、口腔、胸腺等，其中以胃腸道最為多見［5］。

NOS是催化精氨酸生成NO的關(guān)鍵酶，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。在正常情況下，其短暫合成的NO在維持神經(jīng)細胞的效應(yīng)傳遞功能和血管的舒縮功能、保證血管擴張、血液供應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。iNOS在病理狀態(tài)下受炎癥、腫瘤等多種刺激因素誘導(dǎo)而大量表達，在分子水平上催化精氨酸持續(xù)產(chǎn)生大量NO，參與疾病的病理過程，在多種疾病發(fā)病中產(chǎn)生重要作用［6］。

有研究表明，iNOS在胃癌、鼻咽癌、惡性淋巴瘤、骨肉瘤等惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用［7，8］。iNOS在食管癌中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且與食管癌的組織學(xué)分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明iNOS與食管癌惡性進程息息相關(guān)［9］。還有研究表明［10］，iNOS與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。此外，iNOS在骨肉瘤中的表達增高［11］，并且隨著臨床分期、病理分級的增高而增高。卜慶等［12］應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測25例外周T細胞淋巴瘤（PTCL）患者化療前、后外周血iNOS與血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）的表達，結(jié)果表明，PTCL患者血清中iNOS、VEGF的含量較健康對照組人群顯著增高，其原因可能與iNOS促進VEGF分泌，而VEGF又促進血管生成及內(nèi)皮細胞遷移，從而促進腫瘤浸潤有關(guān)。

本研究通過Envision兩步法免疫組化檢測iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的表達，結(jié)果顯示，iNOS在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中的陽性表達率達64.5%，進一步分析發(fā)現(xiàn)，iNOS陽性表達與臨床分期、Hp感染有關(guān)（P＜0.05），與患者的性別、年齡、LDH水平無關(guān)（P＞0.05），表明iNOS陽性表達與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這與Li等［13］研究結(jié)果一致，即臨床分期越晚，iNOS陽性表達越高，這可能與釋放過多NO，激活炎性介質(zhì)有關(guān)。另外，需要特別指出的是，Hp感染可促使胃黏膜組織內(nèi)iNOS高表達及NO含量增加，同時可推測高表達的iNOS、NO與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤瘤浸潤程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明由iNOS產(chǎn)生的NO可能作為一種新的炎癥因子，參與Hp感染致胃黏膜損傷的過程。因此，根治Hp感染，對于提高胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的療效至關(guān)重要。

國內(nèi)外研究表明，環(huán)氧合酶-2（COX-2）、iNOS在炎癥反應(yīng)中起重要作用，兩者在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤表達中具有相關(guān)性［14］。在正常生理條件下，COX-2、iNOS在多數(shù)組織內(nèi)均檢測不到，但受到各種病理因素刺激后，如Hp感染產(chǎn)生大量炎性因子，可誘導(dǎo)COX-2、iNOS迅速表達。有學(xué)者［15］提出Hp感染與NO和亞硝酸鹽持續(xù)產(chǎn)物形成有關(guān)；NO還可通過結(jié)合到COX-2的活性位點激活COX-2的炎癥介質(zhì)，與過氧化亞硝酸加速脂類和巰基化合物發(fā)生氧化反應(yīng)，引起急、慢性炎癥。iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO及供體硝普鈉在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平均可誘導(dǎo)COX-2的表達。但由于目前試劑及收集的病例數(shù)有限，本研究未檢測COX-2在胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤組織中的表達，需今后進一步研究。

總之，iNOS與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，有望成為判斷淋巴瘤預(yù)后新的標(biāo)志物，而針對iNOS可能研發(fā)新型靶向治療藥物，為治療提供新方法。

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［2016-01-28收稿］［2016-03-29修回］［編輯江德吉］

【中圖分類號】R735.2

【文獻標(biāo)志碼】A

【文章編號】1674-5671（2016）03-04

DOI：10.3969/j.issn.1674-5671.2016.03.05

【通信作者】李長天。E-mail：lichangtian68@163.com

Expression of iNOS in gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma carcinoma and its clinical significance

Zhao Tengjiao1，Zhao Yajun1，Yuan Bo1，She Yali1，Li Changtian1，Zhang Min2，Sun Yamin3（1Basic Medical College，Gansu University of Chinese Medicine；2Department of Pathology，Gansu Provincial People′s Hospital，Lanzhou 730000，P.R.China；3Department of Pathology，General Hospital of Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730050，P.R.China）
Corresponding author：Li Changtian.E-mail：lichangtian68@163.com

【Abstract】Objective To explore the expression and its clinical significance of inducible nitric oxide synthase（iNOS）in gastric mucosa-associated lymphoid tissue（MALT）lymphoma.Methods Immunohistochemistry was used to detect iNOS expression in tissue sections from 31 gastric MALT lymphomas and paired adjacent tissues.Then possible relationships were explored between iNOS expression and clinicopathological variables.Results The rate of high expression of iNOS was significantly higher in MALT lymphoma tissue（64.5%）than in paired adjacent tissues（29.03%，P＜0.05）.Level of iNOS expression correlated with Ann-Arbor clinical stage and Helicobacter pylori（P＜0.05），but not with gender，age or lymph node metastasi s（P＞0.05）.Conclusion Expression of iNOS may contribute to the occurrence and development of gastric MALT lymphoma.This protein may serve as a biomarker for evaluating tumor behavior in patients with this disease.

【Key words】Gastric lymphoma；Inducible nitric oxide synthase；Gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma；Immunohistochemistry；Expression；Clinical significance