任柯 張志剛崔鳳霞

（1.鄭州市第十九中學(xué) 河南鄭州 450001 2.鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心 河南鄭州 450066）

高產(chǎn)D-核糖菌株選育

任柯1張志剛1崔鳳霞2

（1.鄭州市第十九中學(xué) 河南鄭州 450001 2.鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心 河南鄭州 450066）

以枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮醇酶變異株為出發(fā)菌株，運(yùn)用物理和化學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行復(fù)合誘變，將出發(fā)菌株在紫外燈下照射后加入硫酸二乙酯置于搖床上誘變，再加入硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。選出多個(gè)誘變后菌株，進(jìn)行初篩和復(fù)篩，反復(fù)幾次，以未經(jīng)處理的菌株做對(duì)照，對(duì)突變株進(jìn)行多次傳代和D-核糖發(fā)酵試驗(yàn)，選育出D-核糖高產(chǎn)突變株。

D-核糖；復(fù)合誘變；高產(chǎn)菌株；選育；發(fā)酵

D-核糖（D-Ribose，D-R）是一種五碳糖，是目前合成維生素B2的重要原料，也可用于合成抗病毒、抗腫瘤的藥物[1]?？梢赞D(zhuǎn)化為核糖核苷酸和核黃素，應(yīng)用于制藥、醫(yī)藥、化妝品、健康食品以及動(dòng)物飼料等方面。近年來發(fā)現(xiàn)，D-核糖能提高心臟對(duì)局部缺血的耐性，改善心肌功能、有效緩解運(yùn)動(dòng)后引起的肌肉疼痛，是新興的醫(yī)藥保健品，目前在歐美日本等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)流行，市場(chǎng)需求上升較快。D-核糖還可作為天然的食品甜味劑，所含熱量低且不會(huì)引起血糖升高，是肥胖病人、糖尿病人理想的甜味替代品。從未來發(fā)展趨勢(shì)看，隨著核酸藥物的發(fā)展和D-核糖功能作用的認(rèn)知，D-核糖將作為保健食品被廣泛使用，其市場(chǎng)將在今后較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)持續(xù)增長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外D-核糖生產(chǎn)廠家普遍采用生物發(fā)酵法，是以葡萄糖為原料，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，具有成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[2]。D-核糖在我國(guó)發(fā)酵工業(yè)中是一新興的發(fā)酵產(chǎn)品，隨著D-核糖產(chǎn)品及其衍生物應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展、延伸，新產(chǎn)品的持續(xù)開發(fā)和市場(chǎng)需求的發(fā)展，獲得高產(chǎn)D-核糖的菌種已成為微生物領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)在D-核糖發(fā)酵方面的研究進(jìn)展迅速，但與國(guó)外還有一些差距，存在菌種易退化、發(fā)酵產(chǎn)率較低、成本較高等問題。因此，本項(xiàng)目主要研究適合我國(guó)發(fā)酵企業(yè)自身?xiàng)l件和特點(diǎn)的高產(chǎn)D-核糖菌種技術(shù)，以達(dá)到充分挖掘引進(jìn)高產(chǎn)菌株的潛力，進(jìn)一步提高產(chǎn)能，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本的目的，本文報(bào)道了此項(xiàng)研究結(jié)果。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）供試菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase）變異株，鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司技術(shù)中心保存。

（2）儀器：高速冷凍離心機(jī)、真空干燥箱、臺(tái)式恒溫振蕩器、紫外可見分光光度計(jì)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電磁攪拌器、酸度計(jì)、100ml帶蓋玻璃瓶（耐冷耐熱）、生物傳感儀、超低溫冰箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器等。

1.2 培養(yǎng)基

（1）基本培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15.0，硫酸銨 2.0，硫酸鎂 0.5，磷酸氫二鉀2.0，磷酸二氫鉀2.0，玉米漿2.0，瓊脂30.0，pH值7.0～7.2。

（2）補(bǔ)充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加0.3g/L莽草酸。

（3）完全培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15.0，牛肉膏 20.0，蛋白胨 5.0，酵母膏 2.0，瓊脂 30.0，pH 值 7.0～7.2。

（4）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20.0，玉米漿 10.0，酵母膏 4.0，蛋白胨10.0，磷酸氫二鉀2.0，磷酸二氫鉀1.0，pH值7.2～7.5。

（5）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 90.0，葡萄酸鈣 50.0，玉米漿20.0，硫酸銨 2.0，硫酸錳 0.2，酵母粉 3.0，硫酸鎂 0.4，pH 值 7.2～7.5。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種誘變處理

將保存的菌種接到完全培養(yǎng)基斜面上，40℃培養(yǎng)30h后，冰箱冷藏30h。將20ml無菌生理鹽水倒人試管內(nèi)收集菌懸液，轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，并加入玻璃珠在200r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩打散細(xì)胞，制成單細(xì)胞菌懸液冷藏備用。

1.3.2 紫外誘變

取1ml菌懸液用生理鹽水按梯度稀釋法[3]稀釋到10-9數(shù)量級(jí)，在直徑45mm的培養(yǎng)皿中加入5ml單細(xì)胞懸浮液，放入暗箱并用電磁攪拌器進(jìn)行攪拌，在50W紫外燈下距離15cm照射（紫外燈先預(yù)熱30min，使其波長(zhǎng)穩(wěn)定），不同處理時(shí)間（60s，90s，120s），黑暗中靜置10h備用。

1.3.3 硫酸二乙酯（D ES）誘變

將5ml經(jīng)過紫外誘變處理的菌懸液加入到20ml磷酸鹽緩沖液中，再加入1%的DES，40℃置于150r/min的搖床上誘變處理30min，加入硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。

1.3.4 菌株初篩

將在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，卻能在補(bǔ)充培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落作為初篩對(duì)象轉(zhuǎn)接于裝有完全培養(yǎng)基的試管斜面上，40℃培養(yǎng)60～72h后挑選生長(zhǎng)好的作為復(fù)篩對(duì)象冷藏備用。

1.3.5 菌種定向復(fù)篩

對(duì)初篩選出的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，多次篩選并測(cè)定D-核糖的產(chǎn)量。

1.3.6 菌株產(chǎn)D-核糖的能力試驗(yàn)

種子培養(yǎng)：種子培養(yǎng)基的裝液量為250ml三角瓶50ml，搖床，40℃培養(yǎng)25h。發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為500ml三角瓶60ml，接種量5%，搖床40℃發(fā)酵72h。將誘變后的菌株連續(xù)傳代10次后，測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性和產(chǎn)D-核糖能力。

1.4 測(cè)定方法

菌體OD值測(cè)定：將菌液稀釋10倍，紫外可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)650nm處測(cè)定光密度[4]。pH值測(cè)定：用pH計(jì)測(cè)定。D-核糖含量測(cè)定：用苔黑酚法測(cè)定[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化觀察

在發(fā)酵過程中，高產(chǎn)突變株的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，前期菌體個(gè)體形態(tài)小，呈單個(gè)細(xì)桿狀，分裂末端呈圓形。中、后期菌體形成鏈狀、鎖狀及數(shù)字狀，形如霉菌菌絲體，并且菌體形態(tài)粗壯，但到發(fā)酵結(jié)束后，菌體又恢復(fù)呈單個(gè)桿菌狀。而原出發(fā)菌株前期末端呈平頭狀，菌體形態(tài)粗短，中、后期成鏈狀，分隔明顯。

2.2 高產(chǎn)菌種遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

經(jīng)反復(fù)多次誘變篩選最終從出發(fā)株得到突變株。為了考察高產(chǎn)菌種的遺傳穩(wěn)定性，將突變菌株連續(xù)傳代10次后，測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性和產(chǎn)D-核糖能力，結(jié)果見表1。

表1 菌種的遺傳穩(wěn)定性

由表1可知，10代D-核糖產(chǎn)量在109.6g/L，仍維持在較高的發(fā)酵水平，平均D-核糖產(chǎn)糖量在110.3g/L，沒有發(fā)生顯著變化，說明高產(chǎn)突變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，這是一個(gè)穩(wěn)定的突變株。

2.3 發(fā)酵過程的各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)照

對(duì)供試菌株和高產(chǎn)突變菌株各做了10批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

從表2中兩組數(shù)據(jù)可以看出，高產(chǎn)突變菌株平均單次D-核糖含量為110.3g/L，平均轉(zhuǎn)化率66.3%；供試菌株平均單次D-核糖含量為75.1g/L，平均轉(zhuǎn)化率45.6%，前者比后者分別多出35.2g/L和20.7%，效果是極其顯著的。

表2 變異菌株的發(fā)酵產(chǎn)糖量及轉(zhuǎn)化率

3 結(jié)論

供試菌種經(jīng)紫外和化學(xué)誘變處理后，通過選育具有莽草酸缺陷的突變株，獲得了產(chǎn)物積累能力較高的D-核糖生產(chǎn)菌株。與原出發(fā)菌株相比，該菌株使發(fā)酵液pH穩(wěn)定在5.5～6.8之間，能使D-核糖單批含量大大提高（平均為110.3g/L），平均提高35.2g/L，增幅達(dá)46.90%，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率增幅達(dá)45.4%。而且該突變株具有穩(wěn)定的遺傳性，經(jīng)10代傳種后遺傳性無明顯變化，產(chǎn)量穩(wěn)定，具有典型的缺失轉(zhuǎn)酮酶突變株的生長(zhǎng)特點(diǎn)，具有很大的生產(chǎn)潛力。

在此，特別感謝輔導(dǎo)老師張志剛的鼎力幫助，謝謝張老師的指導(dǎo)！

[1]邱蔚然，高淑紅.發(fā)酵法生產(chǎn) D-核糖[J].工業(yè)微生物，2003，30（1）：58～64.

[2]Sasajima K，Yoneda M.Carbohydrate metabolism-mutants of a Bacillus species part II.D-ribose accumulation by pentose phosphate pathway mutants[J].Agr Biol Chem，1971，35（4）：509～517.

[3]范秀容，沈 萍.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1988：102.

[4]任蓓蕾，史小莉，閆世梁，等.D-核糖產(chǎn)生菌抗噬菌體菌株的選育[J].中國(guó)新技術(shù)新產(chǎn)品，2011，197（07）：14～15.

[5]彭其安，張西峰，吳思方，等.同源重組法構(gòu)建枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮酶缺失突變菌株[J].生物技術(shù)，2006，16（6）：23～16.

張志剛，男，高級(jí)教師，從事生物方面的研究。

Q939.99

A

1005-7897（2016）04-0118-02

2016-2-10

任柯（1999-），女，河南鄭州人，高中生，對(duì)微生物比較感興趣，根據(jù)暑期社會(huì)實(shí)踐科技創(chuàng)新活動(dòng)工作整理。