王　靜，紀維紅，徐長林，蘇軍虎,3

(1.蘭州職業(yè)技術學院，甘肅 蘭州　730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州　730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學-新西蘭梅西大學草地生物多樣性研究中心，甘肅 蘭州　730070； 4.Institute of Natural and Mathematical Sciences,Massey University,Private Bag 102 904 North Shore Mail Centre 0632,Auckland,New Zealand)

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達烏爾黃鼠線粒體Cyt b 基因序列特征及其系統(tǒng)進化分析

王靜1，紀維紅2,3,4，徐長林2，蘇軍虎2,3

(1.蘭州職業(yè)技術學院，甘肅 蘭州730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學-新西蘭梅西大學草地生物多樣性研究中心，甘肅 蘭州730070； 4.Institute of Natural and Mathematical Sciences,Massey University,Private Bag 102 904 North Shore Mail Centre 0632,Auckland,New Zealand)

在甘肅省天祝藏族自治縣采集12只達烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)，PCR產(chǎn)物直接測序獲得Cyt b基因1140 bp序列，采用Clustal X 1.84、MEGA 6.0、Dna SP 5.0 等生物信息學軟件進行了序列特征和系統(tǒng)地位分析。結(jié)果顯示，達烏爾黃鼠Cyt b基因含116個多態(tài)信息位點，群體中多態(tài)位點類型有轉(zhuǎn)換、顛換，Cyt b基因T，C，A，G堿基含量分別為33.7%，25.9%，27.6%，12.9%?；贙imura雙參數(shù)的遺傳距離顯示，屬內(nèi)種間大黃鼠(Spermophilusmajor)與新疆黃鼠(Spermophilusfulvus)間遺傳距離最小(0.034)，高加索黃鼠(Spermophilusmusicus)與達烏爾黃鼠最大(0.172)，達烏爾黃鼠群體內(nèi)遺傳距離為0.140，種群分化較大，基于NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹符合傳統(tǒng)分類標準，研究為達烏爾黃鼠Cyt b基因標記的種群遺傳學應用提供了參考。

達烏爾黃鼠；線粒體；遺傳多樣性；Cyt b

達烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)又名草原黃鼠，隸屬于嚙齒目松鼠科[1]，是地棲松鼠類的一種，大多棲息在沙質(zhì)或半沙質(zhì)山坡、平原等[2]。其分布范圍比較廣，多見于我國東北、華北、西北等地區(qū)，主要是鼠疫的宿主和農(nóng)業(yè)、牧業(yè)、林業(yè)等的害鼠之一，對人類衛(wèi)生健康也有較大的影響。

一個物種的準確分類和生態(tài)學認識是其綜合利用和管理的關鍵，迄今有關達烏爾黃鼠的形態(tài)、分類與分布、生長發(fā)育與繁殖、年齡、性比、種群數(shù)量動態(tài)、棲息地特征、食性、晝夜活動節(jié)律、實驗動物化開發(fā)及防控等方面取得了豐富的研究成果[3-6]。系統(tǒng)分類地位方面，對達烏爾黃鼠種的劃分仍存有爭議，Gunduz等[7]比較了土耳其黃鼠屬物種的形態(tài)等差異，并描述了一個新種。Tsvirka等[8]比較了黃鼠屬(Spermophilus)內(nèi)物種的分子遺傳關系。Helgen等[9]對包含達烏爾黃鼠的黃鼠屬物種進行了詳細的分類，并論證了屬內(nèi)各物種之間的關系。甘肅境內(nèi)達烏爾黃鼠分布較廣[10]，天祝地區(qū)存有阿拉善黃鼠(Spermophilusalaschanicus)，對其進一步的研究可為種的合理劃分及其綜合管理利用提供基礎。

線粒體是真核細胞中最小的復制單位，因其具有拷貝數(shù)目多、化學分子量小、蛋白質(zhì)編碼效率高、母系遺傳和進化速度也較核基因組快等特點，近年來越來越多的被作為分子標記，廣泛地應用在動物進化遺傳學、遺傳多樣性、分子生態(tài)學、物種以及品系鑒定等方面[11]。線粒體的細胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)位于線粒體內(nèi)膜的磷脂雙分子層中，是參與氧化磷酸化合成能量ATP過程電子傳遞鏈中不可或缺的重要物質(zhì)，也是線粒體自身編碼的為數(shù)不多的蛋白質(zhì)之一[12]。Meyer的研究表明，初步進行某種物種分子系統(tǒng)發(fā)育研究時可以首先采用Cyt b基因，它是13個蛋白質(zhì)編碼基因中了解的最為清楚的基因，也是被認為最可信的分子標記之一，同時用保守引物擴增線粒體Cyt b基因較其他線粒體基因要容易的多，因此線粒體Cyt b基因研究較為廣泛。已有研究表明線粒體Cyt b基因在研究親緣關系較近的物種分類階元系統(tǒng)關系和種系地理學方面非常有用[13]。對甘肅省境內(nèi)達烏爾黃鼠分子分類學地位的研究報道較少，通過對達烏爾黃鼠線粒體Cyt b基因全序列進行序列分析，并與Gen Bank中黃鼠屬的多個種Cyt b基因進行同源性比較分析，目的在為達烏爾黃鼠種質(zhì)資源保護、研究和利用提供基礎研究數(shù)據(jù)，為達烏爾黃鼠的綜合控制、管理和開發(fā)利用等提供參考。

1　材料和方法

1.1樣本采集

12只達烏爾黃鼠于2012年6～7月從甘肅省境內(nèi)的武威市天祝自治縣采集。其中，雄性4只(成年個體3只)，雌性8只(成年個體4只)。采集肝臟后，于體積分數(shù)為95%的乙醇中保存，帶入實驗室置于-70℃冰箱冷凍保存待用。再根據(jù)頭骨類型、牙齒及其他性狀特征，通過參照標本，對比鑒別[14-15]，將其歸分為達烏爾黃鼠。

1.2基因組DNA的提取

稱取研磨的肝臟組織0.5～1.0 g，采用常規(guī)的酚氯仿抽提法提取基因組DNA[16]。

1.3線粒體DNA序列的擴增及測定

參考序列來自NCBI上發(fā)表的黃鼠屬(登錄號為NC005315)等線粒體DNA全序列。利用Clustal X(1.83)軟件[17]和BLAST軟件進行序列對比后，用Primer Premier 5.0設計[18]用于擴增控制區(qū)的特異性引物，所用引物由上海生工生物技術有限公司合成。引物序列為：上游5′-TCCCCAAAGCATCAAGGAAG；下游5′-GGCATGGGCTGATTAGACATT。PCR擴增的反應體系：DNA模板1 μL，PCR buffer(含Mg2+20 mmol/L)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 uL，TaqDNA聚合酶(2 U/uL)0.5 μL，加水補足25 μL。擴增的反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，然后于4℃保存。擴增得到的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa)進行純化、回收，對擴增效果良好的樣品送往上海生工生物工程有限公司進行雙向測定。

1.4數(shù)據(jù)處理和分析

通過Chromas (V 1.45)軟件獲得原始序列數(shù)據(jù)，同時進行人工校對，用Clustal X(1.83)程序?qū)λ玫腄NA序列進行比對。通過Dna SP 5.0[19]比較分析。檢測多態(tài)位點，劃分單倍型，測定單倍型多樣度。基于Kimura雙參數(shù)法估算遺傳距離[20]，應用MEGA 6.0[21]的鄰近距離法(NJ)，參照文獻[9]的方法以草原旱獺(Marmotabobak)為外群構(gòu)建親緣關系樹，自引導檢驗估計系統(tǒng)樹中結(jié)點的置信度，重復次數(shù)為1 000次。

2　結(jié)果與分析

2.1各序列變異分析

通過測序獲得了達烏爾黃鼠的Cyt b基因1 140 bp序列，發(fā)現(xiàn)了達烏爾黃鼠有116個多態(tài)信息位點，群體中多態(tài)位點類型有轉(zhuǎn)換、顛換，T，C，A，G堿基含量分別為33.7%，25.9%，27.6%，12.8%。表現(xiàn)出明顯的反G偏倚，G+C含量(38.7%)明顯小于A+T(61.3%)含量(表1)。

2.2遺傳距離分析

用MEGA 6.0軟件分析得到Kimura-2 parameter遺傳距離(表2)。研究結(jié)果顯示，各群體間的遺傳距離都與群體內(nèi)的一致。內(nèi)類群的最小遺傳距離是大黃鼠與新疆黃鼠之間(0.034)，最大遺傳距離是高加索黃鼠與達烏爾黃鼠之間(0.172)。長尾黃鼠，達烏爾黃鼠，安納托利亞黃鼠3個近緣物種之間的遺傳距離在(0.132)～0.169，平均遺傳距離為0.147。

2.3分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建

根據(jù)Cyt b 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中，處于進化外群的是兩種旱獺M.robusya和M.bobak。進化處于頂端的兩個物種是猶地州地松鼠(S.mollis)和Spermophilusvigilis。本試驗所研究的12種黃鼠屬基本處于進化的中間位置。其中2個單倍型達烏爾黃鼠聚在一起形成一個分支再與安納托利亞黃鼠聚合成一個支。同樣是高加索黃鼠和小黃鼠先聚合后再與長

表1　黃鼠屬物種堿基序列組成

注：*為此研究測得的單倍型序列

表2　松鼠科Cyt b基因片段序列遺傳距離(基于Kimura雙參數(shù)模型)

注：SCI,SDA,ADA2,SER,SFU,SMA,SMU,SPY,SRE,SSU和SXA分別代表物種S.citellus,S.dauricus,S.dauricus,S.erythrogenys,S.fulvus,S.major,S.musicus,S.pygmaeus,S.relictus,S.suslicus.

尾黃鼠聚成一個合支形成姐妹群。新疆黃鼠和大黃鼠的分支與淡尾黃鼠(S.pallicaudata)和天山黃鼠的分支互為姐妹群，再與赤頰黃鼠聚合，最后與斑紋黃鼠聚合成一個合支。處于同一分支的物種遺傳距離小，相應的進化關系也相近(圖1)。

3　討論

線粒體 Cyt b基因一般情況不發(fā)生缺失和(或)插入，堿基置換大多數(shù)也很穩(wěn)定。很大程度上只傾向于轉(zhuǎn)換或顛換，并且編碼蛋白質(zhì)的密碼子位點進化速度不恒定。線粒體Cyt b基因和其他大多數(shù)的脊椎動物一樣，具有較高的保守性，也說明其在生物體的生命活動過程中的重要作用。Cyt b基因作為蛋白質(zhì)編碼基因比線粒體rDNA和非編碼區(qū)的基因更易于排序，再加上能用一些通用引物擴增[22]，所以，線粒體DNA細胞色素b序列在解決親緣關系較近的分類階元的系統(tǒng)關系方面很有用，被認為是解決系統(tǒng)發(fā)育問題最可信的分子標記之一[12]。通過試驗所測得的線粒體Cyt b 基因部分序列進行了分析，結(jié)果表明這幾種黃鼠科的線粒體Cyt b 基因序列合并后，A+T的平均含量為61.3%，明顯高于G+C的平均含量(38.7%)表現(xiàn)出明顯的A+T的含量偏斜。與其他黃鼠一樣，鳥嘌呤是稀有堿基，腺嘌呤出現(xiàn)比較頻繁，這與文獻記載的mtDNA富含A+T相一致[23]。

圖1　基于線粒體Cyt b基因序列構(gòu)建的NJ樹Fig.1　NJ tree of Spermophilus dauricus based on mitochondrial Cyt b gene sequences

用MEGA 6.0軟件分析得到的Kimura-2 parameter遺傳距離，結(jié)果顯示各群體間的遺傳距離都與群體內(nèi)的一致。最大遺傳距離為高加索黃鼠與達烏爾黃鼠之間(0.172)。最小遺傳距離是大黃鼠與新疆黃鼠之間(0.034)，其中，同種的達烏爾黃鼠由于生活在不同的地區(qū)，其進化關系也相對較遠，遺傳距離也比較大，為0.140。由分子系統(tǒng)樹分析大黃鼠和新疆黃鼠是姐妹種群，處于進化的頂端。而高加索黃鼠和達烏爾黃鼠處于分子樹的不同支，交點也處于各分支的端點。固然采集該屬內(nèi)所有的物種對構(gòu)建物種系統(tǒng)進化樹是很關鍵，物種的不全可能會導致系統(tǒng)關系的變化，今后有必要收集該屬內(nèi)更全面的物種，并利用多基因數(shù)據(jù)(線粒體基因組和核基因組)，或者更適宜的DNA條形碼進行分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關系的研究。

種群里的遺傳性狀在世代之間的變化是生物的進化。性狀是指基因的表現(xiàn)型，在繁殖過程中，基因會經(jīng)復制并傳遞到子代，基因的突變可使性狀改變，進而造成種群中個體之間的變異。新性狀又會因物種遷徙或是物種間的基因轉(zhuǎn)移，而隨著基因在種群中傳遞，并受到環(huán)境的影響與環(huán)境發(fā)生很好的契合，這些改變有更多的生態(tài)意義，可能會導致分布范圍變化與物種的形成[24]。分子生物學與生物化學可以利用構(gòu)成生命的各種分子，用來研究生物的進化關系。這些分子包括了核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、線粒體(Cyt b，D-loop)基因、蛋白質(zhì)與糖體等[25]。可以通過機器與電腦將這些分子的堿基序列、氨基酸序列定序構(gòu)建出與傳統(tǒng)分類學大致符合的分子系統(tǒng)樹。如此就能推斷并量化出物種間的親緣關系。本研究提供了甘肅境內(nèi)達烏爾黃鼠的Cyt b基因序列和分布信息，將為后續(xù)研究提供依據(jù)和相關信息，及進一步物種客觀的劃分等提供基礎，從而為該物種的有效管理與合理利用奠定基礎。

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Sequence analysis of mitochondrial Cyt b gene and evolutionary relationships ofSpermo-philusdauricus

WANG Jing1, JI Wei-hong2,3,4,XU Chang-lin2,SU Jun-hu2,3

(1.LanzhouVocationalTechnologyCollege,Lanzhou730070,China； 2.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem(MinistryofEducation)/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China； 3.GansuAgriculturalUniversity-MasseyUniversityResearchCentreforGrasslandBiodiversity,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China； 4.InstituteofNaturalandMathematicalSciences,MasseyUniversity,PrivateBag102 904NorthShoreMailCentre0632,Auckland,NewZealand)

TwelveSpermophilusdauricuswere collected from Tianzhu,Gansu Province,the mitochondrial 1140 bp Cyt b gene sequence were directly sequenced based on PCR products.Then Clustal X 1.84,MEGA 6.0 and Dna SP 5.0 bioinformatics software were used for sequence analysis.The results showed thatS.dauricushad 116 polymorphic information sites.Population polymorphic loci types had transition,transversion,Cyt b gene T,C,A,G nucleotide contents were 33.7%,25.9%,27.6%,12.9%.Based on genetic distance of Kimura two-parameter display,intraspecific between large ground squirrel (S.major) and Xinjiang ground squirrel (S.fulvus) genetic distance is the minimum (0.034),then Caucasian squirrels (S.musicus) and ground squirrels (S.dauricus) is the maximum (0.172),withinSpermophilusdauricusgenetic distance is 0.140,suggesting large population differentiation,NJ-based phylogenetic tree meeted with the traditional taxonomy.The results provided a reference marker toSpermophilusspeciespopulation genetics researches.

Spermophilusdauricus；mitochondrial；evolutionary relationships;Cyt b

2016-04-06；

2016-05-18

蘭州市農(nóng)業(yè)攻關項目“蘭州市農(nóng)田害鼠(達烏爾黃鼠)監(jiān)測及防控技術研究”(2013-4-131)；甘肅省高?？蒲许椖俊八幱脛游秣魇?塞隆骨)DNA條碼形篩選及鑒定研究”(2015A-205)資助

王靜(1982-),女,甘肅蘭州市人，博士,講師，主要從事生物工程的教學研究工作。

E-mail：jwang_423@126.com

S 443；Q 754

A

1009-5500(2016)03-0017-06

蘇軍虎為通訊作者。