江紹欽，李夢強，王玉兵，王輝麗，許恩賜

(1．福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，2．福建醫(yī)科大學免疫學系，福建福州　350001)

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·臨床研究·

HIF-1α和AMPK在前列腺癌中的表達及臨床意義

江紹欽，李夢強1，王玉兵1，王輝麗2，許恩賜1

(1．福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，2．福建醫(yī)科大學免疫學系，福建福州350001)

摘要：目的探討缺氧誘導因子1α(HIF-1α)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在前列腺癌中的表達及臨床意義。 方法收集我院2011年3月至2013年5月手術切除的前列腺癌標本34例，采用免疫組化SABC法染色觀察癌組織中HIF-1α、AMPK的表達情況。結果前列腺癌組織免疫組化顯示：年齡分組中，HIF-1α在高齡組陽性表達率為77.27%，顯著高于低年齡組的41.67%(P<0.05)。Gleason評分中，高分組HIF-1α的陽性表達率為74.07%，顯著高于低分組的28.57%(P<0.05)；高分組AMPK的陽性表達率為22.22%，顯著低于低分組的71.43%(P<0.05)。在TNM分組中，HIF-1α在高危組陽性表達率為84.21%，顯著高于低危組的40.00%(P<0.05)。HIF-1α在前列腺癌組織的高表達與AMPK的低表達呈負相關，具有統(tǒng)計學(P<0.05)。AMPK的陽性表達率在不同年齡、血清PSA、TNM分組比較中均無顯著差異(P>0.05)；HIF-1α在血清PSA分組比較無顯著差異(P>0.05)。結論HIF-1α和AMPK表達均同前列腺癌的病理及臨床預后相關。前列腺癌組織HIF-1α的高表達同AMPK低表達呈負相關，而AMPK有可能是前列腺癌細胞中HIF-1α活化調(diào)控的關鍵組分。

關鍵詞：缺氧誘導因子1α；腺苷酸活化蛋白激酶；前列腺腫瘤

前列腺癌是發(fā)達國家中死亡率排在第三位的惡性腫瘤，是男性中比較常見的癌癥[1]，國內(nèi)前列腺癌患病人數(shù)也在逐年增加。惡性腫瘤的過快生長造成瘤體嚴重缺氧及供能與耗能之間的不平衡。缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是調(diào)節(jié)腫瘤細胞耐受缺氧能力的核轉(zhuǎn)錄因子，能影響能量代謝相關的下游基因的轉(zhuǎn)錄表達，且相關實驗表明HIF-1α在多種瘤體缺氧環(huán)境下表達異常[2]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的能量變化感受器，主要調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的能量和代謝平衡[3]。AMPK同HIF-1α在前列腺癌組織的表達及調(diào)控關聯(lián)鮮有報道。本研究通過觀察前列腺癌組織中HIF-1α、AMPK表達情況，探究HIF-1α、AMPK在前列腺癌表達的關聯(lián)性及臨床意義。

1資料與方法

1.1研究對象收集福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科2011年3月至2013年5月手術切除的前列腺癌標本34例，年齡57～78歲，平均67歲。選取的患者均未行放療、化療及內(nèi)分泌治療且病理檢查均證實為前列腺癌。根據(jù)年齡、血清PSA、Gleason評分和TNM分期分組，將年齡>65歲者設為高年齡組(n=22), ≤65歲者設為低年齡組(n=12)；將PSA(ng/mL)>20者設為高PSA組(n=9), ≤20者設為低PSA組(n=24)，1例患者PSA缺失，被剔除；將Gleason評分>6分者設為高Gleason評分組(n=27)，≤6分者設為低Gleason評分組(n=7)；將TNM分期>T2b者設為高危組，≤T2b者設為低危組。

1.2主要試劑與儀器兔抗人HIF-1α單克隆抗體(美國epitmics公司，貨號#2015-1)；兔抗人p-AMPKα單克隆抗體(美國Cell Siganling公司，貨號#2535)；兔IgG-SABC即用型免疫組化試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司，貨號09F27C)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司，貨號ZLI-9018)；CX40光學顯微鏡(日本Olympus公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

1.3免疫組化染色手術切除的腫瘤組織于甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，組織切片。采用鏈霉親和素-生物素復合物法(strept avidin-biotin complex,SABC)進行染色，檢測前列腺癌組織中HIF-1α、AMPK的表達情況。染色操作過程嚴格按照SABC免疫組化試劑盒的說明書進行，陰性對照以PBS代替一抗。

1.4結果判定胞核和(或)胞質(zhì)染棕黃色為陽性。HIF-1α、AMPK染色結果的判斷方法：在光學顯微鏡(×400)下隨機選取5個視野，計數(shù)1 000個細胞。根據(jù)陽性細胞所占的百分比打分：陽性細胞>75%為4分，75%～51%為3分，50%～11%為2分，≤10%為1分，陰性為0分；再以染色強度打分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無色為0分。兩者評分乘積大于3分則判定為免疫反應陽性。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關性采用Spearman相關分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1HIF-1α、AMPK在不同年齡組的前列腺癌組織的表達HIF-1α在高齡組前列腺癌組織的陽性表達率為77.27%，顯著高于低年齡組的41.67%(P<0.05，表1)。AMPK在高齡組前列腺癌組織的陽性表達率為22.72%，低齡組為50.00%，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2、圖1、圖2)。

表1HIF-1α蛋白在前列腺癌的表達與臨床病理的關系

項目例數(shù)HIF-1α蛋白陽性陽性率(%)χ2值P值年齡(歲) ≤6512541.67 >65221777.274.3100.038Gleason評分 ≤67228.57 >6272074.075.0400.025PSA(ng/mL) ≤20241458.33 >209777.781.0690.301TNM分期 ≤T2b15640.00 >T2b191684.217.1740.007

表2AMPK蛋白在前列腺癌的表達與臨床病理的關系

項目例數(shù)AMPK蛋白陽性陽性率(%)χ2值P值年齡(歲) ≤6512650.00 >6522522.722.6390.104Gleason評分 ≤67571.43 >627622.226.1500.013PSA(ng/mL) ≤2024937.50 >209222.220.6870.407TNM分期 ≤T2b15426.67 >T2b19736.840.3970.529

2.2HIF-1α、AMPK表達與前列腺癌不同血清PSA水平組的關系HIF-1α、AMPK在血清PSA高水平組的前列腺癌組織的陽性表達率分別為77.78%、22.22%；低PSA水平組為58.33%、37.50%。兩指標PSA組間比較均不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1　HIF-1α蛋白在前列腺癌組織表達情況(×400)

圖2　AMPK蛋白在前列腺癌組織表達情況(×400)

2.3HIF-1α、AMPK表達與前列腺癌不同Gleason評分組的關系HIF-1α在高Gleason評分組前列腺癌組織的陽性表達率為74.07%，低Gleason評分組陽性表達率為28.57%；高評分組的HIF-1α陽性表達率顯著高于低評分組(P<0.05)。高評分組前列腺癌組織AMPK的陽性表達率為22.22%，而低評分組陽性表達率為71.43%，兩者差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4HIF-1α、AMPK表達與前列腺癌不同TNM分期組的關系高危組(T分期>T2b)HIF-1α陽性表達率為84.21%，顯著高于低危組(T分期≤T2b)的40.00%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AMPK的表達在TNM分組中未顯現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.5前列腺癌中HIF-1α表達和AMPK表達的相關性對前列腺癌的HIF-1α和AMPK表達結果進行卡方檢驗，χ2值為5.720(P=0.017)，說明兩個指標具有相關性。進一步運用Spearman的相關分析得出前列腺癌中HIF-1α的高表達與AMPK的低表達呈負相關(γs=-0.410，P=0.016)，結果具有統(tǒng)計學意義(表3)。

表3HIF-1α蛋白和AMPK蛋白在前列腺癌組織中的表達

項 目AMPK蛋白表達陽性陰性χ2值P值HIF-1α蛋白表達陽性418-0.4100.016陰性75

3討論

適應缺氧環(huán)境和改變糖能量代謝是腫瘤細胞生存的基本條件及生物學特征。有實驗表明處于缺氧環(huán)境中的13種實體腫瘤存在HIF-1α蛋白異常過量表達的情況，包括肺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌等[4-5]。HIF-1α是異源性二聚體HIF-1的亞單位，本質(zhì)是適應組織供氧環(huán)境變化的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。正常供氧條件下，組織細胞雖然可以不斷的合成HIF-1α蛋白，但是泛素-蛋白酶系統(tǒng)的特異性的分解作用下，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用較弱。當組織內(nèi)環(huán)境缺氧和(或)基因改變例如致瘤基因ERBB2、抑瘤基因VHL等突變都有可能造成HIF-1α的過量表達[6]。HIF-1α能誘導葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、丙酮酸脫氫酶激酶-1等相關基因的轉(zhuǎn)錄，促進缺氧瘤體內(nèi)新生血管的形成并舒張血管提高血氧供應，為腫瘤細胞的生存提供條件甚至刺激腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。本實驗結果顯示，HIF-1α蛋白在前列腺癌組織中存在明顯高表達，與前期相關報道相符。Gleason評分及TNM分期是預測前列腺癌臨床轉(zhuǎn)歸、預后以及選擇治療方案的重要參數(shù)，而高齡是前列腺癌較為明確的危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)Gleason高評分組和TNM分期高危組的HIF-1α的表達量均明顯高于Gleason低評分組和TNM分期低危組，高齡組的HIF-1α的表達量較低齡組高，均提示HIF-1α對指示前列腺癌生物學行為及預后具有重要作用。

本次研究還探討AMPK表達在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程的作用及HIF-1α和AMPK兩者之間的關聯(lián)。AMPK的本質(zhì)是高保守性的異源三聚體的絲/蘇氨酸激酶，由具有催化活性的α亞單位、具有調(diào)控作用的β亞單位以及γ亞單位構成[8]。它的主要生理功能是細胞能量感受器。當細胞面對例如缺氧或葡萄糖供給不足等各種不同的生存壓力時會導致細胞內(nèi)ATP/AMP的比率下降，繼而激活AMPK能量感受器并通過促進分解代謝通路(例如糖酵解、脂肪酸氧化)，抑制合成代謝通路(例如蛋白質(zhì)、糖原、脂質(zhì)的合成)來恢復細胞內(nèi)部的能量平衡。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)對促進細胞生長、增殖起到重要的作用[9]。有研究表明，AMPK是mTOR的上游調(diào)控分子之一，其激活可抑制mTOR過表達的腫瘤細胞的生長。在多種腫瘤AMPK相關的研究發(fā)現(xiàn)，在癌細胞內(nèi)存在AMPK表達過低、mTOR高表達現(xiàn)象，繼而促進細胞生長，這同腫瘤細胞增殖旺盛的特性相符。進一步的研究發(fā)現(xiàn)[10]：AMPK能負向調(diào)節(jié)腫瘤細胞內(nèi)的有氧糖酵解，抑制腫瘤的生長。HADAD等[11]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)AMPK低表達跟組織學分級和淋巴結轉(zhuǎn)移有著密切的關聯(lián)。本實驗結果顯示，AMPK蛋白在前列腺癌組織內(nèi)也呈低表達且與Gleason評分關系密切。Gleason高評分組的前列腺癌組織內(nèi)AMPK蛋白的表達更低，說明AMPK對于評價前列腺癌的預后風險有一定的意義。

研究發(fā)現(xiàn)在人肝細胞癌HepG2細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)AMPK與HIF-1α蛋白的合成存在反向作用關系，并且AMPK是通過TSC1/TSC2復合物來調(diào)節(jié)mTOR信號通路影響HIF-1α蛋白的表達[12]。本次實驗結果顯示前列腺癌組織中AMPK呈低表達狀態(tài)，低水平AMPK會減少TSC2的磷酸化及TSC復合物的產(chǎn)生繼而提高mTOR的信號傳導。前列腺癌細胞可能通過調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號增加HIF-1α蛋白表達，后者能激發(fā)血管內(nèi)皮生長因子等表達，促進缺氧瘤體內(nèi)新生血管形成，提高血氧供應以利于腫瘤細胞的生長擴散。TREINS等[13]研究也發(fā)現(xiàn)AMPK高表達能抑制mTOR信號通路，繼而降低胰島素和胰島素樣生長因子1誘導的HIF-1α蛋白表達。

綜上所述， HIF-1α、AMPK作為臨床檢測指標有助于對前列腺癌的病理診斷及鑒別診斷，同時有利于評估前列腺癌的生物學行為，對臨床判斷預后、疾病治療具有一定的指導意義。前列腺癌組織中AMPK同HIF-1α存在的調(diào)控關聯(lián)也可能成為今后抗癌治療研究的一個新突破點。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-06-28修回日期：2015-07-22

通訊作者:許恩賜，主任醫(yī)師，教授．E-mail:xuenci0531@163.com

作者簡介:江紹欽(1989-)，男(漢族)，碩士研究生．研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail:jiang81555767@126.com

中圖分類號:R737.25

文獻標志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.02.008

Expression and clinical significance of HIF-1α and AMPK in prostate cancer

JIANG Shao-qin1, LI Meng-qiang1, WANG Yu-bing1, WANG Hui-li2, XU En-ci1

(1.Department of Urology, Union Hospital of Fujian Medical University,2.Department of Immunology, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo detect the protein expression of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) and adenosine monophosphate activated protein kinase(AMPK) in prostate cancer and to explore their clinical significance.MethodsA total 34 cases of prostate cancer tissues collected in our hospital during Mar.2011 and May 2013 were enrolled in this study.The HIF-1α and AMPK protein expression was detected with immunohistochemistry SABC method.ResultsThe positive expression rate of HIF-1α protein in old-age group was 77.27%, which was significantly higher than that in young-age group(41.67%)(P<0.05).HIF-1α protein expression rate in high Gleason score group was 74.07%, which was significantly higher than that in low Gleason score group(28.57%)(P<0.05).On the contrary, the positive expression rate of AMPK protein in high Gleason score group was 22.22%, which was significantly lower than that in low Gleason score group(71.43%)(P<0.05).According to TNM standard, the positive expression rate of HIF-1α protein in high-risk group was 84.21%, which was significantly higher than that in low-risk group(40.00%)(P<0.05).HIF-1α and AMPK expression in prostate cancer tissues was significantly negatively correlated(P<0.05).There was no difference in the level of AMPK protein between patients of different age, prostate specific antigen(PSA), and TNM stage(P>0.05).The HIF-1α protein expression in different PSA groups had no statistically significance(P>0.05).ConclusionThe expression of HIF-1α and AMPK protein in prostate cancer was related with pathology and clinical prognosis.The high expression of HIF-1α in prostate cancer tissues was negatively correlated with the low expression of AMPK, which may be the key component to control activation of HIF-1α in prostate cancer.

KEY WORDS:hypoxia inducible factor-1α; AMP-activated protein kinase; prostate carcinoma

網(wǎng)絡出版時間：2015-07-28

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1374.R.20150728.1019.002.html