田萬強(qiáng),梅楚剛,付常振,辛亞平,張　松,王國(guó)慶,昝林森,3

(1 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3 國(guó)家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

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牛PRKAA2基因SNP檢測(cè)及與其生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

田萬強(qiáng)1,2,梅楚剛2,付常振2,辛亞平2,張松2,王國(guó)慶2,昝林森2,3

(1 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3 國(guó)家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 研究秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛共630頭個(gè)體的單磷酸腺苷激活的蛋白激酶α2亞基(AMPKα2)基因PRKAA2的多態(tài)性，并分析其多態(tài)性與200頭秦川牛生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性。【方法】 利用PCR-SSCP、DNA測(cè)序、飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)等技術(shù)，分析檢測(cè)4個(gè)品種牛PRKAA2基因6個(gè)外顯子的單核酸多態(tài)性(SNPs)；采用生物信息學(xué)方法結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析軟件，分析秦川牛各多態(tài)位點(diǎn)的遺傳變異特性與體尺及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)果】 PRKAA2基因第2、4、6、7、8、9外顯子中，只檢測(cè)到第4外顯子27 G>C和60 T>C 2個(gè)突變位點(diǎn)；關(guān)聯(lián)分析表明，27 G>C位點(diǎn)與秦川牛背膘厚和眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)；60 T>C位點(diǎn)與秦川牛體斜長(zhǎng)極顯著相關(guān)(P<0.01)，與體高、尻長(zhǎng)、腰角寬、坐骨端寬、眼肌面積顯著相關(guān)(P<0.05)?！窘Y(jié)論】 PRKAA2基因?qū)η卮ㄅ２糠煮w尺及肉質(zhì)性狀有極顯著或顯著影響，可作為秦川肉牛新品種早期選擇的候選基因和分子輔助標(biāo)記。

[關(guān)鍵詞]秦川牛；PRKAA2基因；單核酸多態(tài)性(SNPs)；體尺性狀；肉質(zhì)性狀

在動(dòng)物生產(chǎn)中，家畜自開始馴化就受到集中選擇，特別是關(guān)于生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、行為和對(duì)疾病的抵抗力等性狀[1]。近年來，隨著分子育種技術(shù)的成熟，標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection, MAS)方法已成為育種工作者對(duì)家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行標(biāo)記選擇進(jìn)而提高育種效率的有效途徑[2]。

哺乳動(dòng)物單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一個(gè)異源三聚體蛋白質(zhì)，其組成亞基有α、β、γ 3種[3-6]。已知的AMPK亞型包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3共7種。從理論上來講，α、β、γ的不同異構(gòu)型可形成多達(dá)12種組合[5-8]。AMPKα2亞單位的編碼基因?yàn)镻RKAA2，該基因主要在心臟、骨骼肌和肝臟中表達(dá)[9]，且大部分位于細(xì)胞核內(nèi)[10]。定位于核內(nèi)的PRKAA2可以通過部分磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[11-12]。

AMPKα2是參與AMPK激活的重要組成部分，是脂聯(lián)素抑制肝臟葡萄糖輸出的關(guān)鍵性靶點(diǎn)[13]，PRKAA2基因的缺陷或表達(dá)水平降低將直接影響AMPK的作用，從而導(dǎo)致高糖血癥及糖尿病的發(fā)生。Viollet等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2基因敲除小鼠(PRKAA2-/-)表現(xiàn)為明顯的高糖血癥和胰島素抵抗。Beall等[15]認(rèn)為活化的AMPKα2亞基可能通過上調(diào)線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的濃度來維持胰島β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性。Foretz等[16]和Viana等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠的肝臟中短期表達(dá)活化形式的AMPKα2可以引起輕微的低糖血癥，而在糖尿病小鼠模型中同樣的處理可使原有的高糖血癥有所緩解。

牛PRKAA2基因(GenBank登錄號(hào)：AC_000160)位于20號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)71 908 bp，包含8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子。目前，對(duì)該基因多態(tài)性的研究多集中在人上。Horikoshi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2多態(tài)性與日本人群胰島素抵抗和Ⅱ 型糖尿病有關(guān)。劉靖星[19]以甘肅蘭州人群為對(duì)象，研究了PRKAA2基因多態(tài)性與Ⅱ型糖尿病及脂聯(lián)素、抵抗素(Resistin)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組中均存在AMPK-rs2796516位點(diǎn)G/A基因突變，Ⅱ型糖尿病患者AMPK-rs2796516 G/A基因多態(tài)性與胰島素抵抗和血脂代謝明顯相關(guān)(P<0.05)。宋嬌等[20]在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2基因表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪(IMF)沉積顯著相關(guān)(P<0.05)，1日齡AA雞PRKAA2基因表達(dá)水平顯著高于56日齡(P<0.05)，IMF含量1日齡顯著高于56日齡(P<0.05)，PRKAA2基因表達(dá)與IMF含量呈正相關(guān)。高麗南[21]研究發(fā)現(xiàn)，西雜牛、利雜牛、夏雜牛PRKAA2基因第4外顯子55 513 bp處均發(fā)生了C>T突變，在第6外顯子 59 233 bp處發(fā)生了A>G突變，但關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3種肉牛PRKAA2基因第4外顯子和第6外顯子突變位點(diǎn)不同基因型與肉牛個(gè)體脂肪含量、體質(zhì)量、屠宰率等性狀均無顯著差異(P>0.05)。

本試驗(yàn)以秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛等4個(gè)牛品種作為研究對(duì)象，探究其PRKAA2基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并分析其多態(tài)性與秦川牛體尺和肉質(zhì)性狀是否相關(guān)，以期尋求該基因與秦川牛體尺和肉質(zhì)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，為肉牛新品種(系)的培育提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)默克公司；Tris飽和酚、EDTA、Tris、硼酸、甲醛、丙烯酰胺(Acrylamide)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰氨(Bis)、二甲基亞砜(DMSO)、N,N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、含染料Reaction MIX、DNA Marker、瓊脂糖等，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)和去離子甲酰氨，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))，冷凍高速離心機(jī)(CENTURION，英國(guó))，電泳槽、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、脫色搖床(六一儀器，北京)，Aquila Vet CE0344型獸用B超儀(Pie公司，荷蘭)。

1.2牛血樣的采集及其體尺和肉質(zhì)性狀的測(cè)量

從4個(gè)牛品種群體中隨機(jī)抽取個(gè)體，每頭牛頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(V(血液)∶V(ACD)=6∶1)，輕微顛倒混勻，-80 ℃保存?zhèn)溆?。共采取血液樣?30份，其中秦川牛364份，血樣采自陜西秦川牛業(yè)有限公司楊凌秦川肉牛良種繁育中心；南陽牛84份，血樣采自河南省南陽市南陽黃牛繁殖場(chǎng)；魯西牛102份，血樣采自山東魯西牛保種場(chǎng)；安格斯牛80份，血樣采自陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司眉縣繁育場(chǎng)。從秦川牛中選取飼養(yǎng)條件相同的24～30月齡健康育肥閹牛200頭，測(cè)量其8項(xiàng)體尺指標(biāo)(體斜長(zhǎng)、體高、腰高、尻長(zhǎng)、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬)，并采用B超儀測(cè)定3項(xiàng)肉質(zhì)指標(biāo)(背膘厚、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪)。

1.3血液DNA的提取及檢測(cè)

采用酚-氯仿法[22]從血樣中提取?；蚪MDNA，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。DNA無降解的用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量濃度，稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4牛PRKAA2基因外顯子的多態(tài)性檢測(cè)

1.4.1引物的設(shè)計(jì)與合成通過查閱NCBI上提供的牛PRKAA2基因序列(GenBank登錄號(hào)：AC_000160)，利用Primer 5.0軟件分別針對(duì)外顯子2、4、6、7、8、9設(shè)計(jì)P1、P2、P3、P4、P5、P6共6對(duì)特異性引物(見表1)，交由上海(生工)生物工程股份有限公司合成。

表 1　牛PRKAA2基因外顯子的引物設(shè)計(jì)Table 1　Primers of PRKAA2 gene in cattle

1.4.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)由15 μL體系組成：其中dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL、TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.15 μL、10×Buffer(含15 mmol/L Mg2+)的MIX 6.85 μL、5 μmol/L混合引物(上游引物和下游引物均為10 pmol/μL) 各0.3 μL、模板DNA (50 ng/μL) 1.0 μL、ddH2O 5.9 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收及純化使用DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，按照試劑盒具體說明進(jìn)行操作，純化產(chǎn)物送交上海(生工)生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.4.4PCR-SSCP分析取PCR產(chǎn)物5 μL與10 μL變性緩沖液( 按照去離子甲酰胺9.9 mL，5 mol/L EDTA 100 μL，二甲苯青0.012 5 g，溴酚藍(lán)0.012 5 g配制，調(diào)pH 為8.0)混合于PCR反應(yīng)管，98 ℃變性10 min，迅速將管插入冰水混合物中冰浴5～10 min，然后加樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中，先進(jìn)行15 min 250 V高壓電泳，再115 V電泳16 h。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用超純水漂洗 2～3 次，然后加0.1%硝酸銀溶液浸沒凝膠，在脫色搖床上染色10～15 min；棄染色液，超純水漂洗2～3次，加少量20 g/L NaOH與甲醛混合顯色液(500 mL 20 g/L NaOH溶液和5 mL甲醛)預(yù)顯色30 s，棄顯色液，然后再加新鮮顯色液至凝膠浸沒，搖動(dòng)直至顯現(xiàn)清晰條帶為止。

1.4.5飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)選取質(zhì)量和質(zhì)量濃度(20～50 ng/μL)均符合 MALDI-TOF飛行質(zhì)譜要求的DNA，與針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物(每個(gè)待測(cè)位點(diǎn)處設(shè)計(jì)3條特異性引物，其中2條用于 PCR擴(kuò)增，1條用于延伸)一起，送上海(生工)生物工程股份有限公司進(jìn)行MALDI-TOF分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用遺傳多樣性分析軟件(Genpop 32)統(tǒng)計(jì)各突變位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率，同時(shí)計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和遺傳純合度(Ho)[23-24]。其中，PIC>0.5說明該突變位點(diǎn)處于高度多態(tài)；0.25

2結(jié)果與分析

2.1PRKAA2基因外顯子2、6、7、8多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)

2.1.1PRKAA2基因外顯子2、6、7、8 PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)4品種牛PRKAA2基因的外顯子 2、6、7、8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度一致，條帶清晰特異性好(以秦川牛為例的結(jié)果見圖1)，可直接進(jìn)行SSCP 檢測(cè)。

圖 1　秦川牛PRKAA2基因外顯子 2、6、7、8的PCR擴(kuò)增結(jié)果 A.外顯子2;B.外顯子6;C.外顯子7;D.外顯子8；M.DNA Marker DL 2000；1～5.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1　Amplified products of PRKAA2 exon 2,exon 6,exon 7 and exon 8 in Qinchuan cattle A.Exon 2;B.Exon 6;C.Exon 7;D.Exon 8；M.DNA Marker DL 2000；1-5.Products of PCR

2.1.2PRKAA2基因外顯子2、6、7、8 的PCR-SSCP分析4品種牛PRKAA2基因外顯子 2、6、7、8的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測(cè)，結(jié)果(以秦川牛為例的結(jié)果見圖2)在各牛群中均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)。

圖 2　秦川牛PRKAA2基因外顯子 2、6、7、8 的PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果 A.外顯子2;B.外顯子6;C.外顯子7;D.外顯子8Fig.2　PCR-SSCP detection of PRKAA2 exon 2,exon 6,exon 7 and exon 8 in Qinchuan cattle A.Exon 2;B.Exon 6;C.Exon 7;D.Exon 8

2.2PRKAA2基因外顯子4、9的多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)

2.2.1PRKAA2基因外顯子4、9 的PCR擴(kuò)增及突變位點(diǎn)檢測(cè)秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛4個(gè)群體中每個(gè)群體隨機(jī)挑選10頭個(gè)體的DNA樣品，分別對(duì)其PRKAA2基因的外顯子4、9進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度一致，條帶清晰、特異性好(以秦川牛為例的結(jié)果見圖3)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后，送上海(生工)生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNA STAR比對(duì)，在PRKAA2基因外顯子 4上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)潛在的多態(tài)位點(diǎn)，分別是第27位顛換G>C和第60位轉(zhuǎn)換T>C。將這2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分別命名為27 G>C、60 T>C。而在第9外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。經(jīng)分析，外顯子 4上的27 G>C、60 T>C突變均未引起氨基酸的變化，屬同義突變。27 G>C位點(diǎn)測(cè)序得到GG、GC 2種基因型(以秦川牛為例的結(jié)果見圖4)，60 T>C位點(diǎn)測(cè)序得到TT、TC 2種基因型(以秦川牛為例的結(jié)果見圖5)。

圖 3　秦川牛PRKAA2 外顯子4、9 PCR擴(kuò)增結(jié)果 A.外顯子4;B.外顯子9；M.DNA Marker DL 2000；1～6.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3　Amplified products of PRKAA2 exon 4 and exon 9 in Qinchuan cattle A.Exon 4;B.Exon 9；M.DNA Marker DL 2000；1-6.Products of PCR

圖 4　秦川牛PRKAA2基因外顯子4第27位點(diǎn)GG、GC基因型測(cè)序圖(部分結(jié)果)Fig.4　Sequencing results of genotype GG and GC in PRKAA2-exon 4 at the 27th locus in Qinchuan cattle(Partial result)

圖 5　秦川牛PRKAA2基因外顯子4第60位點(diǎn)TT、TC基因型測(cè)序圖(部分結(jié)果)Fig.5　Sequencing results of genotype TT and TC in PRKAA2-exon 4 at the 60th site in Qinchuan cattle(Partial result)

2.2.2PRKAA2基因外顯子4多態(tài)位點(diǎn)飛行質(zhì)譜分型檢測(cè)及驗(yàn)證因PRKAA2基因第4外顯子2個(gè)潛在突變位點(diǎn)距離太近，依靠PCR-SSCP等常規(guī)電泳試驗(yàn)技術(shù)難以分型，故采用飛行質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的基因分型檢測(cè)。

(1)PRKAA2基因外顯子4多態(tài)位點(diǎn)飛行質(zhì)譜檢測(cè)引物設(shè)計(jì)。對(duì)第4外顯子27 G>C和60 T>C突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異性引物(見表2)。

(2)質(zhì)譜分型驗(yàn)證及檢測(cè)結(jié)果。飛行質(zhì)譜結(jié)果除檢測(cè)到27 G>C和60 T>C突變位點(diǎn)通過測(cè)序確定的2種基因型外，還檢測(cè)到2個(gè)位點(diǎn)測(cè)序沒有發(fā)現(xiàn)的第3種基因型，即CC基因型，因此，飛行質(zhì)譜法得到27 G>C和60 T>C 2個(gè)位點(diǎn)全部基因型(圖6)。

表 2　牛PRKAA2基因外顯子4多態(tài)位點(diǎn)飛行質(zhì)譜引物設(shè)計(jì)Table 2　MALDI-TOF primer sequences of PRKAA2 gene exon 4 in cattle

圖 6　秦川牛PRKAA2基因第4外顯子多態(tài)位點(diǎn)飛行質(zhì)譜圖 A2-1為27 G>C位點(diǎn)；A2-2為60 T>C位點(diǎn)Fig.6　MALDI-TOF maps of SNPs of Qinchuan cattle PRKAA2 gene exon 4 A2-1 is 27 G>C locus and A2-2 is 60 T>C locus

2.3PRKAA2基因外顯子4 SNP位點(diǎn)遺傳多態(tài)性分析

2.3.1等位基因頻率、基因型頻率及H-W檢驗(yàn)PRKAA2基因第4外顯子 2個(gè)SNPs 的基因型頻率和等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3和表4。從表3和表4可以看出，2個(gè)SNPs 在4個(gè)牛群體中均以普通純合基因型頻率最高，其次為雜合基因型，突變型最低，說明這2個(gè)位點(diǎn)普通純合型為優(yōu)勢(shì)基因型。

表 3　PRKAA2基因第4外顯子 27 G>C SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因頻率Table 3　Genotypic and allelic frequencies for 27 G>C locus in exon 4 of PRKAA2 gene

注：括號(hào)中的數(shù)據(jù)為觀測(cè)個(gè)體數(shù)。表4同。

Note：Data in brackets are the number of observations.The same for Table 4.

表 4　PRKAA2基因第4外顯子60 T>C SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因頻率Table 4　Genotypic and allelic frequencies for 60 T>C locus in exon 4 of PRKAA2 gene

2.3.22個(gè)SNPs 位點(diǎn)在群體中的遺傳特性分析PRKAA2基因外顯子4中2個(gè)SNPs 在群體中的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、PIC分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。由表5可以看出，試驗(yàn)牛群在2個(gè)位點(diǎn)的群體基因雜合度在0.304 7～0.397 7，有效等位基因數(shù)在1.438 2～1.660 2，PIC為0.258 3～0.318 6，均介于0.25～0.50，表明4個(gè)牛群體在這2個(gè)位點(diǎn)均處于中度多態(tài)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，秦川牛、南陽牛、魯西牛、安格斯牛在27 G>C和60 T>C 2個(gè)位點(diǎn)的χ2值均小于5.991，說明4個(gè)牛群體在這2個(gè)位點(diǎn)均處于H-W平衡狀態(tài)(P>0.05)。從總?cè)后w來看，4個(gè)牛群體在這2個(gè)位點(diǎn)均處于 H-W平衡狀態(tài)。

表 5　PRKAA2基因外顯子4中2個(gè)SNPs位點(diǎn)在各群體中的遺傳特性Table 5　Genetic indices of 2 SNPs for PRKAA2 gene exon 4 in every population

2.4秦川牛PRKAA2基因外顯子4多態(tài)性與體尺和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析考慮場(chǎng)地、年齡和基因型的效應(yīng)，利用 SPSS 軟件的 GLM 模型分析秦川牛PRKAA2基因多態(tài)性與其體尺性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果(表6)顯示，PRKAA2基因第4外顯子27 G>C多態(tài)位點(diǎn)與秦川牛8項(xiàng)體尺性狀指標(biāo)未達(dá)到顯著相關(guān)(P>0.05)。60 T>C多態(tài)位點(diǎn)與秦川牛體斜長(zhǎng)極顯著相關(guān)(P<0.01)，與體高、尻長(zhǎng)、腰角寬、坐骨端寬顯著相關(guān)(P<0.05)。具體表現(xiàn)為體斜長(zhǎng)性狀上，CC基因型個(gè)體極顯著高于TC和TT基因型個(gè)體(P<0.01)，TC、TT基因型個(gè)體之間差異不顯著(P>0.05)；在尻長(zhǎng)、腰角寬、坐骨端寬3項(xiàng)體尺性狀指標(biāo)上，均是CC基因型個(gè)體顯著高于TC和TT基因型個(gè)體(P<0.05)，TC與TT基因型個(gè)體之間差異不顯著。

表 6　PRKAA2基因外顯子4中2個(gè)SNPs位點(diǎn)與秦川牛體尺性狀的關(guān)聯(lián)性Table 6　Association of 2 SNPs locus for exon 4 of PRKAA2 gene with growth traits in Qinchuan cattle 　cm

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Data with a different superscript capital letters in one column differ significantly at the level of 0.01,small letters at the level of 0.05.The following table is same.

2.4.2與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析利用 SPSS軟件的 GLM 模型分析秦川牛PRKAA2基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果(表7)顯示，PRKAA2基因外顯子4上27 G>C與背膘厚和眼肌面積2項(xiàng)指標(biāo)顯著相關(guān)，GG、GC基因型顯著大于CC基因型(P<0.05)；60 T>C位點(diǎn)與秦川牛眼肌面積顯著相關(guān)，CC基因型顯著大于TC基因型(P<0.05)，CC與TT、TT與TC基因型之間差異不顯著(P>0.05)。

表 7　PRKAA2基因外顯子4中2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與秦川牛肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性Table 7　Association of 2 SNP locus for exon 4 of PRKAA2 gene with meat quality traits in Qinchuan cattle

3討論與結(jié)論

在真核生物中，AMPK是一個(gè)重要的蛋白激酶，是哺乳動(dòng)物激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心組成部分，主要協(xié)調(diào)能量代謝的需要，通過阻斷三磷酸腺苷(ATP)消耗和促進(jìn)ATP再生的生物合成途徑來防止哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝應(yīng)激，故有“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”之稱[4-7,25]。

本研究在秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛4個(gè)品種肉牛PRKAA2基因第2、6、7、8、9外顯子未檢測(cè)到突變位點(diǎn)，只在第4外顯子中均發(fā)現(xiàn)了27 G>C和60 T>C 2個(gè)突變，且均未引起相應(yīng)氨基酸的變化，屬于同義突變。同義SNP是進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境壓力的適應(yīng)和自然選擇而形成的“密碼子使用偏好”在基因組中的遺跡，有研究表明它能通過影響翻譯效率[26]、mRNA的穩(wěn)定性[27]和拼接控制來調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)[28]，或者由于密碼子替換導(dǎo)致翻譯速度發(fā)生改變，進(jìn)而通過影響蛋白折疊的動(dòng)力學(xué)控制使蛋白質(zhì)無法完成正確的折疊[29]。因此，同義突變從某種方面也能影響基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響個(gè)體表型性狀。

在4個(gè)牛群體中，27 G>C、60 T>C 2個(gè)突變位點(diǎn)均以普通純合基因型頻率最高，突變型頻率最低，2個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率表現(xiàn)同一趨勢(shì)，均是 G>C、T>C。對(duì)該基因的研究，單從檢測(cè)得到的SNP數(shù)量與Zhang 等[30]的研究結(jié)果比較，本研究只在第4外顯子檢測(cè)到2個(gè)SNPs，與Zhang等[30]在PRKAA2基因掃描的外顯子區(qū)域不同。

關(guān)聯(lián)分析顯示，27 G>C位點(diǎn)與秦川牛背膘厚和眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，60 T>C位點(diǎn)與秦川牛體斜長(zhǎng)極顯著相關(guān)(P<0.01)，與體高、尻長(zhǎng)、腰角寬、坐骨端寬、眼肌面積顯著相關(guān)。本研究的部分結(jié)果與Lin 等[31]在豬上得到的結(jié)果相一致，但與高麗南[21]在牛上報(bào)道的結(jié)果有較大差異，這可能與試驗(yàn)牛品種差異有一定關(guān)系。

由本研究結(jié)果可知，PRKAA2基因可作為秦川牛標(biāo)記輔助育種的候選基因，為秦川肉牛應(yīng)用生物技術(shù)育種提供了新的思路和手段。然而因牛屠宰成本太高，本研究分析的數(shù)據(jù)和肉質(zhì)性狀相對(duì)偏少，還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量對(duì)其他肉質(zhì)性狀進(jìn)行分析，并在細(xì)胞水平更深層次研究該基因功能及其相關(guān)調(diào)控機(jī)理。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.001

[收稿日期]2014-12-05

[基金項(xiàng)目]國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102505)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272411)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007C127)；陜西省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011K01-09)

[作者簡(jiǎn)介]田萬強(qiáng)(1969-),男,陜西扶風(fēng)人,副教授，博士，主要從事家畜遺傳育種與繁殖研究。E-mail:twqiang2003@163.com [通信作者]昝林森(1963-)，男，陜西扶風(fēng)人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種及生殖生理調(diào)控研究。 E-mail:zanlinsen@163.com

[中圖分類號(hào)]S823.9+2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)07-0001-09

SNPs of bovinePRKAA2 gene and its association with growth and meat quality traits

TIAN Wanqiang1,2,MEI Chugang2,FU Changzhen2,XIN Yaping2,ZHANG Song2,WANG Guoqing2,ZAN Linsen2,3

(1AnimalEngineeringDepartment,YanglingVocational&TechnicalCollege,Yangling,Shaanxi712100,China;2CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;3NationalBeefCattleImprovementCenter,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 Polymorphism of PRKAA2 gene on 630 individuals from four cattle breeds (Qinchuan,Nanyang,Luxi and Angus) was detected to analyze its genetic structures and varieties.The association of different genotypes with growth and meat quality traits of 200 Qinchuan cattle was also analyzed. 【Method】 SNPs located in exon 2,exon 4,exon6,exon 7,exon 8 and exon 9 were detected in PRKAA2 gene of four cattle breeds by PCR-SSCP,random DNA sequencing method and MALDI-TOF technology.Genetic variation of SNPs and the association of different genotypes with growth and meat quality traits of Qinchuan cattle were also analyzed by bioinformatics method and SPSS software.【Result】 Two SNPs (27 G>C and 60 T>C) located in only exon 4 were detected in 6 exons of PRKAA2 gene.The 27 G>C SNP was associated with back fat thickness (BF) and loin muscle area (LMA) (P<0.05) significantly.The 60 T>C SNP was associated with body length (BL) (P<0.01) extremely significantly,and with withers height (WH),rump length (RL),hip width (HW),pin bone width (PBW) and LMA (P<0.05) significantly.【Conclusion】 PRKAA2 gene had potential effects on growth and meat quality traits of Qinchuan cattle and could be used for candidate gene and marker-assisted selection (MAS) in early selection of new varieties of Qinchuan cattle.

Key words：Qinchuan cattle;PRKAA2 gene,SNPs;growth traits;meat quality traits

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