龍　添，樓一層，張　浩

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430070)

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化夏枯草中迷迭香酸的超聲提取工藝

龍?zhí)?，樓一層，張?/p>

(武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430070)

[摘要]【目的】 采用響應(yīng)曲面法建立Box-Behnken模型，優(yōu)化夏枯草中迷迭香酸的超聲提取工藝?！痉椒ā?以料(g)液(mL)比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%，50%，60%，70%，80%，90%)、提取時(shí)間(10，20，30，40，50，60 min)為考察因素，迷迭香酸提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平響應(yīng)曲面法分析，確定夏枯草中迷迭香酸的最優(yōu)提取工藝?！窘Y(jié)果】 夏枯草中迷迭香酸最佳提取工藝參數(shù)為：料(g)液(mL)比1∶28，乙醇體積分?jǐn)?shù)74%，提取時(shí)間55 min，在該工藝參數(shù)條件下，迷迭香酸提取率達(dá)0.52%，與預(yù)測值0.54%偏差較小，說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取夏枯草中迷迭香酸工藝的參數(shù)準(zhǔn)確可靠。【結(jié)論】 得到了夏枯草中迷迭香酸提取的優(yōu)化條件，本研究所用方法具有可行性和實(shí)用性。

[關(guān)鍵詞]夏枯草；超聲提?。幻缘闼?；響應(yīng)曲面法

夏枯草(Prunellavulgaris)又稱棒槌草、鐵色草、大頭花、夏枯頭，為唇形科植物，夏枯草的干燥果穗有清火、明目、散結(jié)、消腫之功效，用于治療目赤腫痛、眼珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳房腫痛及甲狀腺腫大、淋巴結(jié)結(jié)核、乳腺增生和高血壓[1]。

復(fù)方夏枯草為武漢市東湖醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的協(xié)定處方藥，具有較好的降血壓效果，常用于治療肝陽上亢型高血壓[2]。迷迭香酸作為夏枯草中主要活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗血栓、抑制黃嘌呤氧化酶、保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞等作用[3]。因此，對夏枯草中迷迭香酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，可以為夏枯草的進(jìn)一步利用提供基礎(chǔ)。目前，對于夏枯草中迷迭香酸的提取工藝研究，基本都是采用普通正交試驗(yàn)。雖然這種方法也考慮了多種因素的影響，但是不能很好地得出回歸模型[4-5]。而曲面優(yōu)化法(Response surface methodology，RSM)采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，可以研究因子與響應(yīng)值及因子與因子之間的相互關(guān)系，是省時(shí)省力的一種研究方法[6-7]。

基于此，本研究將響應(yīng)曲面法應(yīng)用于夏枯草中迷迭香酸的超聲提取工藝優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步綜合分析影響迷迭香酸超聲提取率的關(guān)鍵因子，并對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定最優(yōu)工藝參數(shù)，從而提高夏枯草中迷迭香酸的超聲提取率。

1材料與方法

1.1材料

夏枯草藥材購自安徽亳州中藥材公司，經(jīng)華中科技大學(xué)藥學(xué)院陳家春教授鑒定為正品。

1.2儀器與試劑

Waters 1525 Binary HPLC pump、Waters 2998 photodiode Array Detector(美國waters公司)，AT20型分析天平(十萬分之一)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮科技有限公司)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇、乙醇為色譜純(Tedia公司，美國)，制樣所用試劑均為分析純，液相用水為三蒸水，迷迭香酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111871-201203)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件ZORBAX-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長330 nm，柱溫：30 ℃，流動相：甲醇/體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸溶液(體積比45∶55)，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2對照品溶液的制備精密稱取迷迭香酸對照品5.0 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得每mL含迷迭香酸0.1 mg的對照品溶液。

1.3.3供試品溶液的制備精密稱取夏枯草藥材粉末1.00 g，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，常溫浸泡15 min，采用超聲波法進(jìn)行提取后過濾，收集濾液，再用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得到夏枯草藥材中迷迭香酸供試品溶液。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為10,20,40,60,80,100 μg/mL迷迭香酸溶液。用高效液相色譜法測定其峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，迷迭香酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為:y=0.380 02x+0.417 31,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9，迷迭香酸質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL，峰面積與迷迭香酸質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系(圖1)。

圖 1　迷迭香酸對照品質(zhì)量濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of mass concentration and peak area of rosemary acid

1.3.5迷迭香酸提取率的測定根據(jù)1.3.3節(jié)過濾所得濾液的體積(V)，精密量取一定量的濾液進(jìn)行稀釋，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程測定濾液中迷迭香酸的質(zhì)量濃度(c)，計(jì)算迷迭香酸提取率[8]。

式中：c為迷迭香酸質(zhì)量濃度，n為濾液稀釋倍數(shù)，V為濾液體積，m為供試夏枯草粉末質(zhì)量。

1.4迷迭香酸提取的單因素試驗(yàn)

以迷迭香酸提取率為考察指標(biāo)，取夏枯草粉末6份，每份1.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，按1.3.5節(jié)中方法進(jìn)行測定,選擇料(g)液(mL)比(x1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(x2)和超聲時(shí)間(x3)3個因素，考察其對迷迭香酸提取率的影響，確定最佳提取工藝條件。

料(g)液(mL)比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60；乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%；超聲時(shí)間為10，20，30，40，50，60 min；固定因素為：料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時(shí)間30 min。

1.5迷迭香酸提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用3因素3水平響應(yīng)曲面法，分析并優(yōu)化夏枯草中迷迭香酸的超聲提取工藝。以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間為自變量(表1)，設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，每次均精密稱取1.00 g夏枯草粉末，對提取物進(jìn)行迷迭香酸含量測定，計(jì)算其提取率。

表 1　夏枯草中迷迭香酸提取工藝響應(yīng)曲面優(yōu)化的試驗(yàn)方案Table 1　Optimization plan for rosmarinic acid extraction from Prunella vulgaris

2結(jié)果與分析

2.1夏枯草中迷迭香酸提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比的影響圖2表明，其他條件不變時(shí)，改變提取條件中的料液比，夏枯草迷迭香酸的提取率先呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，提取率達(dá)最高值；之后隨著料液比的增大，迷迭香酸提取率有下降趨勢。因此，提取迷迭香酸時(shí)料液比為 1∶30 左右較為合適。

圖 2　料(g)液(mL)比對夏枯草中迷迭香酸 提取率的影響Fig.2　Effects of solid liquid ratio on extraction rate of rosmarinic acid from Prunella vulgaris

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響圖3表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，夏枯草中迷迭香酸的提取率快速增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率達(dá)最大值；之后當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，迷迭香酸的提取率反而略有下降。故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%左右比較合適。

2.1.3超聲時(shí)間的影響圖4表明，隨著超聲提取時(shí)間的逐漸延長，夏枯草中迷迭香酸的提取率不斷增大，當(dāng)超聲提取時(shí)間為50 min時(shí)，提取率達(dá)最大值，隨后再延長超聲提取時(shí)間，迷迭香酸的提取率反而略有下降。故選取超聲提取時(shí)間為50 min左右較為合適。

圖 3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對夏枯草中迷迭香酸 提取率的影響Fig.3　Effects of ethanol concentration on extraction rate of rosmarinic acid from Prunella vulgaris

圖 4　超聲時(shí)間對夏枯草中迷迭香酸 提取率的影響Fig.4　Effects of ultrasonic time on extraction rate of rosmarinic acid from Prunella vulgaris

2.2夏枯草中迷迭香酸提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，超聲提取夏枯草中迷迭香酸的提取率結(jié)果見表2。

表 2　夏枯草中迷迭香酸提取的響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Optimization of rosmarinic acid extraction from Prunella vulgaris by response surface method

表 3　夏枯草中迷迭香酸提取回歸方程系數(shù)的方差分析Table 3　Optimization of rosmarinic acid extraction from Prunella vulgaris by response surface method

注：“*”表示在0.05水平顯著；“**”表示在0.01水平顯著。

Note:“*” means significant at 0.05 level;“**” means significant at 0.01 level.

2.2.2響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化根據(jù)二次回歸方程繪制響應(yīng)曲面的三維曲線，得到2個因素交互作用對響應(yīng)值(迷迭香酸提取率y)的影響，結(jié)果見圖5-7。

比較圖5-7與表3可以看出，各因素對夏枯草迷迭香酸提取率的影響由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)(x2)>提取時(shí)間(x3)>料液比(x1)，提取所用的乙醇體積分?jǐn)?shù)對迷迭香酸的提取率具有極顯著的影響(P<0.000 1)；而在這3個因素中，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間之間的交互作用對響應(yīng)值的影響比料液比和提取時(shí)間及料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用大，即x2x3>x1x3>x1x2，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間之間的交互作用對迷迭香酸的提取率具有顯著影響(P<0.05)。

圖 5　料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對夏枯草 迷迭香酸提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5　Response surface on effects of material to liquid ratio and ethanol volume fraction on rosmarinic acid extraction rate圖 6　料液比和超聲提取時(shí)間對夏枯草 迷迭香酸提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6　Response surface on effects of material to liquid ratio and extraction time on rosmarinic acid extraction rate

圖 7乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取時(shí)間對夏枯草迷迭香酸提取率影響的響應(yīng)曲面圖

Fig.7Response surface on effects of volume fraction of ethanol and ultrasonic time on rosmarinic acid extraction rate

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert V 8.0.6軟件對方程中的響應(yīng)值(y)進(jìn)行求解，得到夏枯草中迷迭香酸提取的理論最佳工藝條件為：料液比1∶28.34，乙醇體積分?jǐn)?shù)74.04%，提取時(shí)間55.33 min，在此條件下迷迭香酸的提取率可達(dá)0.54%。考慮到操作的可行性，將最佳工藝條件修正為：料液比1∶28，乙醇體積分?jǐn)?shù)74%，提取時(shí)間55 min，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測得迷迭香酸的平均提取率為 0.52%，與預(yù)測值的相對誤差為2.57%，偏差較小，說明響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲提取夏枯草中迷迭香酸工藝的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面分析法對超聲提取夏枯草中迷迭香酸的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到夏枯草中迷迭香酸的最佳提取工藝條件為：料液比1∶28，乙醇體積分?jǐn)?shù)74%，提取時(shí)間55 min，在此條件下夏枯草中迷迭香酸的提取率為0.52%，與預(yù)測值(0.54%)偏差較小，可以為實(shí)踐所用。該工藝為夏枯草的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了依據(jù)。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.029

[收稿日期]2014-12-31

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173509)；湖北省公益科技研究項(xiàng)目(20121g0186)

[作者簡介]龍?zhí)?1988-)，男，廣東湛江人，在讀碩士，主要從事植物藥學(xué)及中藥活性成分研究。 [通信作者]樓一層(1960-)，男，湖北武漢人，教授，主要從事中藥活性成分的篩選及制劑研究。

[中圖分類號]R284.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0209-06

Optimization of ultrasonic-assisted extraction of rosmarinic acid fromPrunellavulgarisby response surface method

LONG Tian,LOU Yiceng，ZHANG Hao

(SchoolofChemicalEngineeringandLifeSciences,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan，Hubei430070，China)

Abstract:【Objective】 Ultrasonic-assisted extraction of rosmarinic acid from Prunella vulgaris was optimized using response surface method and Box-Behnken model. 【Method】 Solid liquid ratio (g/mL) (1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50,and 1∶60),ethanol volume fraction (40%,50%,60%,70%,80%,and 90%),and extraction time (10,20,30,40,50,and 60 min) were tested to select optimal extraction conditions for rosmarinic acid from Prunella vulgaris.【Result】 The optimum extraction parameters were:solid liquid ratio 1∶28 (g/mL),ethanol volume fraction 74%,extraction time 55 min,and the extraction rate was 0.52%,which was very close to the predicted value of 0.54%.The surface response optimization of rosmarinic acid ultrasonic extraction from Prunella vulgaris was accurate and reliable.【Conclusion】 Optimal extraction conditions for rosmarinic acid from Prunella vulgaris were obtained and the method was feasible and practical.

Key words:Prunella vulgaris;ultrasonic extraction;rosmarinic acid;response surface method

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.058.html