張文明 鄧紅敏 張媛媛 黃云梅 黃美雅 林燕萍*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350108 2.河南省林州市中醫(yī)院，安陽(yáng) 456550 3.江西省新余市中醫(yī)院，新余 338000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)的一種類型，因骨密度下降、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加[1]，PMOP骨折率約為正常人的4倍[2]。研究該病的發(fā)病機(jī)制以及治療藥物，越來(lái)越受到人們的重視。以往PMOP的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)方法只有組織形態(tài)學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)等，隨著影像學(xué)的進(jìn)步，能更為準(zhǔn)確、高效反映骨組織結(jié)構(gòu)的顯微CT(microCT)，越來(lái)越多地應(yīng)運(yùn)于PMOP的研究中。本文將這一新的體視學(xué)檢測(cè)方法運(yùn)用于中藥藥物治療評(píng)價(jià)中，為PMOP的藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

4周齡C57雌性小鼠，清潔級(jí)，20 g±2 g，30只，中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。

1.2 藥物

健骨顆粒，由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥物組成，原藥材統(tǒng)一由福建省藥材公司提供，福建中醫(yī)藥研究院中試車間加工制備，每克顆粒含原生藥2.9 g。健骨顆粒小鼠灌胃劑量為2 g/(kg·d)(每只小鼠每天灌胃藥以生理鹽水0.5 ml溶解，1次/d)。

1.3 儀器

microCT(ZKKS-MCT-Sharp-I,廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司)；萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(IG-A1000N型，日本島津公司)。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物造模及藥物干預(yù)：在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后其隨機(jī)分成分為三組(假手術(shù)一組10只、去卵巢兩組各10只)，采用卵巢切除法建立PMOP小鼠模型：卵巢切除小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥麻醉(給藥濃度為40 mg/kg)，腹位固定，備皮，3%碘伏消毒，背部中下部肋緣下1 cm與脊柱旁開(kāi)1 cm交界處行0.5 cm縱行切口，結(jié)扎輸卵管和血管，將卵巢完整切除，逐層關(guān)閉切口。假手術(shù)組只切除卵巢周圍脂肪，不切除卵巢。術(shù)后3 d青霉素(20×104IU/kg)常規(guī)腹腔注射預(yù)防感染。兩組去卵巢小鼠手術(shù)1周后，按照人(臨床健骨顆粒成人常規(guī)給藥劑量為3 g/次,3次/d。每克顆粒含原生藥2.9 g)與動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量換算公式計(jì)算出小鼠的給藥劑量，分別灌服健骨顆粒2 g/kg/d(以生理鹽水0.5 ml溶解)和生理鹽水0.5 ml/d；假手術(shù)組用生理鹽水0.5 ml/d灌胃,連續(xù)2個(gè)月。

1.4.2檢測(cè)方法及觀察指標(biāo)

1.4.2.1骨組織微結(jié)構(gòu)體視學(xué):三組小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取出每只小鼠左脛骨，固定在microCT載物臺(tái)上對(duì)脛骨近端進(jìn)行掃描。以 360°掃描角度、10 μm 的掃描分辨率沿小鼠脛骨長(zhǎng)軸方向掃描脛骨近端, 獲取連續(xù)的平面μCT 圖像。掃描完成后在主機(jī)上選出生長(zhǎng)板下1 mm和脛骨近端1.5 mm的區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)域(range of interests ROI)，進(jìn)行骨小梁三維圖像重建，利用機(jī)載軟件分析，主要檢測(cè)參數(shù)如下：骨密度參數(shù)—骨礦物質(zhì)含量BMC(Bone Mineral Content)、骨密度或骨礦物質(zhì)密度BMD(Bone Mineral Density,BMD)、組織礦物含量TMC(Tissue Mineral Content)、組織礦物質(zhì)密度TMD(Tissue Mineral Density)、骨表面積BS(Bone Surface)、骨體積BV(Bone Volume)；骨結(jié)構(gòu)參數(shù)—骨表面積和骨體積的比值BS/BV、骨表面積和組織體積的比值BS/TV、選取ROI體積TV(Total Volume)、相對(duì)骨體積或骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV、骨小梁數(shù)量Tb.N(Trabecular Number)、骨小梁分離度Tb.Sp(trabecular Separation/apacing)、骨小梁厚度Tb.Th(Trabecular Thickness)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI(Structure Model index)、各向異性程度DA(Degree of Anisotropy)。

1.4.2.2骨生物力學(xué):三組小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取出每只小鼠右脛骨，在萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)上完成三點(diǎn)抗壓最大載荷檢測(cè)(單位：kN)。小鼠脛骨跨距為30 mm，萬(wàn)能材料機(jī)應(yīng)力加載速率為0.5 mm/min，至脛骨折斷瞬間電腦自動(dòng)采集到三點(diǎn)抗壓最大載荷。每組采集10只小鼠右側(cè)脛骨最大抗彎載荷，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 microCT骨量及骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

骨量參數(shù)(表1)：與假手術(shù)組比較，去卵巢組BMC、BMD、Mean、BV、BS指標(biāo)顯著下降(P<0.01),TMC下降(0.010.05)。與假手術(shù)組相比，去卵巢組中藥組BV/TV、BS/TV、Tb.N指標(biāo)下降，Tb.Sp指標(biāo)提高。

組別nMean(1)S.D(1)BV(mm3)BS(mm2)BMC(g)TMC(g)BMD(mg/cm3)TMD(mg/cm3)假手術(shù)組10236±23.0▲▲135±11.00.05±0.006▲ 2.53±0.26▲0.07±0.007▲▲0.25±0.004236±23.0 ▲▲493±29.0去卵巢組1068.9±10.8##126±9.64 0.02±0.004##1.37±0.15##0.02±0.003##0.01±0.002#68.9±10.8##432±11.8去卵巢中藥組10141±18.1△△120±11.10.03±0.0041.67±0.170.04±0.005△△ 0.01±0.002141±18.1△△436±14.3

注：與中藥組比較，▲0.05>P>0.01,▲▲P<0.01; 與假手術(shù)組比較，#0.05>P>0.01，##<0.01；與去卵巢組比較，△0.05>P>0.01,△△P<0.01

組別nBV/TV (%)BS/BV(1/mm)BS/TV(1/mm)Tb.N (1/mm)Tb.Sp(μm)Tb.Th(μm)SMI(1)DA(1)假手術(shù)組1016.2±2.12▲52.7±2.048.40±0.86▲4.20±0.43▲213±57.0▲38.3±1.461.74±0.120.83±0.04去卵巢組107.57±1.22##62.7±4.294.53±0.51##2.27±0.25##440±57.0##32.8±2.602.22±0.11#0.73±0.04去卵巢中藥組1010.1±1.2555.8±3.105.53±0.572.76±0.28346±41.236.4±1.982.02±0.100.77±0.02

注：與中藥組比較，▲0.05>P>0.01,▲▲P<0.01;與假手術(shù)組比較，#0.05>P>0.01，##<0.01

2.2 microCT二維/三維圖像

去卵巢組較假手術(shù)組骨小梁數(shù)量明顯減少，稀疏、斷裂，形態(tài)細(xì)小、不連續(xù)呈扭曲或斷裂狀等，靠近生長(zhǎng)板的初級(jí)和次級(jí)網(wǎng)狀骨小梁幾乎消失(圖1、2)，骨皮質(zhì)薄，骨髓腔增大(圖3、4)。去卵巢中藥組與去卵巢組比較，骨小梁數(shù)量、寬度、長(zhǎng)度、形態(tài)和分布部分恢復(fù)、密度和聯(lián)結(jié)性增加，但還不能恢復(fù)到假手術(shù)組水平(圖1、2)，中藥干預(yù)后皮質(zhì)骨面積增加，骨髓腔縮小，基本恢復(fù)到假手術(shù)組水平(圖3、4)。

圖1 各組小鼠脛骨上段microCT X-Y三維圖(上排)、三維剖面圖(下排)。(從左向右為：假手術(shù)組，去卵巢中藥干預(yù)組，去卵巢組，下同)Fig.1 Micro CT X-Y 3-dimensional image of mouse tibia (upper row), cross-section image (lower row).From left to right: sham group, OVX intervention group, OVX group, the same below)

圖2 小鼠脛骨上段microCT X-Y剖面二維圖Fig.2 Micro CT X-Y 2-dimensional image of mouse tibia

圖3 小鼠脛骨上段microCT Y-Z三維圖(上排)、剖面二維圖(下排)Fig.3 Micro CT X-Y 3-dimensional image of mouse tibia (upper row), cross-section image (lower row)

圖4 小鼠脛骨上段microCT X-Z三維圖(上排)，剖面二維圖(下排)Fig.4 Micro CT X-Y 3-dimensional image of mouse tibia (upper row), cross-section image (lower row).

2.3 骨生物力學(xué)三點(diǎn)抗壓最大載荷

小鼠右脛骨三點(diǎn)抗壓最大載荷(單位：N)假手術(shù)組與去卵巢組、假手術(shù)組與去卵巢中藥組相比均有顯著差異(P<0.01)，去卵巢中藥干預(yù)組與去卵巢組相比有差異(0.01

圖5 各組小鼠右脛骨三點(diǎn)抗壓試驗(yàn)最大載荷(單位：kN):假手術(shù)組與去卵巢組、去卵巢中藥組相比P<0.01，去卵巢中藥干預(yù)組與去卵巢組相比Fig.5 Three-point maximum load test of mouse right tibia (unit: kN).Sham group VS OVX group, P<0.01; OVX intervention group VS OVX group, 0.01

3 討論

3.1 PMOP小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

嚙齒目動(dòng)物(rodents)是PMOP模型最常用的動(dòng)物，大鼠模型研究基本成熟[3],更多運(yùn)用于骨結(jié)構(gòu)代謝研究，但大鼠不易發(fā)生自發(fā)脆性骨折，這對(duì)PMOP骨生物力學(xué)的研究產(chǎn)生了影響。最近研究證實(shí)C57BL/6J小鼠峰值骨量低[4]，是目前證實(shí)可隨増齡出現(xiàn)脆性骨折的動(dòng)物[5]。用小鼠進(jìn)行骨代謝遺傳因素的研究，已經(jīng)成為目前骨質(zhì)疏松研究領(lǐng)域的前沿課題[6]。本實(shí)驗(yàn)中，除BS/BV外，去卵巢組和假手術(shù)組骨量和骨微結(jié)構(gòu)各項(xiàng)指標(biāo)均具有明顯差異(P<0.01),顯示出小鼠PMOP模型的成功建立。但是骨量和骨微結(jié)構(gòu)的差異并不代表骨強(qiáng)度的差異，骨的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，能否導(dǎo)致骨的強(qiáng)度和承重功能的改變，需要骨生物力學(xué)檢測(cè)。通常測(cè)定藥物對(duì)骨生物力學(xué)性能的影響，能反映藥物對(duì)骨質(zhì)疏松的骨質(zhì)量、骨質(zhì)疏松性骨折作用的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)三組小鼠右脛骨三點(diǎn)抗壓最大載荷試驗(yàn)各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。由此我們認(rèn)為，小鼠PMOP模型更與人類PMOP模型接近。

3.2 中藥干預(yù)PMOP

可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)已經(jīng)表明無(wú)論哪種西藥，在治療PMOP中都不可避免存在副作用[7]，與此同時(shí)，中醫(yī)藥卻顯現(xiàn)出抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，特別是以補(bǔ)腎、健脾為代表的健骨顆粒對(duì)防治PMOP有明確效果[8]，其主要成分是：煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等。臨床上在增加骨強(qiáng)度，緩解骨疼痛，降低骨折率上有良好療效[9]。本實(shí)驗(yàn)用健骨顆粒對(duì)PMOP小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，從骨組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)方面闡明補(bǔ)腎健脾中藥健骨顆粒的抗骨質(zhì)疏松作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該中藥在提高骨量方面效果顯著，其中骨礦物質(zhì)含量BMC和骨密度BMD兩項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比，具有極顯著差異(P<0.01)(表1)，說(shuō)明健骨顆粒可提升骨量，從而增加骨密度。在改善骨小梁結(jié)構(gòu)上也具有顯著作用(圖1、2、3、4)，表明健骨顆粒在改善骨質(zhì)疏松方面還表現(xiàn)在對(duì)骨小梁的形態(tài)進(jìn)行重建。

3.3 microCT在PMOP模型研究中的應(yīng)用

3.3.1microCT骨量及骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)在本實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

在骨量指標(biāo)中，骨礦物質(zhì)含量(BMC)、骨密度或骨礦物質(zhì)密度(BMD)，是最能代表骨含量的參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示假手術(shù)組和去卵巢組相比BMD、BMC以及骨表面積(BS)、骨體積(BV)等指標(biāo)有極顯著差異(P<0.01)(表1),說(shuō)明造模2個(gè)月即可使小鼠骨量嚴(yán)重丟失。在骨微結(jié)構(gòu)中，Tb.N代表了給定長(zhǎng)度內(nèi)骨組織與非骨組織的交點(diǎn)數(shù)量，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，Tb.N的值減少；Tb.Sp為骨小梁之間的髓腔寬度，其增加提示骨吸收增加，可能發(fā)生骨質(zhì)疏松。本實(shí)驗(yàn)中假手術(shù)組和去卵巢組相比，Tb.N和Tb.Sp均差異明顯(P<0.01)(表2)，說(shuō)明去卵巢2月后對(duì)小鼠的骨小梁數(shù)量和密度均造成巨大影響。Tb.Th作為骨小梁平均厚度的參數(shù)，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，Tb.Th值減??；SMI用來(lái)定義骨小梁板狀和桿狀的程度，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥時(shí)，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，SMI數(shù)值增加，本實(shí)驗(yàn)中去卵巢組較假手術(shù)組SMI有明顯提高(P<0.05)，說(shuō)明骨小梁的形態(tài)變化是去卵巢后骨量丟失同時(shí)發(fā)生的又一骨質(zhì)疏松特征。在骨質(zhì)疏松初期，承重骨小梁的DA增加，DA是ROI(感興趣區(qū))平均截距長(zhǎng)度橢圓中長(zhǎng)徑和短徑的比值，隨骨質(zhì)疏松加劇，DA會(huì)減小,本實(shí)驗(yàn)中Tb.Th、BS/BV和DA從指標(biāo)變化上來(lái)看有趨勢(shì)，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯，可能與造模時(shí)間短有關(guān)，也可能說(shuō)明這些指標(biāo)的非特異性，更可能說(shuō)明去卵巢造成的斷崖式雌激素劇減還不能很好模擬人類絕經(jīng)期雌激素呈斜坡式下降的狀態(tài)。

3.3.2microCT在骨質(zhì)疏松藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的優(yōu)勢(shì)

在PMOP診斷中骨密度檢測(cè)不能反映骨微結(jié)構(gòu)變化，難以完整體現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理特征；中醫(yī)藥治療PMOP的藥效學(xué)評(píng)價(jià)需要全面和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)可從靜態(tài)、動(dòng)態(tài)學(xué)參數(shù)定性和定量分析骨量、骨微結(jié)構(gòu)，但仍然存在標(biāo)本獲取的創(chuàng)傷性、制作過(guò)程的繁瑣性等缺陷。比其更為準(zhǔn)確、高效反映骨組織結(jié)構(gòu)的顯微CT(Micro-CT)。所測(cè)得的參數(shù)誤差小，且操作簡(jiǎn)便，定位準(zhǔn)確，能獲得真正各項(xiàng)同性的容積圖像，提高空間分辨率和采集圖像的速度，最高檢測(cè)精度達(dá)到5μm以下，在本實(shí)驗(yàn)中從掃描圖像直觀和清晰地觀察到中藥干預(yù)模型后，松質(zhì)骨的骨小梁數(shù)量、寬度、長(zhǎng)度部分恢復(fù)，密度和聯(lián)結(jié)性增加(圖1、2)；而中藥干預(yù)后皮質(zhì)骨面積增加，骨髓腔縮小，基本恢復(fù)到假手術(shù)組水平(圖3、4)。本實(shí)驗(yàn)采集數(shù)據(jù)精度高，數(shù)據(jù)采集的同一性使得后期統(tǒng)計(jì)結(jié)果更加準(zhǔn)確、科學(xué)。由于不需樣品制備，且對(duì)活體和離體標(biāo)本均可掃描[10]，本實(shí)驗(yàn)因?yàn)榫窒抻趧?dòng)物飼養(yǎng)和檢測(cè)設(shè)備的空間距離較大，因此采用離體標(biāo)本，即便如此，仍較傳統(tǒng)的骨組織計(jì)量學(xué)標(biāo)本處理省時(shí)省力，節(jié)約了大量成本，標(biāo)本也可反復(fù)利用或作它途，極具經(jīng)濟(jì)性。骨質(zhì)疏松藥效學(xué)評(píng)價(jià)包括藥物對(duì)單位面積(二維結(jié)構(gòu))或單位體積(三維結(jié)構(gòu))骨量、骨組織結(jié)構(gòu)、骨礦密度、骨有機(jī)物含量、骨生物力學(xué)性能的變化，這些指標(biāo)能定量闡明藥物是否對(duì)PMOP病理特征的骨量、骨組織微結(jié)構(gòu)、骨脆性、骨折危險(xiǎn)性等有療效[11]，因?yàn)橹委煿琴|(zhì)疏松的最終目的是預(yù)防骨折[12]。本實(shí)驗(yàn)采取microCT加骨生物力學(xué)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方式即是基于以上考量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，去卵巢后，microCT所檢測(cè)到的去卵巢模型以及健骨顆粒干預(yù)模型后骨組織骨量和骨微結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)，與以往的藥效學(xué)報(bào)道一致[8]，這說(shuō)明了microCT在PMOP藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的科學(xué)性。

綜上，去卵巢2月后成功建立小鼠PMOP模型；健骨顆?？构琴|(zhì)疏松作用明顯，主要通過(guò)增加骨量和改善骨小梁微結(jié)構(gòu)來(lái)最終提高骨強(qiáng)度；microCT對(duì)骨質(zhì)疏松參數(shù)分析簡(jiǎn)潔、高效，圖像多維、全面，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，具有一定的優(yōu)勢(shì)。