何 歡, 呂 美, 甄廣田, 肇立春

(1. 沈陽市糧油食品科學(xué)研究所 科研信息室, 沈陽 110025;2. 沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽 110034)

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利用玉米秸稈生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白關(guān)鍵技術(shù)研究

何 歡1, 呂 美1, 甄廣田1, 肇立春2

(1. 沈陽市糧油食品科學(xué)研究所 科研信息室, 沈陽 110025;2. 沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽 110034)

以農(nóng)作物副產(chǎn)品玉米秸稈為研究對象,采用水解纖維素性能優(yōu)良的綠色木霉(13001)及高產(chǎn)蛋白質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母(1769)為發(fā)酵生產(chǎn)菌株共同處理,生產(chǎn)蛋白質(zhì)含量較高,富含多種礦物元素的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品。探討了玉米秸稈預(yù)處理方法、綠色木霉接種工藝、纖維素降解工藝、不同氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響,以及單細(xì)胞蛋白發(fā)酵工藝,通過對比試驗(yàn)確定了玉米秸稈最佳的預(yù)處理方法為粉碎后加入氨水對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理、接種6%綠色木霉(13001)產(chǎn)酶效率最高、添加15%纖維素酶曲水解24 h纖維素水解最完全、加入氯化銨作為氮源發(fā)酵糖化效果最好,通過正交試驗(yàn)確定了單細(xì)胞蛋白發(fā)酵的最適工藝條件為加入3倍水,溫度控制在29～31 ℃,起始pH控制在5.5左右,發(fā)酵時(shí)間48 h左右。

玉米秸稈; 綠色木霉; 產(chǎn)朊假絲酵母; 單細(xì)胞蛋白

0 引 言

蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì),更是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物[1]。而世界蛋白質(zhì)資源缺乏的問題已存在多年,生物技術(shù)開發(fā)新型蛋白是解決這一問題的重要途徑[2]。另外,由于人們對資源的破壞性開采和利用,對可再生資源利用的研究與開發(fā)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略己在世界各國逐步展開[3]。玉米秸稈是農(nóng)作物的副產(chǎn)品,是一種可以綜合利用的重要的生物資源[4]。我國是農(nóng)業(yè)大國,年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈達(dá)6億噸[5]。隨著我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)村能源事業(yè)的發(fā)展,剩余秸稈的處理問題日漸凸顯。農(nóng)民采取簡單焚燒或隨意堆積,這種處理方式不但浪費(fèi)了自然資源,還帶來了各種危害,如造成空氣污染、土壤結(jié)構(gòu)破壞和交通事故頻發(fā)等,對人類健康和周圍動(dòng)植物的生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響,這對于資源的合理利用和環(huán)境保護(hù)都是極為不利的[6]。因此,利用生物技術(shù)處理玉米秸稈研制開發(fā)新型蛋白質(zhì)產(chǎn)品,不僅解決了農(nóng)作物副產(chǎn)物低價(jià)利用的問題,而且減少了由于焚燒玉米秸稈產(chǎn)生的二氧化碳,同時(shí)可以緩解世界蛋白質(zhì)資源缺乏的現(xiàn)狀[7]。本文著重對玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)新型蛋白產(chǎn)品—單細(xì)胞蛋白的工藝技術(shù)進(jìn)行了研究,以期研究開發(fā)出蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富的新型蛋白產(chǎn)品,為我國單細(xì)胞蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

綠色木霉13001:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;產(chǎn)朊假絲酵母1769:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;玉米秸稈,麩皮,瓊脂粉,硫酸銨,稀硫酸,NaOH,氨水,氯化銨,硝酸銨,蛋白胨,酵母浸膏等均為市售。

DHP型恒溫培養(yǎng)箱:上海精密儀器儀表有限公司;EHG-B型搖床培養(yǎng)箱:江蘇金壇市億通電子有限公司;FW100型粉碎機(jī):上海楚定分析儀器公司;ES-315型高壓滅菌鍋:上海賽洋實(shí)業(yè);SC-3614型離心機(jī):安徽中科中佳儀器公司;HS.Z68.5型蒸餾水發(fā)生器:北京科學(xué)儀器;101A-2型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:吳江新億陽烘箱制造廠;MZB-35型糖度計(jì):上海米青科實(shí)業(yè)有限公司;PHS-3C型酸度計(jì):上海雷磁儀器廠;接種環(huán)等。

1.2 測定方法

蛋白質(zhì)的測定:GB 5009.5—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定第一法規(guī)定的方法測定[8]。

還原糖的測定[9]:3,5-二硝基水楊酸比色法。

纖維素酶活的測定:以新華定量濾紙50 mg/份、羧甲基纖維素鈉510 mg/份、脫脂棉花50 mg/份為底物,分別對應(yīng)FPA、Cx、β-glucosidase,采用DNS還原糖法測定纖維素酶活[10]。酶活單位的定義為:1 min由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3 工藝流程

1.3.1 纖維素酶曲制備工藝流程

首先接種綠色木霉(13001)制備纖維素酶曲,工藝流程如下:

綠色木霉→斜面培養(yǎng)基→孢子懸浮液↓培養(yǎng)基配料→滅菌→冷卻→培養(yǎng)→纖維素酶曲

1.3.2 發(fā)酵工藝流程

在處理后的玉米秸稈粉中加入一定比例的纖維素酶曲,并接種產(chǎn)朊假絲酵母(1769)進(jìn)行單細(xì)胞蛋白制備,工藝流程如下:

纖維素酶曲↓玉米秸桿→預(yù)處理→處理后秸桿粉→接種→發(fā)酵→單細(xì)胞蛋白↑產(chǎn)朊假絲酵母→培養(yǎng)→液體菌種

2 結(jié)果與分析

2.1 原料預(yù)處理

玉米秸稈粉碎后,過20目篩,分別采用氫氧化鈉、稀硫酸、氨水進(jìn)行處理,結(jié)果如表1所示。

表1 玉米秸稈預(yù)處理結(jié)果對比表Tab.1 Contrast table of Maize straw pretreatment results

由表1可知,通過氫氧化鈉、稀硫酸、氨水的處理后,玉米秸稈分別有不同程度的水解,這種水解有助于后續(xù)水解發(fā)酵反應(yīng);氨水處理后反應(yīng)液得糖率最高,稀硫酸處理最低,這是因?yàn)榘彼谔幚矸磻?yīng)過程中,不僅能夠中和玉米秸稈中潛在的酸性,還可以使更多的木質(zhì)素成分分解,得到更多的糖,而且從經(jīng)濟(jì)及環(huán)保角度考慮,酸處理和強(qiáng)堿處理對設(shè)備的耐腐性要求較高[11],還會(huì)對環(huán)境造成污染,氨水腐蝕性小,價(jià)格便宜,適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),并且氨水預(yù)處理后的液體還可以在后續(xù)發(fā)酵反應(yīng)中再利用,節(jié)省氮源,減少對環(huán)境污染,綜合考慮,最終選擇氨水對玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理。

2.2 綠色木霉(13001)接種量對產(chǎn)酶效果的影響研究

圖1 木霉接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of trichoderma inoculatin volume on enzyme production

在三角瓶中按2∶1的比例加入玉米秸稈和麩皮,加入2%的(NH4)2SO4,分別接種綠色木霉孢子懸浮液2%、4%、6%、8%、10%,在30 ℃條件下培養(yǎng)72 h后測定酶活,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出,隨著綠色木霉接種量的增加,酶活逐漸升高,當(dāng)綠色木霉接種量超過6%時(shí),酶活開始下降,這主要是由于接種量過大,會(huì)使反應(yīng)液中微生物的數(shù)量過多,造成曲溫升高的過高,不利于反應(yīng)液中的微生物正常生長和產(chǎn)酶。因此,本實(shí)驗(yàn)最終選擇的綠色木霉(13001)接種量為6%。

2.3 纖維素酶對玉米秸稈纖維素降解的研究

在玉米秸稈粉中分別加入纖維素酶曲5%、10%、15%、20%、25%,在55 ℃、pH值為5.0條件下[12],水解12、24、36、48、60、72 h,考察對玉米秸稈中粗纖維的降解率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 纖維素酶對玉米秸稈中粗纖維降解的研究Tab.2 Tresearch on Cellulose enzyme decomposition of crude fibre in the maize straw

由表2可以看出,當(dāng)纖維素酶曲添加量為15%,降解24 h以上,玉米秸稈中的粗纖維得到最大程度的降解,從生產(chǎn)工藝與經(jīng)濟(jì)的角度考慮,本實(shí)驗(yàn)最終選擇添加15%纖維素酶曲,水解24 h。

2.4 不同氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響研究

玉米秸稈中是不含氮素營養(yǎng)的[13],所以本實(shí)驗(yàn)在玉米秸稈發(fā)酵糖化之前分別加入硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、硝酸銨和酵母浸膏,并以經(jīng)過氨水預(yù)處理不加其他氮素營養(yǎng)的玉米秸稈為對照,觀察這5種氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 不同氮源對玉米秸稈發(fā)酵糖化的影響結(jié)果Tab.3 The influence results of different nitrogen source on maize straw saccharification fermentation

由表3可以看出,加入蛋白胨產(chǎn)生的還原糖最多,加入酵母浸膏的次之,加入氯化銨發(fā)酵糖化僅比上述2種有機(jī)氮源略少,從降低生產(chǎn)成本角度考慮,本實(shí)驗(yàn)最終選擇氯化銨為最佳氮源。

2.5 產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.5.1 酵母接種量對產(chǎn)蛋白的影響

圖2 酵母接種量粗蛋白含量的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation volume on crude protein content

分別接入5%、10%、15%、20%的產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),經(jīng)過48 h后,測定發(fā)酵液中蛋白的含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出,隨著產(chǎn)朊假絲酵母接種量增加,產(chǎn)生蛋白的量隨之增加,當(dāng)接種量達(dá)到10%～15%時(shí),產(chǎn)生蛋白的量達(dá)到最大值,當(dāng)接種量再增加,蛋白的含量隨之減少,這主要是由于接種量在適當(dāng)范圍時(shí),產(chǎn)朊假絲酵母正常發(fā)酵代謝產(chǎn)生蛋白,當(dāng)接種量超過一定范圍時(shí),酵母代謝旺盛,使發(fā)酵液升溫過高,這對產(chǎn)朊假絲酵母的生長繁殖是不利的,會(huì)抑制產(chǎn)朊假絲酵母的生長繁殖代謝。因此,本實(shí)驗(yàn)最終選擇產(chǎn)朊假絲酵母的接種量為10%～15%。

2.5.2 產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵結(jié)果受反應(yīng)固液比、反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素的影響,采用一組四因素三水平正交試驗(yàn)對發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果如表4和表5所示。

表4 正交試驗(yàn)因素與水平Tab.4 Factors and levels of Orthogonal experiment

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of Orthogonal experiment

由表4和表5可以看出,產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵反應(yīng)最優(yōu)條件為A2B2C3D1,即反應(yīng)固液比為1∶3,反應(yīng)溫度為30 ℃,pH值為5.5,反應(yīng)時(shí)間為48 h;各因素對發(fā)酵反應(yīng)的影響由大至小依次為發(fā)酵反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)固液比。

3 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[14]

3.1 感官指標(biāo)

色澤:淡黃色。

狀態(tài):成粉末狀,無結(jié)塊現(xiàn)象。

滋味與氣味:具有產(chǎn)品特有的滋味和氣味,無其他異味。

雜質(zhì):無正常視力可見的外來雜質(zhì)。

3.2 理化指標(biāo)

蛋白質(zhì)≥55.0%,鈣≥750 mg/kg,磷≥12.0%,鐵≥48.0 mg/kg,鋅≥259 mg/kg。

3.3 微生物指標(biāo)[15]

菌落總數(shù)≤10cfu/g,大腸菌群<30MPN/100g,酵母菌<10cfu/g,致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌)未檢出。

4 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)和方差分析的方法對玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)新型蛋白產(chǎn)品—單細(xì)胞蛋白的工藝進(jìn)行了研究,確定了玉米秸稈最佳的預(yù)處理試劑為氨水;綠色木霉(13001)最佳的接種量為10%～15%;玉米秸稈發(fā)酵最佳氮素營養(yǎng)為氯化銨;產(chǎn)朊假絲酵母(1769)發(fā)酵反應(yīng)最佳工藝條件為加入3倍體積水,調(diào)節(jié)初始pH值為5.5左右,在30 ℃條件下,發(fā)酵反應(yīng)48 h。在上述工藝條件下制備的新型蛋白產(chǎn)品—單細(xì)胞蛋白中蛋白含量達(dá)到55%。

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Research on key techniques of production of single cell protein from maize straw

HE Huan1, LYU Mei1, ZHEN Guangtian1, ZHAO Lichun2

(1.Research Information Room, Shenyang Grain and Oil Food Science Research Institute, Shenyang 110025, China; 2. College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Using maize straw as main research objects, the hydrolysis of cellulose with excellent performance of Trichoderma viride(13001) and high-yield protein of Candida utilis yeast strains(1769) for fermentation production processing together,producting the single cell protein products of high protein content and rich in various mineral elements. Discussed the pretreatment methods of maize stalk, the inoculation technology of green wood mold, the cellulose degradation process, the effects of different nitrogen sources on the fermentation of maize straw and single cell protein fermentation process, by contrast experiments, the best pretreatment method of maize stalk was pretreated by adding ammonia, the highest efficiency of enzyme production was adding 6% trichoderma viride(13001), the hydrolysis of 24 h with the addition of 15% cellulase was the most complete, the best effect of the fermentation was added ammonium chloride as the nitrogen source were determined, by orthogonal test to determine the optimum fermentation technological conditions of single cell protein is added in 3 times of water,temperature controlled in 29～31 ℃,starting pH at about 5.5, fermentation for 48 hours.

maize straw; trichoderma viride; candida utilis; single cell protein

2016-01-15。

沈陽市科技局科學(xué)事業(yè)費(fèi)科技專項(xiàng)項(xiàng)目(2008017)。

何 歡(1982-),女,河北青龍人,沈陽市糧油食品科學(xué)研究所高級工程師; 通信作者: 肇立春(1966-),女,遼寧丹東人,沈陽師范大學(xué)教授。

1673-5862(2016)03-0311-05

TS210.9

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.03.012