倪　磊， 許德暉， 劉利英， 王愛英， 汪魯敏

(西安交通大學醫(yī)學部環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室，細胞生物學與遺傳學系，西安　710061； *通訊作者，E-mail：wanglumin1@mail.xjtu.edu.cn)

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SCN5A基因L812Q突變體細胞模型的建立與細胞定位

倪磊， 許德暉， 劉利英， 王愛英， 汪魯敏*

(西安交通大學醫(yī)學部環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室，細胞生物學與遺傳學系，西安710061；*通訊作者，E-mail：wanglumin1@mail.xjtu.edu.cn)

摘要：目的建立SCN5A基因L812Q突變體細胞模型，并細胞定位。 方法應用重疊PCR的方法構建SCN5A基因L812Q突變；以pMD19-T載體克隆SCN5A基因L812Q突變體；SCN5A-L812Q通過EcoR Ⅰ和ACC Ⅰ限制性內切酶位點插入表達載體質粒pEGFP-C1-hH1中，測序鑒定；將構建好的pEGFP-C1-hH1-L812Q突變型質粒、pEGFP-C1-hH1野生型質粒瞬時轉染進入HEK293細胞，通過免疫熒光檢測L812Q突變的細胞定位；將pEGFP-C1-hH1、pEGFP-C1-hH1-L812Q和pEGFP-C1-hH1+pEGFP-C1-hH1-L812Q分別轉染進入HEK293細胞，用Western blot方法分析L812Q突變體的表達。結果測序結果顯示pEGFP-C1-hH1-L812Q表達載體構建成功。熒光檢測驗證，野生型SCN5A主要定位在細胞膜上，而突變型定位在細胞質中。通過Western blot分析發(fā)現，突變型通道蛋白在細胞質中的表達量高于野生型。結論本研究成功構建了SCN5A基因突變載體pEGFP-C1-hH1-L812Q，證明SCN5A基因L812Q突變型主要定位在細胞質中。

關鍵詞：Brugada綜合征；SCN5A基因；基因突變；細胞定位

Brugada綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，已知致病基因包括SCN5A、GPD1L、SCN1B、SCN2B、SCN3B、RANGRF、SLMAP、KCNE3、KCNJ8、HCN4、KCNE5、KCND3、CACNA1C、CACNB2B、CACNA2D1和TRPM4[1]。其中，SCN5A不同位點的突變表現不同的臨床癥狀，既可引起B(yǎng)rugada綜合征，也可誘導LQTs的發(fā)生[2,3]。SCN5A定位于3p21基因，基因長80 kb，含有28個外顯子，編碼2 016個氨基酸。SCN5A基因作為心臟電壓門控鈉通道的α亞基的編碼基因，其包含4個同源結構域(Ⅰ-Ⅳ)，每個結構域包含6個α螺旋跨膜片段(S1-S6)，S5和S6片段之間的連接環(huán)構成通道孔區(qū)，也稱為P環(huán)，決定了離子通道的選擇通透性，S4片段含有帶正電荷的氨基酸殘基，為通道的易感器[4]。SCN5A基因的突變點涉及到了鈉離子通道α亞基的各個區(qū)域，并且突變位點與其所導致的通道功能異常的機制有關，主要有負顯性效應的影響和鈉通道動力學的改變[5,6]。

基因突變并不一定引起臨床表型的改變。本課題組的前期研究發(fā)現,Brugada綜合征的患者攜帶有SCN5A基因L812Q新突變，為了鑒定其與功能的關系，擬構建SCN5A基因L812Q新突變細胞模型，為功能研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1質粒和主要試劑

質粒PEGFPN2-hH1和HEK293細胞由本研究室提供。正反向引物及測序引物由北京奧科生物技術公司合成。高保真熱啟動DNA聚合酶、普通Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、PMD19-T simple Vector、EcoR Ⅰ和ACCⅠ限制性內切酶購于日本TaKaRa公司，DNA ladder、Agarose Gel DNA Purification Kit和質粒小提試劑盒購于北京天根生化科技公司，Anti-Calnexin購于美國Millipore公司，異硫氰酸熒光素(FITC)購于美國Sigma公司；山羊抗血清與熒光二抗(TRITC)購于中杉金橋生物技術有限公司。

1.2重疊衍生PCR擴增SCN5A基因L812Q突變體片段

使用重疊延伸PCR方法構建突變體。SCN5A基因的外側端引物：5′-TCAAGCAGGGAGTGAAGTTGGTGGT-3′和5′-GAAGATGAGGCAGACGAGGAGGACG-3′；L812Q突變點的鄰近引物：L812Q-forward 5′-CTCCTTCCGCCAGCTGCGGGTCTTC-3′和L812Q-reverse 5′-GAAGACCCGCAGCTGGCGGAAGGAG-3′。第1步PCR 以SCN5A基因的外側5′-端引物和L812Q-reverse 3′端引物擴增SCN5A基因5′-DNA片段，片段大小為331 bp；第2步PCR以SCN5A基因的外側3′端引物和L812Q-forward 5′端引物擴增SCN5A-CDNA片段，片段大小為1 608 bp。應用凝膠回收前兩步PCR產物，第3步PCR連接5′端和3′端DNA片段，用兩外側端引物擴增此片段，約1 915 bp。凝膠回收DNA片段，由北京奧科生物技術有限責任公司測序鑒定，備用。

1.3L812Q突變體的克隆與測序分析

將測序正確的L812Q突變體DNA片段連接到pMD19-T載體上，轉化感受態(tài)大腸桿菌，克隆并擴增。將4 μl的L812Q突變體DNA與1 μl的pMD19-T載體在16 ℃水浴中過夜連接，取10 μl連接產物加入到100 μl大腸桿菌中進行轉化，經冰浴30 min、42 ℃熱休克90 s、LB培養(yǎng)基37 ℃孵育1 h、5 000 r/min離心3 min棄上清后將菌液懸浮鋪于含有抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。挑選出單克隆菌落于抗性培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h后提質粒。質粒提取參見北京天根生化科技公司質粒小提說明書。質粒提取后，用EcoR Ⅰ和ACCⅠ限制性內切酶對質粒進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將酶切鑒定正確的質粒送北京奧科生物技術有限責任公司測序，檢測突變點。

1.4L812Q突變體真核表達載體的連接、酶切和測序鑒定

應用EcoRⅠ和ACCⅠ限制性內切酶分別酶切克隆載體以及真核表達載體pEGFP-C1-hH1，將酶切產物進行電泳分離后，通過凝膠回收純化試劑盒分別回收克隆載體中L812Q突變體片段和pEGFP-C1-hH1載體中的大片段進行連接。將2.8 μl的L812Q突變片段和1 μl的pEGFP-C1-hH1于含1 μl的T4 DNA Ligase的體系中22 ℃過夜連接后進行轉化。挑選出單克隆菌落后于抗性培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h提質粒。質粒提取后，用EcoRⅠ和ACCⅠ限制性內切酶雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將酶切鑒定正確的質粒測序。

1.5HEK293細胞培養(yǎng)與轉染

HEK293細胞培養(yǎng)于10 %小牛血清的全培養(yǎng)基DMEM中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。將HEK293細胞以1×105個/ml加入于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。在轉染前1 h，將含血清培養(yǎng)基換成無血清的培養(yǎng)液。轉染分為3組：pEGFP-C1-hH1、pEGFP-C1-hH1-L812Q和pEGFP-C1-hH1+pEGFP-C1-hH1-L812Q。用50 μl無血清培養(yǎng)基稀釋0.8 μg DNA和2 μl脂質體2000，輕輕混勻后室溫放置20 min；直接將復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，搖動培養(yǎng)板，于37 ℃，5 %CO2培養(yǎng)4-6 h更換全培養(yǎng)基。

1.6Western blot分析SCN5A表達水平

按照常規(guī)的Western blot的方法進行實驗。電泳轉膜后，將膜正面向下放入已加入1 ml Anti-Calnexin一抗(1∶2 000)的玻璃皿中，4 ℃過夜；棄一抗，TBST洗3次，將膜正面向下放入已加入1 ml HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗(1∶2 000)的玻璃皿中，搖床溫和振搖2 h；棄二抗，TBST洗3次，每次10 min；用吸水紙吸干膜上的水分，膜正面向上放在干凈的玻璃皿上?；瘜W發(fā)光底物顯示雜交印跡，照相并分析結果。

2結果

2.1SCN5A基因L812Q突變體的擴增與鑒定

通過重疊PCR，分別獲得了3步PCR的產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，第1步PCR產物片段大小為331 bp，第2步PCR產物片段大小為1 608 bp，第3步PCR產物片段大小為1 915 bp，均與預期片段大小一致(見圖1)。測序結果表明，在SCN5A基因cDNA上2629位堿基T突變?yōu)锳，而其他序列均無改變(見圖2)。

M.DNA ladder；1.PCR產物圖1　三步PCR結果的電泳鑒定Figure 1　Electrophoresis identification of three-step PCR results

圖2　第三步PCR測序結果Figure 2　Sequencing of the third PCR result

2.2L812Q突變體表達載體pEGFP-C1-hH1-L812Q的構建與鑒定

野生型SCN5A(hH1)cDNA全長8.5 kb，pEGFP-C1-hH1全長13.2 kb。在突變位點兩側即2 425位點和4 031位點各有一個酶切位點，對應的酶分別是EcoR Ⅰ和ACCⅠ。通過雙酶切可以看到2個片段，分別是長為1.6 kb和11.6 kb(見圖3A)。應用T4 DNA連接酶將L812Q的突變片段的1 606 bp片段與pEGFP-C1-hH1的11.6 kb片段連接起來，重組成pEGFP-C1-hH1-L812Q。野生型pEGFP-C1-hH1與重組質粒pEGFP-C1-hH1-L812Q電泳結果一致(見圖3B)，表明突變體構建成功。

圖3　SCN5A基因L812Q突變體表達載體的構建與鑒定Figure 3　The construction and identification of SCN5A gene-L812Q mutant expression vector

2.3L812Q突變體蛋白質表達和定位

在熒光顯微鏡下可見pEGFP-C1-SCN5A組及pEGFP-C1-SCN5A-L812Q組轉染的HEK293細胞均發(fā)出綠色熒光，而未轉染的HEK293細胞未見綠色熒光，表明2個表達載體構建成功，并分別表達SCN5A和SCN5A-L812Q。野生型SCN5A蛋白定位于細胞膜，而SCN5A-L812Q主要定位于細胞質(見圖4)。為了證明SCN5A-L812Q的細胞質定位，應用Western blot法鑒定SCN5A基因L812Q的細胞質表達水平，結果顯示突變型通道蛋白在細胞質中的表達量高于野生型(見圖5)。

圖4　pEGFP-C1-SCN5A及pEGFP-C1-SCN5A-L812Q表達蛋白的定位Figure 4　The location of expression protein of pEGFP-C1-SCN5A and pEGFP-C1-SCN5A-L812Q

1.野生型；2.雜合型；3.突變型圖5　野生型、雜合型和突變型蛋白在細胞質的表達Figure 5　The expression of wild type, heterozygous type and mutant type protein in the cytoplasm

3討論

Brugada綜合征是由西班牙Brugada兄弟于1992年發(fā)現的離子通道病，以V1-V3導聯右束支傳導阻滯(RBBB)的心電圖變化和心臟性猝死為特征，常表現為常染色體顯性負效應[7,8]。其遺傳背景復雜，已發(fā)現的相關基因多達14個，其中SCN5A基因突變與Brugada綜合征密切相關[9]。本課題組前期在一名Brugada綜合征患者基因組中篩查到SCN5A基因的新突變T2629A(L812Q)，但不清楚該突變是否與Brugada綜合征的臨床表征相關，因此，建立突變體的細胞模型是功能鑒定的基礎。

目前，建突變體的方法主要有以下3種方法：突變試劑盒、寡核苷酸引物介導的定點誘變以及PCR法。由于PCR的方法簡單，易操作，花費省而多被實驗室所采用。常見的PCR定點誘變的方法有大引物PCR、快速定點誘變PCR、重疊延伸PCR等，其中重疊延伸PCR因其不受突變類型和突變位置的限制，不僅可以完成單純的基因點突變，而且還能實現某一基因大片段的插入及缺失，因此應用最為廣泛。該方法的特點是在待突變位點上(即引物包含突變位點)和擴增片段的上下游分別設計引物。本實驗主要采取的是定點突變中重疊延伸PCR的方法。由于T載體上缺少內切酶切點，因此在上下游引物上設計了EcoRⅠ和ACCⅠ的切點。經過三步PCR獲得突變體的DNA片段，將其插入T載體進行擴增，其后通過雙酶切獲得突變體片段插入表達載體。測序結果提示SCN5A cDNA 2629位點堿基T變?yōu)锳，氨基酸第812位密碼子由甘氨酸變?yōu)楣劝滨０?，即L812Q突變，除該位點外其余位點無堿基變化，證明定點突變過程成功。

HEK293細胞其內源性電壓門控通道不包括INa電流，所以采用了HEK293細胞作為表達體系。本實驗主要運用陽離子脂質體法分別將pEGFP-C1-hH1和pEGFP-C1-hH1-L812Q轉染HEK293細胞。由于pEGFP綠色熒光蛋白和SCN5A基因所編碼的鈉離子通道蛋白是融合表達的，因此通過熒光顯微鏡便可以觀察到轉染是否成功和轉染的效率。本結果表明，野生型SCN5A蛋白定位于細胞膜，而SCN5A-L812Q主要定位于細胞質。Western blot法進一步證明基因L812Q的細胞質表達水平高于野生型，提示是L812Q突變所表達的缺陷hH1蛋白在內質網上合成后，不能被進一步加工并轉運到細胞膜上，而是滯留于內質網中，減少了細胞膜上有功能的離子通道，使膜轉運功能不足，進而使INa通道電流減少，心內外膜的負極化過程發(fā)生改變，引發(fā)Brugada綜合征。

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基金項目：國家自然科學基金-中加合作項目(81161120549)；西安交通大學生物醫(yī)學共享平臺建設資助項目(2015FWPT-14)

作者簡介：倪磊，女，1965-11生，本科，實驗師，E-mail：nilei@xjtu.edu.cn

收稿日期：2016-05-12

中圖分類號：R596.1

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)07-0585-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.07.001

Construction of cell model of the SCN5A gene-L812Q mutation and its celluar localization

NI Lei, XU Dehui, LIU Liying, WANG Aiying, WANG Lumin*

(KeyLaboratoryofEnvironmentandGenesRelatedtoDiseases,MinistryofEducation,DepartmentofCellBiologyandGenetics,Xi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xi’an710061,China;*Correspondingauthor,E-mail:wanglumin1@mail.xjtu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo establish the cell model of the SCN5A gene-L812Q mutation and to explore its cell localization.MethodsThe overlapping derivative PCR was used to construct the L812Q mutation of SCN5A gene, and the L812Q of SCN5A gene was cloned into pMD19-T simple vector. Furthermore,L812Q was inserted into the pEGFP-C1-hH1 vector between the EcoR Ⅰ and ACC Ⅰ restriction enzyme sites and then verified by sequencing. The pEGFP-C1-hH1-L812Q and pEGFP-C1-hH1 vector were transfected into HEK293 cells respectively, the cell location of L812Q mutation was verified using immunofluorescence assay. The pEGFP-C1-hH1, pEGFP-C1-hH1-L812Q and pEGFP-C1-hH1+pEGFP-C1-hH1- L812Q vector were transfected into HEK293 cells respectively, and then the expression of L812Q was determined by Western blot.ResultsThe pEGFP-C1-hH1-L812Q expression vector was successfully constructed. Wild type SCN5A was mainly located on the cell membrane and mutant type SCN5A was located in the cytoplasm. Western blot results showed that the expression level of L812Q mutation was higher than that of wild type in cytoplasm.ConclusionThe pEGFP-C1-hH1-L812Q expression vector is successfully constructed. The L812Q mutant type of SCN5A gene is located in the cytoplasm.

Key words:Brugada syndrome;SCN5A gene;gene mutation;celluar localization