胡雨欣，鄭 舒，何 早，羅 芳，劉 霞*（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

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免疫磁納米粒子對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的富集分離

胡雨欣，鄭 舒，何 早，羅 芳，劉 霞*
（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

摘 要：采用化學(xué)共沉淀法制備了羧基化磁納米粒子，分別對(duì)磁納米粒子-沙門(mén)氏菌多克隆抗體復(fù)合物（免疫磁納米粒子）的偶合條件和免疫磁納米粒子富集分離腸炎沙門(mén)氏菌的條件進(jìn)行了優(yōu)化，為腸炎沙門(mén)氏菌的富集分離和檢測(cè)提供一種更為快捷、高效的方法。結(jié)果表明，當(dāng)51.7 μg/mL羧基化磁納米粒子與碳二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺（0.4 mol/L/0.1 mol/L）、1.0 mg/mL的多克隆抗體的體積比為1∶2∶2時(shí)，37 ℃水浴加熱40 min，兩者的偶合效果最佳。應(yīng)用上述優(yōu)化條件制備的免疫磁納米粒子吸附104CFU/mL腸炎沙門(mén)氏菌，當(dāng)兩者的體積比為4∶5，孵育時(shí)間為40 min時(shí)，免疫磁納米粒子對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的吸附效率可達(dá)到94.36%。

關(guān)鍵詞：免疫磁納米粒子；腸炎沙門(mén)氏菌；富集分離

引文格式：

胡雨欣， 鄭舒， 何早， 等.免疫磁納米粒子對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的富集分離［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 162-167.

HU Yuxin， ZHENG Shu， HE Zao， et al.Enrichment and isolation of Salmonella enteritidis by immune magnetic nanoparticles［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 162-167.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613029. http://www.spkx.net.cn

沙門(mén)氏菌是引起食物感染和食物中毒的最重要食源性致病菌之一，禽蛋和肉類(lèi)食品是其主要的傳播媒介［1-2］。人食入過(guò)量活菌會(huì)產(chǎn)生腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)敗血癥、脫水、酸中毒、無(wú)尿、心力衰竭等［3］，急救不及時(shí)將會(huì)危及生命。在世界各地的食物中毒中，沙門(mén)氏菌引起的中毒病例占首位或第二位［4］，因而受到了人們強(qiáng)烈的關(guān)注，如何有效地解決沙門(mén)氏菌在食品中的污染是食品安全監(jiān)測(cè)工作中的重點(diǎn)之一。

現(xiàn)有分析檢測(cè)方法通常都需要復(fù)雜的增菌過(guò)程［5-8］，而對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行預(yù)增菌或高效分離富集是其實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的重要前提。因此，選擇合適的富集分離方法，使目標(biāo)菌從復(fù)雜的食品基質(zhì)中分離出來(lái)，同時(shí)清除食品基質(zhì)中的干擾物質(zhì)，對(duì)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌靈敏且特異的檢測(cè)至關(guān)重要［9］。

近年來(lái)，基于磁性納米材料的免疫磁分離法（immunemagnetic separation，IMS）已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食源性致病菌的分離［10-14］。經(jīng)過(guò)生物學(xué)修飾和功能化的磁性納米材料，可特異性地識(shí)別食源性致病菌，再利用外加磁場(chǎng)分離菌體，即可實(shí)現(xiàn)食品中少量致病菌的特異性的快速富集分離［15-19］。本研究采用化學(xué)共沉淀法，制備了表面羧基修飾的功能化磁納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs），利用MNPs表面的羧基，通過(guò)氨基偶聯(lián)的方法將沙門(mén)氏菌多克隆抗體（anti-Salmonella polyclonal antibody，PAb）結(jié)合在MNPs的表面，制備出對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌具有特異性吸附的免疫M(jìn)NPs。利用該免疫M(jìn)NPs對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）進(jìn)行富集分離，獲得吸附性能最佳的免疫M(jìn)NPs的制備條件和吸附條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

腸炎沙門(mén)氏菌多克隆抗體（anti-Salmonella polyclonal antibody，PAb，ab35156） 美國(guó)Abcam公司；腸炎沙門(mén)氏菌（CICC21482） 湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院。

富里酸、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、無(wú)水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇胺（ethanolamine hydrochloride，EA）、碳二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide，EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）（1 L PBS包含3.223 g磷酸二氫鈉、0.45 g磷酸氫二鈉和8 g氯化鈉，0.1 mol/L氫氧化鈉，pH 7.4），營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；VORTEX-2旋渦振蕩儀 美國(guó)Scientific Industries公司；KQ-100超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；SPX-250BS-Ⅱ恒溫箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基化MNPs的制備

參考Zhou Chunjiao等［20］的方法，采用化學(xué)共沉淀法一步生成表面羧基化的MNPs。250 mL三口瓶中加入120 mL超純水，通入氮?dú)獬M氧氣后；升溫至80 ℃，再加入0.4 g富里酸；當(dāng)溶液沸騰后立即加入20 mL含有2 mmol/L FeCl3·6H2O、1 mmol/L FeSO4·7H2O的混合溶液和5 mL 6.25 mol/L NaOH，回流100 min。待溶液冷卻至室溫后，經(jīng)磁性分離，多次純水與無(wú)水乙醇洗滌至中性，配成一定濃度溶液后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫M(jìn)NPs制備條件的優(yōu)化

利用MNPs表面的羧基，經(jīng)氨基偶聯(lián)方法將PAb偶合在其表面，制備出對(duì)腸炎沙門(mén)殺菌具有特異性吸附的免疫M(jìn)NPs。取PBS緩沖液稀釋的MNPs溶液（51.7 μg/mL）40 μL，利用新配制的EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）40 μL混合溶液活化其表面的羧基后，加入40 μL一定濃度的抗體稀釋液，漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min后，加入0.1 mol/L 40 μL EA漩渦振蕩5 min進(jìn)行封閉，然后靜置30 min，經(jīng)外加磁場(chǎng)分離未結(jié)合的PAb，并用PBS反復(fù)洗滌3 遍，重懸至初體積。

1.3.2.1 PAb與羧基化MNPs偶合濃度的參考量的確定

以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制一系列已知質(zhì)量濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定其吸光度，并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)擬合線性關(guān)系獲得線性方程。然后取未知質(zhì)量濃度的BSA 2 mL，測(cè)定其在278 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A1）；通過(guò)1.3.2節(jié)的方法與51.7 μg/mL羧基化MNPs結(jié)合后，經(jīng)外加磁場(chǎng)富集羧基化MNPs結(jié)合與BSA的偶合物，小心吸取上清液，測(cè)定其在278 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A2）。通過(guò)測(cè)定BSA在被結(jié)合前后278 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，由線性方程計(jì)算出與該濃度的羧基化MNPs結(jié)合的BSA濃度，并以此作為腸炎沙門(mén)氏菌多克隆抗體與該濃度MNPs偶合的參考使用量［21］。

1.3.2.2 EDC/NHS添加量的確定

取30 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；分別加入30、40、50、60 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加入60 μL 1 mg/mL BSA，漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加入0.1 mol/L EA，漩渦振蕩5 min，PBS緩沖液定容至2 mL。靜置30 min后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描紫外全波段光譜，根據(jù)258 nm波長(zhǎng)處的吸光度，確定EDC/NHS的最佳添加比例。

1.3.2.3 PAb用量的確定

取20 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；加入40 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；分別加入加20、30、40、60 μL 1.0 mg/mL PAb，冰浴超聲1 min；PBS緩沖液定容至2 mL。靜置于37 ℃水浴中反應(yīng)一定時(shí)間后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描紫外全波段光譜，根據(jù)258 nm波長(zhǎng)處的吸光度，確定PAb與羧基化MNPs的最佳體積比。

1.3.2.4 反應(yīng)環(huán)境的影響

取20 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；加入40 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加20 μL 0.5 mg/mL PAb，冰浴超聲1 min；PBS溶液定容至2 mL。分別靜置于37 ℃水浴和恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)一定時(shí)間后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描紫外全波段光譜，確定最適合的反應(yīng)環(huán)境。

1.3.2.5 反應(yīng)溫度的影響

取20 μL 51.7 μg/mL的MNPs至1.5 mL離心管中；加入40 μL EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L），漩渦振蕩3 min，冰浴超聲5 min；加20 μL 0.5 mg/mL PAb，冰浴超聲1 min；PBS溶液定容至2 mL。分別靜置于37 ℃和20 ℃水浴中反應(yīng)一定時(shí)間后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描紫外全波段光譜，確定最適合的反應(yīng)溫度。

1.3.2.6 免疫M(jìn)NPs 4 ℃保存效果

將51.7 μg/mL羧基化MNPs與1.0 mg/mL PAb偶合好之后放置于4 ℃冰箱保存，每天使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)258 nm處的吸光度值變化，以考察免疫M(jìn)NPs在4 ℃條件下的保存效果。

1.3.3 免疫M(jìn)NPs高效富集腸炎沙門(mén)氏菌

1.3.3.1 腸炎沙門(mén)氏菌的活化

接種凍藏的腸炎沙門(mén)氏菌菌株至50 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃活化過(guò)夜。取活化好的菌液5 mL至滅菌離心管中，5 000 r/min離心5 min后小心去掉上清液，沉淀用PBS重懸至初體積，備用。

1.3.3.2 免疫M(jìn)NPs用量對(duì)吸附效率的影響

無(wú)菌操作下，調(diào)節(jié)腸炎沙門(mén)氏菌菌液濃度為104CFU/mL。分別取上述制備的免疫M(jìn)NPs 20、40、60、80、100 μL至1.5 mL離心管中，每管各加入100 μL菌液，37 ℃水浴中孵育40 min，磁性分離，取上清液100 μL于SS平板涂布計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度平行3 次。再將平板置于（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)計(jì)算吸附效率，同時(shí)做空白對(duì)照?？疾焖苽涞拿庖進(jìn)NPs對(duì)該沙門(mén)氏菌吸附效率的影響。

1.3.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸附效率的影響

無(wú)菌條件下，取100 μL 104CFU/mL沙門(mén)氏菌稀釋液于1.5 mL滅菌離心管中，加入80 μL上述制備的免疫M(jìn)NPs，37 ℃分別孵育10、20、30、40、50、60 min，磁性分離，取上清液100 μL于SS平板涂布計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度平行3 次。再將平板置于（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)計(jì)算吸附效率，同時(shí)做空白對(duì)照?？疾旆磻?yīng)時(shí)間對(duì)吸附效率的影響。

1.3.3.4 免疫M(jìn)NPs富集沙門(mén)氏菌的吸附效率計(jì)算

將免疫M(jìn)NPs富集分離腸炎沙門(mén)氏菌過(guò)后的上清液采取合適的稀釋度，取100 μL于SS平板涂布。再將平板置于（36±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)計(jì)算其吸附效率［22］。

式中：Ci為平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)/（CFU/mL）；Ck為加入菌懸液濃度/（CFU/mL）；Vi為涂布取樣體積/mL；Vj為菌懸液及MNPs加入總體積/mL；Vk為菌懸液加入體積/mL；N為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧基化MNPs生物功能化的紫外表征

紫外光譜可用來(lái)表征抗體是否與MNPs相結(jié)合。圖1顯示了PAb、MNPs以及免疫M(jìn)NPs的紫外光譜，發(fā)現(xiàn)278 nm處的吸收峰為PAb的紫外特征吸收峰；MNPs （Fe3O4MNPs）無(wú)顯著的紫外特征吸收峰；258 nm處的吸收峰為免疫M(jìn)NPs的紫外特征吸收峰。免疫M(jìn)NPs的紫外特征吸收峰值出現(xiàn)藍(lán)移，可能與MNPs粒子的光吸收與散射以及與半導(dǎo)體材料本身具有的間接帶隙（indrect band gap）的特性有關(guān)［23-24］。

2.2 PAb在羧基化MNPs表面最佳偶合濃度參考量的確定

為節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，本實(shí)驗(yàn)采用BSA作為模擬蛋白，獲得PAb在羧基化MNPs表面最佳偶合濃度的參考量。BSA在278 nm波長(zhǎng)處的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.707 86X－0.013 1（R2=0.999 3）。圖2為根據(jù)1.3.2.1節(jié)進(jìn)行操作，獲得的BSA與MNPs偶合前后的紫外光譜圖。通過(guò)圖2可知，BSA經(jīng)MNPs偶合前后，在278 nm處的吸光度值分別為0.828及0.154，可得與羧基化MNPs （51.7 μg/mL）偶合的BSA的吸光度值為ΔY=0.674，將該值帶入BSA的線性方程，可算得X≈0.971 mg/mL，即與51.7 μg/mL羧基化MNPs偶合的BSA的質(zhì)量濃度為0.971 mg/mL，以此作為PAb與MNPs偶合的參考使用量。

2.3 EDC/NHS添加量的確定

由圖3可知，當(dāng)30 μL 51.7 μg/mL的MNPs溶液中加入EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）混合液活化其表面的羧基時(shí)，當(dāng)添加量由30 μL增加至60 μL時(shí)，復(fù)合物的吸光度在不斷增加，說(shuō)明MNPs表面的羧基活化程度隨著EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）混合液的增加而不斷增加。MNPs表面的羧基被活化的程度越大，與一定體積的PAb結(jié)合的就越多。因此，當(dāng)51.7 μg/mL MNPs生物功能化時(shí)，選擇EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）與MNPs兩者的體積比為2∶1，以活化其表面的羧基。

2.4 PAb用量的確定

根據(jù)1.3.2.3節(jié)，獲得了不同體積比的PAb（1.0 mg/mL）與MNPs（51.7 μg/mL）結(jié)合的紫外光譜（圖3）。如圖4所示，當(dāng)PAb使用量為MNPs（20 μL）的3 倍時(shí)，免疫M(jìn)NPs的吸光度值最大，說(shuō)明偶合的效果最好；但是與2 倍使用量下的吸光度值差別并不明顯。這說(shuō)明PAb用量在MNPs的2 倍以上時(shí)，MNPs的表面基本已被BSA覆蓋；考慮到抗體較為昂貴，故選擇PAb（1.0 mg/mL）與MNPs（51.7 μg/mL）兩者的體積比為2∶1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 反應(yīng)環(huán)境對(duì)免疫磁納米粒子形成的影響

根據(jù)1.3.2.4節(jié)，將51.7 μg/mL MNPs與1.0 mg/mL PAb按照最佳使用量，分別在37 ℃水浴和恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行偶合，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行紫外表征。在反應(yīng)過(guò)程中，PAb的特征峰不斷藍(lán)移，當(dāng)二者偶合達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，其特征峰藍(lán)移至258 nm處。如圖5所示，當(dāng)MNPs與PAb在恒溫箱中反應(yīng)時(shí)，420 min才偶合完全，而二者在水浴中反應(yīng)，40 min即可完成偶合，時(shí)間縮短了10 倍。其原因可能是水浴加熱相比恒溫箱提供的空氣加熱，可以平穩(wěn)地加熱，對(duì)溶液的加熱具有接觸包裹性比較好的特點(diǎn)。因此，MNPs與PAb的偶合選擇在水浴中進(jìn)行。

2.6 反應(yīng)溫度對(duì)免疫磁納米粒子形成的影響

根據(jù)1.3.2.5節(jié)方法，將51.7 μg/mL MNPs與1.0 mg/mL PAb按照最佳使用量，分別在37 ℃和20 ℃水浴中進(jìn)行偶合，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行紫外表征。如圖6所示，在37 ℃水浴條件下，MNPs與PAb 40 min即可完成偶合，形成免疫M(jìn)NPs，而在20 ℃水浴下偶合完成則需要60 min；且免疫M(jìn)NPs在37 ℃條件下能達(dá)到比在20 ℃條件下更高的吸光度值。這說(shuō)明在37℃水浴加熱條件下比在20 ℃時(shí)，兩者偶合的效率更高。其原因是PAb在37℃條件下具有更好的生物活性，能與羧基化的MNPs結(jié)合得更快、更好，故MNPs與PAb的偶合的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃。

2.7 免疫磁納米粒子4 ℃保存效果

將最佳偶合條件下獲得的免疫M(jìn)NPs放置于4 ℃冰箱保存，每天使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其258 nm處的吸光度值變化，以觀察其在4 ℃條件下的保存效果。如圖7所示，免疫M(jìn)NPs在前8 d的吸光度值下降幅度較小，而在第9天出現(xiàn)了非常明顯的下降，說(shuō)明該免疫M(jìn)NPs在4 ℃冰箱中至少可保存一周。導(dǎo)致其保存效果降低的原因，可能是保存溫度、物理狀態(tài)、保存液的成分和抗體的光敏感性引起的PAb生物活性的降低，從而導(dǎo)致免疫M(jìn)NPs的偶合度下降［25］。

2.8 免疫M(jìn)NPs用量對(duì)吸附效率的影響

按照1.3.3.2節(jié)方法，記錄24 h之后上層清液的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)后，計(jì)算出吸附效率如圖8所示，5 個(gè)添加量的免疫M(jìn)NPs對(duì)沙門(mén)氏菌的平行3 次吸附效率平均值分別為82.81%、86.56%、89.50%、95.32%、95.56%，隨著免疫M(jìn)NPs使用量的增加使其對(duì)細(xì)菌的吸附能力增強(qiáng)。當(dāng)免疫M(jìn)NPs的使用量達(dá)到80 μL時(shí)，吸附效率達(dá)到95.32%，而100 μL的免疫M(jìn)NPs的吸附效率僅比80 μL時(shí)增加0.24%，吸附效果未并達(dá)到顯著增加?？紤]經(jīng)濟(jì)效益最優(yōu)原則，選擇80 μL免疫M(jìn)NPs吸附100 μL沙門(mén)氏菌菌液（104CFU/mL）。通過(guò)類(lèi)比可得，當(dāng)最優(yōu)條件下制備的的免疫M(jìn)NPs與104CFU/mL沙門(mén)氏菌菌液的體積比為4∶5時(shí)其吸附效率可達(dá)到95.32%。

2.9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸附效率的影響

如圖9所示，6 個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間的平行3 次吸附效率平均值分別為75.70%、85.58%、89.56%、94.36%、94.84%、94.84%，隨著免疫M(jìn)NPs與沙門(mén)氏菌結(jié)合時(shí)間的增加，吸附效率不斷增加，當(dāng)免疫M(jìn)NPs吸附沙門(mén)氏菌反應(yīng)時(shí)間為40、50、60 min時(shí)，其吸附效率的平均值變化并不明顯，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間達(dá)50 min時(shí)，該反應(yīng)體系能夠吸附最多數(shù)量的目標(biāo)菌，吸附效率達(dá)到最大值94.84%，時(shí)間過(guò)短免疫M(jìn)NPs與沙門(mén)氏菌結(jié)合不充分。而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間40 min時(shí)，吸附效率已經(jīng)達(dá)到94.36%，考慮到時(shí)間過(guò)長(zhǎng)細(xì)菌有可能死亡或脫離免疫M(jìn)NPs，故選擇40 min作為免疫M(jìn)NPs吸附沙門(mén)氏菌的最佳時(shí)間。

3 結(jié) 論

免疫M(jìn)NPs以其能快速、高效富集分離沙門(mén)氏菌的能力，具有巨大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)共沉淀法制備了羧基化MNPs，通過(guò)對(duì)羧基化MNPs與PAb偶合及免疫M(jìn)NPs高效富集分離腸炎沙門(mén)氏菌的條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步對(duì)免疫M(jìn)NPs富集分離沙門(mén)氏菌的最佳效率進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在偶合羧基化MNPs與PAb的過(guò)程中，當(dāng)加熱環(huán)境為37 ℃水浴加熱、羧基化MNPs （51.7 μg/mL）與EDC/NHS（0.4 mol/L/0.1 mol/L）、PAb（1.0 mg/mL）的體積比為1∶2∶2時(shí)具有最佳偶合效率。再者，在免疫M(jìn)NPs富集分離腸炎沙門(mén)氏菌（104CFU/mL）的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸炎沙門(mén)氏菌稀釋液濃度為104CFU/mL、兩者的體積比為4∶5，孵育40 min時(shí)具有最大吸附效率，為94.36%。經(jīng)上述條件優(yōu)化后，大大提升了免疫M(jìn)NPs富集分離沙門(mén)氏菌的能力，使其更加高效、便捷。

參考文獻(xiàn)：

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613029 10.7506/spkx1002-6630-201613029. http://www.spkx.net.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：R155.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0162-06

收稿日期：2015-09-17

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303084）

作者簡(jiǎn)介：胡雨欣（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c控制。E-mail：627649521@qq.com

*通信作者：劉霞（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称贩治觯称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：liuxiaspr@aliyun.com

Enrichment and Isolation of Salmonella enteritidis by Immune Magnetic Nanoparticles

HU Yuxin， ZHENG Shu， HE Zao， LUO Fang， LIU Xia*
（Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology， College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract:In this study， carboxyl-coated magnetic namoparticles （MNPs） were prepared using a chemical coprecipitation method.The coupling conditions for conjugates （immune MNPs） of MNPs and anti-Salmonella polyclonal antibody （PAb）were optimized， and then the application of immune MNPs in the enrichment and isolation of Salmonella enteritidis was evaluated， which will provide a more fast and effective way for the detection of Salmonella.The results showed that the optimal coupling of MNPs and PAb was achieved when the volume ratio of 51.7 μg/mL MNPs to 0.4 mol/L EDC-0.1 mol/L NHS to 1.0 mg/mL PAb was 1:2:2 in a water bath at 37 ℃ for 40 min.The adsorption efficiency attained 94.36% when the volume ratio between 51.7 μg/mL immune MNPs and 104CFU/mL S.enteritidis was 4:5， and the incubation time was 40 min.

Key words:immune magnetic namoparticles； Salmonella enteritidis； enrichment and separation