黃　明，趙懿琛，趙德剛*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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小黃姜組培快繁技術(shù)研究

黃明1，趙懿琛2*，趙德剛1*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

以貴州省六盤(pán)水市特產(chǎn)小黃姜莖尖為外植體，進(jìn)行了組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究。結(jié)果表明：消毒時(shí)間對(duì)莖尖成活率影響很大，以0.1%HgCl2消毒15 min最有效。篩選出了不定芽分化的最適培養(yǎng)基 (MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L)，實(shí)現(xiàn)了小黃姜的繼代和增殖同步化，組培苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土與珍珠巖為3∶1的混合基質(zhì)中生長(zhǎng)，成活率達(dá)到94%。

六盤(pán)水小黃姜; 莖尖; 組培快繁

姜 (ZingiberOfficinale.，染色體為2n=2x=22) 屬多年生單子葉草本植物，生產(chǎn)上為單季栽培[1]；它在植物分類學(xué)上屬于姜科、姜屬，又稱黃姜、生姜等，是具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥食兩用植物，我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[2]。新鮮的姜中含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、姜辣素、姜油酮、姜烯酚、姜醇和無(wú)機(jī)鹽等，并含有人體需要的多種礦物質(zhì)和維生素[3]，在我國(guó)，生姜是普遍食用的香辛調(diào)味品，素有“菜中之祖的美稱”，其在醫(yī)藥上有增加體溫、除濕祛寒等多種功能[4]。生姜以地下根狀莖繁殖為主，由于長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖，導(dǎo)致姜體內(nèi)積累了多種病毒病菌，浸染生姜的主要病菌主要是植物青枯菌[5]，病毒是煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)[6-7]，在生姜生產(chǎn)過(guò)程中，容易出現(xiàn)姜腐爛病、枯萎病等病害，導(dǎo)致其體內(nèi)過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性下降，從而致使生姜品質(zhì)變劣、產(chǎn)量下降[8-9]。近年來(lái)，應(yīng)用組織培養(yǎng)手段進(jìn)行繁殖，成為了研究的熱點(diǎn)。本文以貴州省六盤(pán)水市當(dāng)?shù)刂饕耘喾N小黃姜為材料，對(duì)小黃姜莖尖分生組織進(jìn)行脫毒、誘導(dǎo)和增殖研究，希望為貴州生姜種苗產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料

貴州省六盤(pán)水市主栽種小黃姜(ZingiberOfficinale)為材料。

1.2方法

1.2.1外植體的獲得

選取塊大、肉厚、顏色黃亮的健壯姜塊為材料，將其洗凈置于珍珠巖中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并保持珍珠巖濕潤(rùn)。至姜芽萌發(fā)到1～2 cm時(shí)，將姜芽切下作為接種材料的外植體[10-11]。將切取的姜芽用自來(lái)水沖洗干凈，然后用75%酒精消毒1 min，用無(wú)菌水沖洗3～4遍，接著用0.1%升汞溶液消毒，消毒時(shí)間設(shè)4個(gè)梯度 (5 min，10 min，15 min，20 min)。最后再用無(wú)菌水沖洗4～5遍。用滅菌后的吸水紙吸干表面水分后，切取5 mm大小的芽尖接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2培養(yǎng)基及條件

以MS為基本培養(yǎng)基[12]，添加不同濃度的激素作為誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基。4種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方分別為：1號(hào)：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L, 2號(hào)：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，3號(hào)：MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L, 4號(hào)：MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。增殖與生根同步培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L。以上培養(yǎng)基均添加3.0%蔗糖、0.7%瓊脂，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度26～28℃，每次接種暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，每天連續(xù)光照14 h[13]。

1.2.3煉苗與移栽

姜的組培苗在增殖與生根同步培養(yǎng)基上生長(zhǎng)45天左右后，根長(zhǎng)大約4～6cm，打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋并加入少量的水，在室溫下煉苗8 d，然后小心取出組培苗，沖洗干凈根上附著的培養(yǎng)基。幼苗經(jīng)煉苗后移栽到營(yíng)養(yǎng)土、珍珠巖、營(yíng)養(yǎng)土+珍珠巖為3∶1的三種基質(zhì)中，30天后統(tǒng)計(jì)成活率。

2　結(jié)果與分析

2.1不同消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

在植物無(wú)菌組織培養(yǎng)實(shí)踐中，對(duì)外植體消毒時(shí)間不夠，就會(huì)有細(xì)菌或真菌污染，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，又會(huì)造成消毒劑對(duì)外植體的毒害造成死亡。本研究對(duì)小黃姜外植體以0.1% HgCl2作 5、10、15和20 min的 4個(gè)不同時(shí)間處理，在培養(yǎng)40天時(shí)，結(jié)果是以消毒15min的處理的成活率最高。達(dá)到65.7%，外植體污染率明顯比處理5 min和10 min的少，為17.1%；消毒10 min的成活率為25.8%，污染率卻高達(dá)58.1%；消毒20 min處理的污染率雖然很低，才4.0%，但成活率也最低，僅8.0%。5 min的消毒處理時(shí)間過(guò)短，也因污染率很高(90.9%)造成死亡率增加，成活率僅為9.1%(見(jiàn)表1)。因此，小黃姜芽作為外植體以0.1%HgCl2消毒至少需15 min以上為宜，超過(guò)20 min又會(huì)因HgCl2毒害影響成活率。

表1　0.1% HgCl2消毒處理對(duì)小黃姜莖尖外植體污染率、成活率的影響

2.2不同激素配比對(duì)小黃姜不定芽分化的影響

無(wú)菌條件下培養(yǎng)小黃姜莖尖4周以后，莖尖基部逐漸膨大，達(dá)到原來(lái)體積的7～8倍后，外植體脫分化細(xì)胞分裂形成愈傷組織，然后再分化出綠色不定芽。在不同激素配比的培養(yǎng)基上，不定芽分化數(shù)量差別很大，在設(shè)置的4種激素配比培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)30天時(shí)，分化率分別為66%、47%、57%和73%，其中以4號(hào)培養(yǎng)基不定芽分化的效果最好(見(jiàn)表2)。

表2　不同激素濃度對(duì)小黃姜不定芽分化的影響

2.3試管苗快繁技術(shù)

從外植體不定芽的莖基部0.5～1 cm處切下不定芽，轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基(MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L)上進(jìn)行繼代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根，35 d后進(jìn)行二代繼代苗的增殖，45 d時(shí)，試管苗生長(zhǎng)茂盛，植株高度接觸到瓶蓋時(shí)，進(jìn)行煉苗移栽，實(shí)現(xiàn)增殖和生根的同步化，提高了快繁的效率(圖3)。

圖1　小黃姜的組培快繁過(guò)程Fig.1　The process of tissue culture and rapid propagation of small yellow ginger

注: A: 莖尖培養(yǎng); B: 莖尖生芽, 幼芽在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d; C: 幼芽增殖, 增殖培養(yǎng)基20 d; D: 幼芽增殖, 增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d; E: 生根壯苗, 在增殖與生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)32 d; F: 生根壯苗, 在增殖與生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)38 d; G: 生根壯苗, 在增殖與生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)45 d; H: 組培苗移栽花盆中生長(zhǎng)。

2.4煉苗與移栽

在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d后，打開(kāi)瓶蓋，在室溫下煉苗8 d后移栽到不同基質(zhì)中，移栽后30 d統(tǒng)計(jì)成活率，以營(yíng)養(yǎng)土與珍珠巖按3∶1混合的基質(zhì)種植組培苗最佳，成活率達(dá)到94%；其次是珍珠巖，成活率為87%；僅營(yíng)養(yǎng)土基質(zhì)移栽的苗成活率最差，為73%。

3　小結(jié)與討論

近三十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)生姜脫毒脫菌快繁技術(shù)研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。在澳大利亞等國(guó)已進(jìn)入了商品化生產(chǎn)階段。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)生姜快繁技術(shù)的報(bào)道不斷增多。黃菊輝等[14]人認(rèn)為NAA和6-BA能夠促進(jìn)生姜幼芽的發(fā)生，且具有相互增益的效果。唐玉明等[15]報(bào)道，相比于加入KT的培養(yǎng)基，加入6-BA的培養(yǎng)基能夠更有效的誘導(dǎo)愈傷組織。葛勝娟[16]的研究也進(jìn)一步證實(shí)，在添加不同激素的培養(yǎng)基中，NAA和6-BA的組合能夠更好的促進(jìn)生姜幼芽的分化和增殖。說(shuō)明培養(yǎng)基中激素種類和濃度對(duì)生姜快繁有顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在NAA濃度相同的情況下，當(dāng)添加的6-BA濃度由1.5 mg/L逐漸增加到3.5 mg/L時(shí)，不定芽的分化率顯著提高，但當(dāng)6-BA的濃度繼續(xù)增加時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致組培苗畸形，弱苗數(shù)增多[13]，因此6-BA的濃度在3.5 mg/L時(shí)比較適宜，生姜在組培的過(guò)程中很容易長(zhǎng)根。吳家麗[17]和雷開(kāi)榮[18]都認(rèn)為在生姜組培快繁時(shí)增殖和生根可以同步進(jìn)行，增殖和生根的同步化，可以縮短培養(yǎng)時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)成本。此外，在生姜組培快繁中，做好消毒滅菌工作尤其重要。 本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)貴州省六盤(pán)水市小黃姜組培技術(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)適宜的外植體消毒時(shí)間為0.1% HgCl2處理15 min，不定芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，繼代與增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖與生根同步培養(yǎng)。小黃姜煉苗移栽以營(yíng)養(yǎng)土和珍珠巖按3∶1混合最好。利用本研究的組培技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)小黃姜脫毒脫菌種苗的快速繁殖。

作者貢獻(xiàn)：黃明是本研究的執(zhí)行人，完成試驗(yàn)研究、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，論文初稿寫(xiě)作；趙懿琛是項(xiàng)目主持人，負(fù)責(zé)項(xiàng)目設(shè)計(jì)及論文修改。趙德剛負(fù)責(zé)參與論文構(gòu)思與修改。全體作者都閱讀并同意最終文本的發(fā)表。

致謝：感謝貴州省科技廳-貴州大學(xué)聯(lián)合基金(黔科合LH字[2014]7678)對(duì)本項(xiàng)目的資助。

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Rapid Propagation of Small Yellow Ginger

HUANGMing1,ZHAOYi-chen2*,ZHAODe-gang1*

(1.TheKeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation),InstituteofAgro-BioengineeringandCollegeofLifeSciences,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.SchoolofPharmaceuticalSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,Ghina)

In order to investigate microprogation of ginger, we used Liupanshui small yellow ginger(ZingiberOfficinale) shoot tip as the explant for this study. According to the results, the proper sterilization time was important for the survival rate of the shoot tip, disinfection in 0.1% HgCl2for 15 min give the best survival rate. The best medium of adventitious buds propagation was MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L. We achieved the subculture micropropagation. The shoot plantlets were transplanted into nutrient soil : perlite with 3∶1 mixing matrix, the survival rate of the plantlet reached 94%.

Liupanshui small yellow ginger; shoot tip; tissue culture

1008-0457(2016)03-0063-03國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.012

；修回日期：資助項(xiàng)目：貴州省科技廳-貴州大學(xué)聯(lián)合基金(黔科合LH字[2014]7678)。

趙懿琛(1987-)，女，副教授，主要研究方向：植物分子生物學(xué)、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫，E-mail: z.yichen@yahoo.com;趙德剛(1961-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：植物生理與分子生物學(xué)，E-mail: dgzhao@gzu.edu.cn。

Q812

A