李昂++劉晨陽++王子鈺++李欣陽++那杰

摘 要：蛇足石杉由于能治療阿爾茨海默病（AD）等疾病，因而具有特殊的藥用價值，日益受到國內(nèi)外的關(guān)注。本文綜述了近年來蛇足石杉藥用有效成分如生物堿、三萜化合物等的藥理作用及其分離提取工藝，總結(jié)了其在醫(yī)學(xué)、基因工程領(lǐng)域的研究進(jìn)展，為蛇足石杉藥用有效成分可持續(xù)利用研究提供參考。

關(guān)鍵詞：蛇足石杉；藥用有效成分；基因

中圖分類號：R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.007

Abstract： Huperzia serrata has been drawing increasing concerns from home and abroad for its special medicinal value in treating Alzheimer's Disease （AD） and other diseases. Pharmacological effects and process of separation and purification of its effective ingredients such as huperzia seratta alkaloids and triterpenoid compound in recent years were illustrated in this paper. Furthermore， its research progress in fields of medicine， genetic engineering was summarized， aiming to provide references for sustainable utilization of effective medicinal ingredients in Huperzia serrata.

Key words： Huperzia serrata； medicinal active ingredients； gene

珍稀蕨類植物蛇足石杉（Huperzia serrata （Thunb. ex Murray）Trev.）為石杉科多年生草本植物，又稱千層塔、蛇足草、山芝、金不換等。在我國主要分布于福建、兩廣、東北和長江流域等地區(qū)，在朝鮮、日本、大洋洲、美洲中部也有分布。在我國民間，多作跌打損傷、毒蛇咬傷、精神分裂、肌肉痙攣和其它疾病的中藥材[1]。數(shù)十年來，國內(nèi)外學(xué)者對蛇足石杉中石杉堿甲（Huperzine-A，Hup-A）藥理作用的廣泛關(guān)注，促進(jìn)了對其相關(guān)藥用有效成分的研究。本研究對蛇足石杉中多種藥用有效成分及其藥理作用、基因工程的研究進(jìn)行整理歸納，為蛇足石杉有效成分可持續(xù)利用提供參考。

1 蛇足石杉的有效成分

蛇足石杉的有效成分主要有生物堿、三萜類化合物和黃酮類化合物等，相關(guān)研究主要集中在生物堿上。

1.1 生物堿

1972年，沈文照等首次報道石杉堿甲具有橫紋肌松弛作用后，引發(fā)對蛇足石杉生物堿的全面研究[2]，目前已分離并鑒定90多種。蛇足石杉生物堿屬于一種石松生物堿。加拿大科學(xué)家Ayer[3]根據(jù)石松生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)將其分為lycopodine型、lycodine型、fawcettimine型和miscellaneous型4種類型。迄今為止，從蛇足石杉分離得到的生物堿大多數(shù)屬于fawcettimine型石松生物堿，而具有抑制乙酰膽堿脂酶（AChE）活性的生物堿如Hup-A等則屬于lycodine型石松生物堿，且Hup-A的含有量在蛇足石杉全草甚微，因此新的研究熱點主要集中在Hup-A類似物的人工合成和蛇足石杉體內(nèi)其它具有抑制AChE活性生物堿結(jié)構(gòu)改造上。在對蛇足石杉全草的有效成分含量研究中，Hup-A含量最高出現(xiàn)在葉，莖和根中的含量則較低[4]。全草中Hup-A含量隨季節(jié)變化而變化，12月>9月>6月>3月[5]。Hup-A含量因產(chǎn)地不同略有不同，提取工藝對其含量影響甚微。

1.2 三萜類化合物

蛇足石杉三萜是具有多種結(jié)構(gòu)類型及豐富生物活性的石杉科植物三萜類物質(zhì)的代表化合物，又稱鋸齒石松烷三萜。此外，蛇足石杉三萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于特殊的五環(huán)三萜，且骨架C環(huán)為七元環(huán)。按照五環(huán)骨架上含氧官能團(tuán)的數(shù)量，可以分為二醇（diol）類、三醇（triol）類、多醇類3種類型。目前已分離得到千層塔尼醇、16氧千層塔三醇、千層塔萜二醇、21氧千層塔萜烯三醇和千層塔三醇等30多種[6]。雖然多種三萜類化合物在蛇足石杉中被分離出來，但目前的研究主要集中在其分離及生理活性的研究上，有關(guān)生物合成途徑的報道較少。

1.3 其他成分

黃酮類化合物和甾體等藥用有效成分也被從蛇足石杉中分離得到。魯翠濤等[7]初步確定蛇足石杉中的黃酮類物質(zhì)主要為黃酮類和黃酮醇類，馬燮等[8]測得蛇足石杉全草含0.879%的總黃酮類化合物。應(yīng)用波譜分析技術(shù)，蔣金和等[9]實現(xiàn)了蛇足石杉中的β-谷甾醇和胡蘿卜甙的鑒定。

2 蛇足石杉藥用有效成分的提取工藝

蛇足石杉藥用有效成分含量極低，因此其提取和分離純化方法的選擇尤為重要。

2.1 生物堿的提取與純化

蛇足石杉生物堿的提取方法主要有以下幾種：（1）酸提法。用2%HCl提取蛇足石杉生藥粗粉中的總生物堿，獲得Hup-A。（2）醇法。大多數(shù)生物堿溶于酯溶性溶劑氯仿或甲醇、乙醇等，因此可用95%乙醇提取蛇足石杉全草中的生物堿。（3）超聲提取法。應(yīng)用超聲波的空化作用，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高小分子物質(zhì)溶出速度和溶出次數(shù)，縮短提取時間。查圣華等[10]采用超聲提取法提取Hup-A和Hup-B，不但提取時間由2 h縮短到15 min，提取率也提高了10%。（4）微波輔助法。微波加熱使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞和裂紋，胞外的溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞，溶解并釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，從而有效提高提取效率。（5）酶法。纖維素酶能夠破壞以纖維素為主的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間的果膠，使植物中果膠完全溶解成小分子物質(zhì)，減小提取中的阻力，充分釋放胞內(nèi)物質(zhì)。該法簡便快捷，提取率高。

氯仿試劑萃取法是純化蛇足石杉中的生物堿的傳統(tǒng)方法。生物堿在中性或酸性溶液中以正離子形式存在，用陽離子交換樹脂吸附和富集，再進(jìn)行洗脫，可以達(dá)到分離純化目的。查圣華等[11-13]采用大孔樹脂固相萃取法來純化Hup-A和Hup-B。而李俊等[11]則采用陽離子交換樹脂法來分離純化Hup-A，在不同型號的樹脂中C004樹脂的吸附和解吸效果最好。

蛇足石杉生物堿含量測定主要利用高效液相色譜法（HPLC）。孫遠(yuǎn)明等[12]采用該法測得蛇足石杉中Hup-A的含量約為0.2‰，明顯高于高效薄層掃描法測得的結(jié)果（0.066‰）[13]。

2.2 三萜化合物的提取分離

提取分離蛇足石杉三萜類化合物的方法主要有以下幾種：（1）乙醇提取法[14]。用蛇足石杉全草，經(jīng)95%乙醇提取，提取物用5%HCl溶液和乙醚分離。乙醚提取物依次用石油醚和二氯甲烷抽提。石油醚部分經(jīng)硅膠柱層析，分離出serratenediol-21-acetate、21-episerratenediol-3-acetate、serratenediol-3-acetate3種三萜化合物。二氯甲烷部分也經(jīng)硅膠柱層析，分離得到21-episerratenediol、serratenediol、16-oxodiepiserratenediol3種三萜化合物。（2）酒石酸法[9]。將蛇足石杉全草粉末在2%的酒石酸水溶液里提取6次，獲得酸提取物。飽和碳酸氫鈉溶液將其堿化至pH=10，用氯仿萃取分離，經(jīng)硅膠柱層析和重結(jié)晶得serratenediol、21-epi-serratenediol和serratenediol-3-acetate3種三萜化合物。

2.3 黃酮類化合物的提取與純化

蛇足石杉黃酮類化合物提取的方法有以下幾種。（1）微波提取法。利用磁控管所產(chǎn)生的超高頻率震動，使材料內(nèi)分子相互碰撞、擠壓，利于有效成分的浸出。此法反應(yīng)高效、選擇性強、操作簡單、副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高、產(chǎn)物易提純。余紅英等[15]證實該方法最佳提取條件為輻射時間30 s，微波功率650 W，乙醇濃度90%，料液比1∶50（W/V），總黃酮提取率可達(dá)16.651 mg·g-1。（2）有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)黃酮類化合物與雜質(zhì)極性不同來選擇適合的有機(jī)溶劑，如用60%乙醇提取蛇足石杉總黃酮，提取率可達(dá)1.262 6%。

依據(jù)蛇足石杉黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上的酚羥基及其還原性羰基能夠與金屬鹽試劑形成有色絡(luò)合物的原理，常用分光光度法測定黃酮類化合物的含量，該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確。

3 蛇足石杉的主要藥理作用

臨床上，蛇足石杉可用于治療阿爾茨海默?。ˋD）、血管性癡呆、記憶障礙、小兒智力發(fā)育遲緩、重癥肌無力、腦卒中后的尿失禁等疾病，其中最具藥用價值的有效成分為Hup-A。Hup-A又名福定堿，商品名為雙益平、哈伯因。藥理研究顯示，它是一種同時具有純天然性、高選擇性及可逆性抑制中樞AChE藥劑，與他克林（Tacrine）、多奈哌齊（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）及加蘭他敏（Galantamine）4種美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的膽堿酯酶抑制劑作比較，具有作用時間久、口服生物效率高、易穿過血腦屏障、副作用小等特點，是治療AD的特效藥劑[16]。

3.1 抑制乙酰膽堿酯酶作用

1986年，王月娥等[17]首次報道從蛇足石杉提取的Hup-A對膽酰酯酶活力有抑制作用，且對AChE的抑制作用可逆。Hup-A能與AChE的Tyr337形成結(jié)合速度快而解離速度慢且親和力強的AChE-Hup-A復(fù)合物，此位點僅在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)。Hup-A依靠這種獨特的結(jié)合方式高效選擇性地抑制哺乳動物的AChE[18]。Hup-A具有比其它同類抑制AChE藥劑更持久性的特點，由于其可產(chǎn)生一種獨特的連接Gly117和Gly118的具有擋板作用的肽鍵（僅通過連接Hup-A而介導(dǎo)）。

3.2 對抗毒性作用

有機(jī)磷化合物具有不可逆抑制中樞和外周的AChE作用，是一類對神經(jīng)系統(tǒng)有劇烈傷害性的毒劑。Hup-A通過與AChE可逆的結(jié)合阻斷其與有機(jī)磷不可逆的結(jié)合而對抗有機(jī)磷中毒。通過穿過血腦屏障到達(dá)大腦的途徑，Hup-A能達(dá)到切斷AChE與有機(jī)磷不可逆的結(jié)合作用。有研究稱，血漿中可能存在內(nèi)源性有機(jī)磷清除劑，是丁酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的可能性較大。丁酰膽堿酯酶與AChE差異甚微，Hup-A仍能選擇性抑制血漿紅細(xì)胞中AChE，而無抑制丁酰膽堿酯酶作用。Hup-A這種高選擇性且對有機(jī)磷中毒有預(yù)防的作用，顯示其在預(yù)防化學(xué)武器方面的潛在價值[19]。

Hup-A還具有抑制谷氨酸鹽毒性功效。谷氨酸鹽可造成鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度過高而致死。Hup-A對抗谷氨酸鹽中毒機(jī)制可能是阻斷信號向通路下游的傳遞，也可能是由于有谷氨酸受體介導(dǎo)的參與[20]。研究發(fā)現(xiàn)：Hup-A對NO供體導(dǎo)致人神經(jīng)細(xì)胞瘤SK-N-SH系細(xì)胞的生長有抑制作用，并誘導(dǎo)凋亡；Hup-A不僅能抑制小鼠膠質(zhì)細(xì)胞NO的產(chǎn)生，也能抑制人和鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞NO的產(chǎn)生[21]。

β-淀粉樣肽（Aβ）的神經(jīng)毒性作用使氧自由基增加，導(dǎo)致?lián)p傷神經(jīng)細(xì)胞膜和線粒體DNA而致使AD病發(fā)[22]。Hup-A通過提高抗氧化酶活力來對抗Aβ產(chǎn)生的毒性。研究發(fā)現(xiàn)，添加Hup-A的實驗組降低了Aβ所導(dǎo)致的毒性，同時細(xì)胞存活率及抗氧化酶活力明顯提升，丙二醛水平下降。

4 蛇足石杉有效成分的基因工程研究

蛇足石杉由于生存環(huán)境的特殊性造成其生長緩慢，周期長。目前該資源處于瀕臨滅絕的狀態(tài)，由于所含Hup-A具有的顯著藥理作用而導(dǎo)致巨大的市場效益，故野生蛇足石杉被人為大量采掘和破壞。龐大的市場需求使得自然生長的蛇足石杉遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足。一些學(xué)者嘗試尋求新途徑獲取蛇足石杉有效成分，但植物組織培養(yǎng)技術(shù)難度大，易染菌，成活率低；化學(xué)合成技術(shù)成本高，臨床效果差。解決資源短缺和實現(xiàn)新途徑生產(chǎn)蛇足石杉有效成分，基因工程成為提高蛇足石杉有效成分產(chǎn)量的有效途徑之一。

4.1 Hup-A生物合成途徑關(guān)鍵酶的克隆

研究表明，Hup-A的生物合成是以賴氨酸脫羧酶（Lysine decarboxylase，LDC）介導(dǎo)賴氨酸脫羧開始，再由銅氨氧化酶（Copper amine oxidase，CAO）催化尸胺生成四氫吡啶（2，3，4，5-Tetrahydropyridine），最后經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成Hup-A[23-24]。

參與Hup-A生物合成的第一個酶是LDC，杜次等從蛇足石杉克隆獲得2個賴氨酸脫羧酶基因LDC1和LDC2，兩基因同源性高達(dá)95%[25]。與野芭蕉、玉米、擬南芥等高等植物L(fēng)DC蛋白氨基酸序列的比對和分析顯示，蛇足石杉LDC蛋白的氨基酸序列與它們具有較高同源性。通過預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)及構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)LDC1與LDC2有相同的生物活性。而證明LDC1與LDC2具有催化賴氨酸脫羧生成尸胺的生物活性可通過重組賴氨酸脫羧酶的活性實驗來實現(xiàn)。

Sun等[26]從蛇足石杉中克隆得到銅氨氧化酶基因HsCAO，它能夠通過大腸桿菌中的異源表達(dá)，并且催化尸胺生成四氫吡啶。它是Hup-A的生物合成途徑中的第2個酶。與其它物種的氨基酸序列的比對和分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與已知物種的氨基酸序列達(dá)到44%～56%的相似度，也存在CAO蛋白特有的Asn-Tyr-Asp/Glu活性位點。通過分子遺傳進(jìn)化分析親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn)，與小立碗蘚在親緣上具有較近關(guān)系，與植物起源進(jìn)化關(guān)系相一致。

Ⅲ型聚酮合酶（Type Ⅲ polyketide syhthases，PKSs）中的查爾酮合酶超家族（CHS superfamily）能催化產(chǎn)生如生物堿、類黃酮等植物次生代謝產(chǎn)物。張萍[27]克隆蛇足石杉中的Ⅲ型聚酮合酶（查爾酮合酶超家族）基因HsPKS1與HsPKS2，其氨基酸序列與其它植物同源性可達(dá)到44%～66%。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HsPKS1與HsPKS2基因編碼的蛋白具有PKSs典型的催化活性中心—Cys-His-Asn。

4.2 萜類生物合成途徑關(guān)鍵酶的克隆

蛇足石杉中萜類化合物分為胞質(zhì)中的甲羥戊酸（MVA）途徑和質(zhì)體中的1-脫氧-D-木桐糖-5-磷酸/2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（DXP/MEP）途徑合成的。

殷秀梅[28]，羅紅梅等[29]克隆了蛇足石杉MVA途徑中的法呢基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）基因HsFPS1、鯊烯合酶（Squalene synthase，SQS）HsSQS1、鯊烯環(huán)氧酶（Squalene epoxidase，SE）HsSE1和環(huán)阿屯醇合成酶（Cycloartenol synthase，CAS）基因HsCAS1，并運用生物信息學(xué)法對這些基因進(jìn)行了分析和預(yù)測。氨基酸序列同源性比對數(shù)據(jù)表明，HsFPS1、HsSQS1、HsSE1、HsCAS1蛋白的氨基酸序列與其他物種中這些蛋白的氨基酸序列具有較高相似性，在蛇足石杉的根、莖和葉均有表達(dá)。其中，在莖中HsSE1基因的表達(dá)量最高，而在根中其他3個基因表達(dá)量最高。

羅紅梅等[30]克隆蛇足石杉DXP/MEP途徑中的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）基因HsDXR1。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HsDXR1的蛋白具有DXR蛋白的特有保守結(jié)構(gòu)域及酶結(jié)合的活性位點。實時熒光定量試驗顯示，HsDXR1蛋白在蛇足石杉莖中的表達(dá)量最高。

5 結(jié)論及展望

蛇足石杉作為一種古老的蕨類植物，具有悠久的藥用歷史。隨著蛇足石杉藥用有效成分不斷被提取分離出來，有效成分合成途徑的研究受到了越來越多的關(guān)注。目前，研究有效成分的合成途徑主要利用分子生物學(xué)手段，這預(yù)示著不久的將來其生物合成途徑和分子作用機(jī)制將全面被解釋清楚，蛇足石杉在基因工程領(lǐng)域的研究及其藥用有效成分的利用也將獲得全面的發(fā)展。

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