劉雙清王 翀張 亞廖曉蘭，4*馬文月柏連陽

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；3湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙 410128；4湖南省生物農(nóng)藥與農(nóng)藥制劑加工工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128）

湖南省草莓灰霉病菌遺傳多樣性研究

劉雙清1，2王 翀3張 亞1*廖曉蘭1，2，4*馬文月1柏連陽1

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；3湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙 410128；4湖南省生物農(nóng)藥與農(nóng)藥制劑加工工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128）

為探明湖南省草莓灰霉病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)、分化及變異規(guī)律，采用熒光標(biāo)記技術(shù)對湖南省9個(gè)地理菌群的180株草莓灰霉病菌基因組DNA進(jìn)行SSR分析。結(jié)果表明：9對SSR引物共檢測到56個(gè)觀察等位基因（Na），平均值為6.22；有效等位基因（Ne）為1.27～4.89，平均值為3.44；不同位點(diǎn)的基因多樣性指數(shù)（H）為0.21～0.80，平均值為0.65；不同位點(diǎn)Shannon's信息指數(shù)（I）為0.37～1.83，平均值為1.34。供試180株樣品9個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)上多態(tài)性信息量PIC變化范圍為0.13～0.91，不同位點(diǎn)PIC差異大，這一規(guī)律與I和H基本一致。不同SSR位點(diǎn)總的遺傳多樣性（Ht）為0.21～0.77，平均值為0.65；群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）為0.19～0.50，平均值為0.40；遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.10～0.46，平均值為0.37；基因流（Nm）為0.58～4.47，平均值為1.16。不同地理菌群平均觀察等位基因（Na）、有效等位基因數(shù)目（Ne）分別為2.93和2.07，Shannon's信息指數(shù)（I）平均為0.67，基因多樣性指數(shù)（H）平均為0.40，平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（NP）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）分別為6.78和75%。依據(jù)不同地理菌群之間的遺傳距離（0.279 7～1.922 5），將供試湖南省9個(gè)地理菌群分為4大類：第Ⅰ大類主要由長沙、邵陽、岳陽、衡陽、張家界、湘潭種群組成；第Ⅱ大類主要由郴州種群組成；第Ⅲ大類主要由株洲種群組成；第Ⅳ大類由常德種群組成?？傊鲜「鞯夭葺颐共【后w遺傳多樣性豐富，但地理群體間差異小，病菌遺傳變異主要來自群體內(nèi)部，不同地區(qū)間存在病菌的移動。

湖南省；草莓灰霉病菌；遺傳多樣性；SSR標(biāo)記

草莓灰霉病是草莓的重要病害之一，是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，該病菌既有致病性也有腐生性，寄主范圍廣泛，可為害黃瓜、番茄、辣椒等200多種寄主植物，每年造成的損失可達(dá)10%～30%，嚴(yán)重的甚至達(dá)到89% （Ugolini et al.，2014）。草莓灰霉病菌不僅適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖速度快、菌源量大，而且易受外界環(huán)境條件的影響發(fā)生變異，往往難以控制（Rosslenbroich & Stuebler，2000）。因此，研究草莓灰霉病菌遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化、遺傳變異以及與地理、氣候、品種、管理等因素的關(guān)系，成為明確草莓灰霉病菌起源、演化規(guī)律、傳播規(guī)律以及制定防控方案的關(guān)鍵問題。近年來，國內(nèi)外許多研究開始關(guān)注草莓灰霉病菌的多樣性研究。Ma和Michailides（2005）利用MP-PCR技術(shù)研究了美國佛羅里達(dá)州不同寄主上灰霉病菌菌群遺傳結(jié)構(gòu)，認(rèn)為不同寄主上灰霉病菌分化程度高，一些菌群不能聚集一起，而且菌群重組方法不一致。余文貴等（2011）研究了江蘇省草莓灰霉病菌的多樣性，認(rèn)為采用SSR技術(shù)聚類的結(jié)果與采集樣本具有高度的一致性，但是其研究不系統(tǒng)，仍有很多指標(biāo)未研究。Isenegger等（2008）利用不同的轉(zhuǎn)座子類型對南亞和澳大利亞地區(qū)灰霉病菌進(jìn)行了多樣性研究，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)灰霉病菌具有地理差異性，而且可以將相似的物種進(jìn)行分類。Walker等（2015）研究認(rèn)為灰霉病菌多樣性與地理特征之間有一定聯(lián)系，但不是必然聯(lián)系，而且與不同地區(qū)的寄主植物也有一定聯(lián)系。Ahmed和Hamada（2005）通過分子標(biāo)記技術(shù)研究了突尼斯不同寄主植物上灰霉病菌的多樣性，并利用轉(zhuǎn)座子方法證實(shí)了存在兩種不同的菌群。

SSR標(biāo)記技術(shù)具有精確度高、可靠性強(qiáng)、簡單、等位點(diǎn)多樣性好等特點(diǎn)，可用于多種植物病原菌的遺傳多樣性研究（沈瑛 等，2004；胡小平 等，2008；徐靜靜 等，2008；趙志堅(jiān) 等，2008）。湖南省處于長江流域地區(qū)，其地理特征和氣候特征顯著不同于其他地區(qū)，各地地形復(fù)雜多樣，氣候濕度較高，極易形成低溫高濕的環(huán)境條件，從而造成草莓灰霉病的發(fā)生和流行。目前，有關(guān)湖南省草莓灰霉病菌多樣性的研究未見報(bào)道，而且已有的研究多采用RAPD技術(shù)，但這種技術(shù)與SSR技術(shù)比較，具有一定的局限性（Moyano et al.，2003）。本試驗(yàn)采用SSR技術(shù)研究湖南省各地草莓灰霉病菌遺傳多樣性，旨在了解灰霉病菌遺傳差異與地理位置之間的關(guān)系，明確病菌遺傳結(jié)構(gòu)和分化程度以及相關(guān)演化規(guī)律，并為今后指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)合理用藥，制定防控方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草莓灰霉病菌菌株分別于2013～2015年每年的2～5月采集自湖南省岳陽、常德、郴州、衡陽、湘潭、株洲、邵陽、長沙、張家界等9個(gè)草莓種植區(qū)，每個(gè)地區(qū)采集20株菌株，共計(jì)180株，草莓灰霉病較重的地塊采集典型草莓灰霉病果。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病樣處理與菌株分離 將采集的病樣帶回湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院植病實(shí)驗(yàn)室，利用單孢分離法，用挑孢針的針尖在產(chǎn)生分生孢子的典型草莓灰霉病病果（也可將待發(fā)病病果組織的一部分置于PSA培養(yǎng)基上，20～23 ℃條件下黑暗培養(yǎng)6～7 d，可產(chǎn)生分生孢子）表面輕輕碰抹一下，粘附孢子，在四方形薄PSA平板培養(yǎng)基（蔗糖19 g，馬鈴薯200 g，瓊脂17 g，水1 000 mL）的對角線輕輕劃一下，將孢子粘附在薄瓊脂平板上，接著將薄瓊脂平板置于顯微鏡下，尋找分散的孢子，用挑孢針的針尖碰觸單個(gè)分生孢子，轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的PSA斜面培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)2～3 d長出單個(gè)菌落，標(biāo)上記號，放入4 ℃冰箱備用（張君成，2008；陸寧海等，2009）。

1.2.2 草莓灰霉病菌基因組DNA提取 采用Fournier等（2002）的方法并做適當(dāng)修改后提取草莓灰霉病菌基因組DNA。主要修改之處為：將新鮮菌絲研磨后迅速將菌液移入1.5 mL的離心管中，于65 ℃下水浴40 min，水浴過程中顛倒3～4 次；加等體積的氯仿∶異戊醇混合液（24 V∶1 V）充分混勻，4 ℃下13 000 r·min-1離心5 min；將上清液移至另一新的離心管中，加 2.5倍體積的冰凍無水乙醇，輕輕搖勻，等沉淀出現(xiàn)后，4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min；棄上清液，沉淀用70%酒精洗滌2～3次，在電烤爐的上方30 cm處烘干，加50～100 μL的TE緩沖液（含10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH=8.0）充分溶解（如果溶解較慢可置于37 ℃水浴器中促溶）；其他方法均相同。

1.2.3 SSR分析 采用熒光標(biāo)記技術(shù)對采集到的湖南省9個(gè)地理菌群的180株草莓灰霉病菌基因組DNA進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，根據(jù)Fournier等（2002）設(shè)計(jì)的SSR引物，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)從10對草莓灰霉病菌引物中篩選出9對多態(tài)性好、條帶清晰穩(wěn)定的引物（表1）用于所有草莓灰霉病菌SSR-PCR擴(kuò)增，所使用的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）2.5 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL， 上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq聚合酶（TAKARA，5 U·μL-1）0.2 μL， 模 板DNA （50 ng·μL-1）1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃終止反應(yīng)。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)3730XL測序儀（美國ABI公司）進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 利用PopGene Version 1.32軟件計(jì)算以下參數(shù)：多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)NP （number of polymorphic loci），多態(tài)位點(diǎn)百分率P （proportion of polymorphic loci），有效等位基因數(shù)目Ne（effective number of alleles），基因多樣性指數(shù)H （gene diversity），Shannon's信息指數(shù)I（shannon'sinformation index），Neis遺 傳 距 離 GD（genetic distances），遺傳分化系數(shù)Gst。另外，通過公式PIC=1-∑Pi2（Pi表示等位基因頻率）計(jì)算多態(tài)性信息量PIC。NTSYSpc-2.11F軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SHAN程序中的UPGMA（Unweighted Pair-Group Mean Average，非加權(quán)算術(shù)平均聚類）方法進(jìn)行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

表1 供試SSR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)遺傳多樣性

由表2可知，9對SSR引物對湖南各地草莓灰霉病菌進(jìn)行檢測共發(fā)現(xiàn)56個(gè)觀察等位基因，其中BC3、BC5、BC6引物擴(kuò)增的觀察等位基因數(shù)最多，達(dá)到9個(gè)，但BC1僅為2個(gè)，位點(diǎn)平均等位基因6.22個(gè)。有效等位基因（Ne）1.27（BC1位點(diǎn)）～4.89 （BC3位點(diǎn)），平均有效等位基因3.44。不同位點(diǎn)的基因多樣性指數(shù)（H）不同，其中BC2、BC3位點(diǎn)值最大，為0.80；BC1位點(diǎn)值最小，為0.21；平均值為0.65。不同位點(diǎn)Shannon's信息指數(shù)（I）差異大，BC3引物的I值最高為1.83，BC1的I值最低為0.37，位點(diǎn)平均值為1.34。供試的180株樣品9個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)上多態(tài)性信息量PIC變化范圍為0.13～0.91，不同位點(diǎn)PIC差異大，這一規(guī)律與I和H基本一致。結(jié)果表明湖南省各地草莓灰霉病菌的遺傳多樣性十分豐富。

表2 各SSR位點(diǎn)在湖南省9個(gè)地理草莓灰霉病菌群的遺傳多樣性和多態(tài)性信息量

2.2 草莓灰霉病菌群體遺傳多樣性水平

由表3可知，不同SSR位點(diǎn)總遺傳多樣性（Ht）范圍為0.21～0.77，平均值為0.65；群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）范圍為0.19～0.50，平均值為0.40；遺傳分化系數(shù)（Gst）范圍為0.10～0.46，平均值為0.37；基因流（Nm）范圍為0.58～4.47，平均值為1.16。其中BC2和BC9標(biāo)記的灰霉病菌群遺傳分化程度大，基因流??；BC1標(biāo)記的菌群遺傳分化程度小，基因流大；BC3標(biāo)記的菌群總遺傳多樣性程度和群內(nèi)遺傳多樣性分別為0.80、0.49，遺傳分化系數(shù)為0.38，基因流為0.82；BC6標(biāo)記的總遺傳多樣性為0.76，但群體內(nèi)遺傳分化程度最高為0.50，遺傳分化系數(shù)為0.34，基因流為0.97；BC4、BC5、BC7、BC10總遺傳多樣性程度介于0.50～0.77之間，群內(nèi)遺傳分化多樣度介于0.28～0.48之間，遺傳分化介于0.36～0.44之間，基因流介于0.64～0.87之間。這表明湖南省草莓灰霉菌不同地理菌群間病原菌相互交流十分頻繁。

表3 各SSR位點(diǎn)內(nèi)湖南省草莓灰霉病菌群體遺傳分化及基因流

2.3 草莓灰霉病菌地理菌群遺傳多樣性

地理菌群遺傳多樣性研究結(jié)果顯示（表4），湖南省草莓灰霉病各地理菌群的遺傳多樣性比SSR位點(diǎn)遺傳多樣性低。從地理菌群水平上分析，平均觀察等位基因（Na）、有效等位基因數(shù)目（Ne）分別為2.93和2.07，Shannon's信息指數(shù)（I）平均為0.67，基因多樣性指數(shù)（H）平均為0.40，平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（NP）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）分別為6.78和75%。長沙菌群Shannon's信息指數(shù)（I）最高，達(dá)到1.29；邵陽菌群次之，為0.91；而常德菌群最低，為0.04，表明地形復(fù)雜的山區(qū)草莓灰霉病菌菌群比地勢平坦地區(qū)的菌群更為豐富、具有更高的遺傳多樣性水平。

表4 湖南省草莓灰霉病菌群地理群體的遺傳多樣性

2.4 不同地理菌群間的遺傳距離和遺傳一致度

如表5所示，湖南省各地草莓灰霉病菌群間的遺傳距離在0.279 7～1.922 5之間，遺傳一致度在0.146 2～0.756 0之間，這說明湖南省各地理菌群間遺傳一致度較低，遺傳分化程度較高。郴州菌群和常德菌群之間的遺傳一致度最小為0.146 2，邵陽菌群和長沙菌群之間的遺傳一致度最大為0.756 0；在遺傳距離上，邵陽菌群和長沙菌群的遺傳距離最低僅為0.279 7，而常德菌群和郴州菌群的遺傳距離較高為1.520 1。說明遺傳距離與草莓灰霉病菌群的地理經(jīng)度無明顯的關(guān)系，但與地理緯度有一定的相關(guān)性，特別是不同地區(qū)小氣候、土壤酸堿度、風(fēng)速、溫濕度、品種以及栽培方式等外界條件可能是導(dǎo)致草莓灰霉病菌菌群遺傳分化的重要因素。

表5 湖南省草莓灰霉病菌不同地理群的遺傳距離和遺傳一致度

2.5 聚類分析

由圖1可知，湖南省9個(gè)地理菌群可以分為4大類。第Ⅰ大類主要由長沙、邵陽、岳陽、衡陽、張家界、湘潭種群組成；第Ⅱ大類由郴州種群組成；第Ⅲ大類由株洲種群組成；第Ⅳ大類由常德種群組成。說明湖南各地菌群分類與地球緯度有一定相關(guān)性，第Ⅱ大類菌群位于緯度的最南端，其次為第Ⅲ大類菌群，第Ⅰ大類菌群位于緯度的偏北端，第Ⅳ大類菌群位于緯度的最北端。第Ⅰ大類菌群由湖南中部偏北的6個(gè)菌群組成，既有地勢較高的山區(qū)，也有地勢較低的平原，說明這些菌群遺傳距離較小，遺傳分化程度低，基因流大，病菌傳播未受到地理阻隔；第Ⅱ大類菌群郴州菌群、第Ⅲ大類菌群株洲菌群與第Ⅳ大類菌群常德菌群的相似性比較低，基因的流動或漂移受到地理?xiàng)l件的阻隔。

圖1 不同草莓灰霉病菌地理菌群的聚類分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)植物病原真菌的多樣性研究主要根據(jù)病原真菌在不同鑒別寄主上的致病性差異進(jìn)行，不屬于生物學(xué)上的自然分類，不能反映遺傳背景，而且不同的鑒別寄主和環(huán)境條件，獲得的結(jié)果差異較大（李亞，2006）。采用SSR技術(shù)分析生物遺傳多樣性具有很多優(yōu)勢，如：不受時(shí)空限制、檢測效率高，其反映的是基因型差異，而且檢測靈敏度高，檢測可信度強(qiáng)，還能降低反復(fù)檢測費(fèi)用，分析量大，特別適合大規(guī)模群體樣品的標(biāo)記（關(guān)玲 等，2011）。

本試驗(yàn)首次采用SSR技術(shù)研究了湖南省各地草莓灰霉病菌的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化規(guī)律、遺傳距離以及聚類概況。結(jié)果顯示，湖南省各地草莓灰霉病菌具有豐富的遺傳多樣性，其中共檢測到56個(gè)觀察等位基因，有效等位基因?yàn)?.27～4.89，多態(tài)性信息量為0.13～0.91，基因多樣性指數(shù)為0.21～0.80，Shannon's信息指數(shù)為0.37～1.83。說明SSR標(biāo)記技術(shù)具有高效性和準(zhǔn)確性，這種微衛(wèi)星標(biāo)記上的差異可以用來分析菌株之間的遺傳關(guān)系。Hovmller等（2008）研究結(jié)果表明：不少因素都可影響植物病原菌的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性，如寄主、基因流、自然選擇、遺傳漂變、交配系統(tǒng)等因素協(xié)同作用，而且不同區(qū)域地理特征也影響植物病原菌的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。在田間草莓灰霉病菌的有性世代很少出現(xiàn)，病菌個(gè)體之間主要依賴無性繁殖，無基因交流，生殖上是隔離的，這不利于遺傳變異，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)湖南省各地的草莓灰霉病菌具有遺傳多樣性，說明這些變異主要來自多樣性的地理特征、強(qiáng)烈紫外線照射、準(zhǔn)性生殖、異核現(xiàn)象、農(nóng)用化學(xué)品的不規(guī)范使用，也可能來自有性雜交（Enjalbert et al.，2005）。

遺傳變異是種群多樣性的重要因素。本試驗(yàn)結(jié)果說明湖南省各地草莓灰霉病菌群體遺傳分化程度不同，其中總遺傳多樣性Ht平均值為0.65，群內(nèi)的遺傳多樣性Hs平均值為0.40，群體內(nèi)遺傳分化系數(shù)Gst平均值為0.37。表明湖南省草莓灰霉病菌的遺傳變異程度低，而且群體內(nèi)存在遺傳分化程度不高，可能各地的遺傳背景或演化路徑有相同之處。湖南省各地草莓灰霉病菌群內(nèi)基因流Nm比較高，平均值為1.16，進(jìn)一步證實(shí)菌群內(nèi)基因交流頻繁，這可能跟草莓灰霉病菌源量大，繁殖快，孢子可借助空氣高空遠(yuǎn)距離傳播，或跟雨水、運(yùn)輸、人員來往，或跟不同莓農(nóng)購買區(qū)域外品種等因素有關(guān)，物種的差異性降低（曹支敏 等，2012）。

本試驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)，湖南省各地理菌群間遺傳多樣性比SSR位點(diǎn)遺傳多樣性低，而且不同地理菌群間信息指數(shù)無規(guī)律。其次，不同菌群間具有較低的遺傳分化和較高的遺傳一致度。這表明菌群間的多樣性與地理特征有一定聯(lián)系，但不是必然聯(lián)系，也可能跟以下幾種因素有關(guān)：① 從群體間分析，在田間草莓灰霉病菌無性繁殖發(fā)達(dá)，幾乎找不到有性生殖體，基因變異的幾率小，保持了種的穩(wěn)定性；② 從群體間分析，整個(gè)湖南省都處于雨區(qū)，全年日照次數(shù)較少，紫外線不足，導(dǎo)致病菌變異的可能性減少；③ 可能跟保護(hù)地栽培方式、品種、復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、獨(dú)立群體等有關(guān)。

聚類分析結(jié)果表明：相同經(jīng)度或緯度的區(qū)域草莓灰霉病菌遺傳相似度高，遺傳距離小，聚為一類。大體上處于同一經(jīng)度下的長沙、邵陽、湘潭、岳陽、衡陽、張家界為一類，可能跟這些地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)，管理水平高、南北人員交往密集、草莓種苗的購買和調(diào)運(yùn)有關(guān)，但邵陽和張家界為何能和其他幾個(gè)地區(qū)聚為一類，畢竟有山脈隔離，理論上應(yīng)該不屬于同一類，可能這些地區(qū)屬于草莓種植新區(qū)，跟草莓引種時(shí)攜帶的病原菌有關(guān)。然而，郴州、株洲、常德地區(qū)則單獨(dú)成群，這些地區(qū)與其他地區(qū)能很好地分開，可能跟當(dāng)?shù)氐臍夂蛱卣?、栽培、抗病品種、傳播、病菌起源有關(guān)。

探明植物病原菌群體動態(tài)及演化規(guī)律對于制定有效防病方案具有重要價(jià)值（王玲 等，2015）。本試驗(yàn)結(jié)果表明湖南省草莓灰霉病菌具有遺傳多樣性，但不同地理群體間多樣性差，說明該地區(qū)變異的草莓灰霉病菌還未形成群體，只是個(gè)體間具有多樣性，其進(jìn)化的水平低，病害防治相對比較容易。盡管從理論上講，草莓灰霉病菌進(jìn)化的幾率慢，但是不少研究證實(shí)草莓灰霉病菌易產(chǎn)生抗藥性，防治草莓灰霉病的任務(wù)刻不容緩。在防治草莓灰霉病策略方面，應(yīng)注意前期清除病原、種植抗病品種、土壤消毒、合理密植、適當(dāng)施肥、經(jīng)常通風(fēng)透光等；其次，還要考慮不同地區(qū)遺傳變異的差異性；另外，注意使用新藥劑或藥劑的混用或輪用，以提高防效，減少經(jīng)濟(jì)損失（李延剛 等，2013）。

曹支敏，杜林，王秦虎，余仲東.2012.中國落葉松-楊柵銹菌遺傳多樣性研究.菌物學(xué)報(bào)，31（4）：510-522.

關(guān)玲，章鎮(zhèn)，王新衛(wèi)，薛華柏，劉艷紅，王三紅，喬玉山.2011.蘋果基因組SSR位點(diǎn)分析與應(yīng)用.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（21）：4415-4428.

胡小平，董艷玲，茍建軍，楊家榮.2008.蘋果黑星病菌遺傳多樣性的SSR分析.植物病理學(xué)報(bào)，38（3）：329-332.

陸寧海，鄭文明，王建鋒，黃麗麗，康振生.2009.隴南地區(qū)小麥條銹菌群體遺傳多樣性SSR分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（8）：2763-2770.

李廷剛，張路，周善躍，李敏，李寶篤.2013.山東省番茄灰霉病菌種類與遺傳多樣性研究.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，29（10）：137-143.

李亞.2006.湖南稻瘟病菌遺傳多樣性的SSR分析與病菌致病型比較研究﹝碩士論文﹞.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué).

沈瑛，F(xiàn)rouin J L，何月秋，Kaye C D，肖放華，Notteghem J L，劉二明，Tharreau D.2004.湖南煙溪病圃稻瘟病菌的有性態(tài)及微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析.中國水稻科學(xué)，18（3）：262-268.

王玲，左示敏，張亞芳，陳宗祥，黃世文，潘學(xué)彪.2015.中國南方八省（自治區(qū)）水稻紋枯病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的SSR分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，48（13）：2538-2548.

徐靜靜，藺宇，朱振東.2008.植物病原菌SSR標(biāo)記開發(fā)與利用.植物保護(hù)，34（1）：14-21.

余文貴，董友磊，趙麗萍，陳懷谷，楊瑪麗，趙統(tǒng)敏.2011.灰霉病菌SSR遺傳多樣性分析.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（4）：18-20.

張君成.2008.手工挑取真菌單孢子顯微操作技巧.植物保護(hù)，34 （2）：98-100.

趙志堅(jiān)，曹繼芬，楊明英，孫道旺，李先平，楊萬林.2008.用兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析云南馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，41（11）：3610-3617.

Ahmed D，Hamada W.2005.Genetic diversity of some Tunisian Botrytis cinerea isolates using molecular markers.Phytopathologia Mediterranea，44（3）：300.

Enjalbert J，Duan X，Leconte M，Hovmoller M S，de Vallavieille-Pope C.2005.Genetic evidence of local adaptation of wheat yellow rust（Puccinia striiformis f.sp.tritici）within France.Molecular ecology，14（7）：2065-2073.

Fournier E，Giraud T，Loiseau A，Vautrin D，Estoup A，Solignac M，Cornuet J M，Brygoo Y.2002.Characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the fungus Botrytis cinerea （Ascomycota）.Molecular Ecology Notes，2（3）：253-255.

Hovmller M S，Yahyaoui A H，Milus E A，Justesen A F.2008.Rapid global spread of two aggressive strains of a wheat rust fungus.Molecular Ecology，17（17）：3818-3826.

Isenegger D A，Ades P K，F(xiàn)ord R，Taylor P W J.2008.Status of the Botrytis cinerea species complex and microsatellite analysis of transposon types in South Asia and Australia.Fungal Diversity，29：17-26.

Ma Z，Michailides T J.2005.Genetic structure of Botrytis cinerea populations from different host plants in California.Plant Disease，89（10）：1083-1089.

Moyano C，Alfonso C，Gallego J，Raposo R，Melgarejo P.2003.Comparison of RAPD and AFLP marker analysis as a means to study the genetic structure of Botrytis cinerea populations.European Journal of Plant Pathology，109（5）：515-522.

Rosslenbroich H J，Stuebler D.2000.Botrytis cinerea—history of chemical control and novel fungicides for its management.Crop Protection，19（8）：557-561.

Ugolini L，Martini C，Lazzeri L，d'Avino L，Mari M.2014.Control of postharvest grey mould（Botrytis cinerea Per.：Fr.）on strawberries by glucosinolate-derived allyl-isothiocyanate treatments.Postharvest Biology and Technology，90：34-39.

Walker A S，Gladieux P，Decogent V，F(xiàn)ermaud M，Confais J，Roudet J，Bardin M，Bout A，Nicot P C，Poncet C，F(xiàn)ournier E.2015.Population structure and temporal maintenance of the multihost fungal pathogen Botrytis cinerea：causes and implications for disease management.Environmental Microbiology，17（4）：1261-1274.

Studies on Genetic Diversity of Strawberry Mould from Botrytis cinerea in Hunan Province

LIU Shuang-qing1，2，WANG Chong3，ZHANG Ya1*，LIAO Xiao-lan1，2，4*，MA Wen-yue1，BAI Lian-yang1

（1College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Plant Pests，Changsha 410128，Hunan，China；3Science College of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；4Biological Pesticides and Pesticide Preparation Processing Engineering Technology Research Center of Hunan Province，Changsha 410128，Hunan，China）

In order to investigate the genetic structure of srawberry mould from Botrytis cinerea，its differentiation and veriation regulatory，this paper carried out SSR marker analysis on DNA of 180 srawberry mould from Botrytis cinerea genomes，collected from 9 locations of Hunan Province.The result indicated that a total of 56 alleles（Na）for 9 SSR loci were detected，the average value was 6.22.The effective number of alleles（Ne）ranged from 1.27-4.89，with an average value of 3.44.The Nei's gene diversity（H）varied from 0.21-0.80，with an average value of 0.65.The Shannon's information index（I）varied from 0.37-1.83，with an average value of 1.34.The polymorphism information content（PIC）for 9 loci ranged from 0.13-0.19，the variation law was generally coincident with the Shannon's information（I）index and gene diversity index（H）.The denote gene diversity in the species（Ht）of different SSR loci ranged from 0.21-0.77，with an average value of 0.65.The gene diversity within populations（Hs）varied from 0.19-0.50，with an average value of 0.40.The population genetic differentiation（Gst）varied from 0.10-0.46，with an average value of 0.37.The gene flow （Nm）ranged from 0.58-4.47，with an average value of 1.16.At geographical population level，the observed number of alleles（Na）and the effective number of alleles（Ne）were 2.93 and 2.07，respectively.The average Shannon's information index（I）and Nei's gene diversity index（H）were 0.67 and 0.40，respectively.The number of polymorphic loci（NP）and the proportion of polymorphic loci（P）were 6.78 and 75%，respectively.Based on Nei's genetic distance（ranging from 0.279 7-1.922 5），9 geographical populations of MLP isolates from different regions in Hunan Province were initially grouped into 4 clusters：cluster Ⅰ included isolates Changsha，Shaoyang，Yueyang，Hengyang，Zhangjiajie and Xiangtan，cluster Ⅱ included isolates Chenzhou，cluster Ⅲincluded isolates Zhuzhou，and cluster Ⅳcomprised Changde.The genetic diversity of Botrytis cinerea population from Hunan Province is very rich，but there are small differences between different geographical population.The genetic variation in bacteria mainly comes from inside population，and Botrytis cinerea moves between different areas.

Hunan province；Botrytis cinerea；Genetic diversity；SSR marker

s）：張亞，男，副教授，主要從事植物病害綜合治理方面的研究，E-mail：zhangya230@126.com；廖曉蘭，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病害綜合治理方面的研究，E-mail：liaoxl88@126.com

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303025）

劉雙清，男，講師，主要從事植物病害綜合治理方面的研究，E-mail：liushuangqing104@163.com

（

2016-03-28；接受日期：2016-05-10