張婭婷　孫楠　劉瑞瑞　韓雅彭　程琳　王磊　袁紅雨

(信陽師范學院，信陽，464000)

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茶樹己糖磷酸轉(zhuǎn)運器基因GPT的克隆及表達1)

張婭婷孫楠劉瑞瑞韓雅彭程琳王磊袁紅雨

(信陽師范學院，信陽，464000)

Cs-Ev17(GenBank登錄號：GH618812)為一受假眼小綠葉蟬取食誘導的茶樹葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運體基因的cDNA片段，采用RACE技術(shù)克隆該基因的全長cDNA序列，命名為CsGPT(GenBank登錄號：FJ648829)。其全長為1 514 bp，包含一個編碼401個氨基酸的開放性閱讀框，5′-UTR和3′-UTR的長度分別是27 bp和253 bp，其中，3′-UTR具有一個poly(A)加尾信號序列(AATAAA)。生物信息學分析顯示，CsGPT的轉(zhuǎn)運肽由78個氨基酸組成，具有8個跨膜區(qū)。序列分析顯示，CsGPT與擬南芥的GPT2、可可的GPT2和蓖麻的GPT2的一致性分別為80%、80%和73%。熒光定量PCR結(jié)果顯示，CsGPT在葉片中的表達受假眼小綠葉蟬取食和茉莉酸的誘導。

茶樹；葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運體基因；基因表達

Cs-Ev17 is a cDNA fragment of a tea glucose-6-phosphate/phosphate translocator gene, which was up-regulated by mild infestation of green leafhopper (EmpoascavitisG?the). Its full-length cDNA was cloned using the strategy of RACE method. This cDNA was designated asCsGPT(GenBank accession number: FJ648829), which was 1 514 bp in length with a 27 bp 5′-UTR and a 253 bp 3′-UTR, containing an open reading frame of 401 amino acids. The 3′-UTR contains polyadenylation signal sequence (AATAAA). By bioinformatics analysis, CsGPT protein processed a transit peptide of 78 amino acid residues, and contained 8 transmembrane domains. Sequence alignment exhibited that the CsGPT protein had homology to other GPTs fromArabidopsisthaliana,TheobromacacaoandRicinuscommunisL. showing 80%, 80% and 73% in amino acid identity, respectively. By qRT-PCR, the expression ofCsGPTin leaves was induced by infestation of green leafhopper and jasmonic acid.

質(zhì)體是植物細胞生物化學活動中心之一，為一種具有雙層被膜的細胞器。質(zhì)體與胞質(zhì)代謝活動的整合是通過一組轉(zhuǎn)運蛋白實現(xiàn)的，它們控制著代謝物的跨膜運輸。質(zhì)體的外膜具有β-桶狀跨膜蛋白形成選擇性的膜孔，而內(nèi)膜對物質(zhì)的通透有很強的選擇性，是質(zhì)體與胞質(zhì)之間的功能屏障。物質(zhì)通過內(nèi)膜的運輸由一組α-螺旋膜蛋白轉(zhuǎn)運體催化，它們有高度的底物專一性。位于質(zhì)體內(nèi)膜上的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體(plastidic phosphate translocator,pTP)催化無機磷酸與磷酸丙糖、磷酸戊糖和磷酸己糖的反向交換運輸，在溝通質(zhì)體和胞質(zhì)碳代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

目前發(fā)現(xiàn)的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體有磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運體(triose phosphate/phosphate translocator,TPT)、葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運體(glucose-6-phosphate/phosphate translocator,GPT)、磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸轉(zhuǎn)運體(phosphoenolpyruvate/phosphate translocator,PPT)和戊糖-5-磷酸/磷酸轉(zhuǎn)運體(xylulose-5-phosphate/phosphate translocator,XPT)等4種類型[1-6]。其中，GPT主要存在于非綠色組織中，負責將Glc6P運送到質(zhì)體基質(zhì)，用于淀粉和脂肪酸的合成，也可以作為戊糖磷酸途徑的底物[7-9]。根據(jù)從擬南芥、玉米的胚乳、豌豆的根部組織和馬鈴薯的塊莖組織中分離出編碼GPT的cDNA序列，預(yù)測其GPT蛋白的氨基酸序列具有高度的一致性，并且含有6～8個跨膜區(qū)[10]。擬南芥具有兩個功能性GPT基因。GPT1基因主要在氣孔保衛(wèi)細胞、維管束鞘細胞和根尖細胞中組成型表達，并參與配子和胚乳的發(fā)育，GPT1基因的突變有致死效應(yīng)。GPT2基因突變并不影響植物正常條件下的生長發(fā)育，但該基因的表達受糖代謝的調(diào)控[10]。

本研究采用RACE技術(shù)根據(jù)一個受假眼小綠葉蟬取食誘導的茶樹GPT基因的cDNA片段(GenBank登錄號：GH618812)[11]，克隆了該基因的全長cDNA，然后采用實時定量PCR分析了假眼小綠葉蟬取食，以及茉莉酮酸甲酯對該基因表達的影響。

1　材料與方法

1.1植物材料

以2年生茶樹栽培品種‘信陽10號’營養(yǎng)缽扦插苗為試驗材料進行假眼小綠葉蟬和JA處理。處理前先將茶樹幼苗置于穩(wěn)定為25～28 ℃、光照強度為160 μmol·m-2·s-1、光照時間為12 h·d-1條件下生長7 d。

假眼小綠葉蟬處理：每一茶樹幼苗接種50頭左右的假眼小綠葉蟬成蟲，用通風良好的塑料網(wǎng)罩將茶樹幼苗罩上。接蟲12、24、36和48 h后，剪取充分伸展的茶樹葉片用于試驗，以不進行假眼小綠葉蟬處理的茶樹幼苗作為對照。JA處理：茶樹葉面噴施濃度為5 mmol·L-1的JA，分別于處理后2、3、4、6、12和24 h剪取充分伸展的葉片用于實驗。對照噴施等量的蒸餾水。對照和各種處理的葉片采集后迅速用液氮處理，并置于冰箱中-80 ℃保存。

1.2RACE cDNA文庫的構(gòu)建

參照Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒從假眼小綠葉蟬取食32 h的茶樹葉片中提取總RNA。按照Clontech公司SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit的操作程序構(gòu)建5′-ready RACE cDNA文庫和3′-ready RACE cDNA文庫。

1.3CsGPT基因5’端和3’端序列的克隆

根據(jù)Cs-Ev17的核苷酸序列設(shè)計一對特異性引物CsGPT-F1(5′-TCCTCAATGCCTTTCCATTC-3′)和CsGPT-R1(5′-CCAATTGTATGTGCCACAGC-3′)。以5′-ready RACE cDNA文庫為模板，利用5′-通用引物和GPS2擴增該基因cDNA的5′-末端，PCR條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min,30個循環(huán)；以3′-ready RACE cDNA文庫為模板，利用3′-通用引物和GPS1擴增該基因cDNA的3′-末端，PCR條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min,30個循環(huán)。

1.4Real-time qRT-PCR

利用Trizol Reagent(Invitrogen)從對照植株的葉片和不同處理植株的葉片中提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的完整性和濃度。用First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Fermentas)合成第一鏈cDNA，以檢測不同處理條件下CsGPT基因的表達水平。

利用primer premier 5.0軟件設(shè)計CsGPT熒光定量RT-PCR分析引物CsGPT-F2(CTACGAAGCCCATCATGTGC)和CsGPT-R2(AGTTGAAGTGAGCCATGGGA)。采用茶樹的α-tubulin基因(上游引物：5′CCACTCATTCCCTCCTTGAA3′；下游引物：5′ATGGCTCCATCAAACCTCAG3′)作為內(nèi)參對不同樣品cDNA的模板量進行校準。

實時熒光定量PCR反應(yīng)參照SYBR?PremixExTaqTM(TaKaRa)試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，2×SYBRPremixExTaqTM10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。每個樣品設(shè)3次重復。反應(yīng)在ABI PRISM 7300 Real-Time PCR儀(Applied Biosystems)上進行，程序為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。設(shè)定程序，使PCR儀在擴增結(jié)束后自動運行繪制熔解曲線(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s)。實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)按2-ΔΔCT方法[12]。

2　結(jié)果與分析

2.1CsGPT基因克隆及序列分析

基于已獲得的茶樹GPT基因的cDNA片段，設(shè)計一對引物。用下游引物和SMART cDNA的5′通用引物進行5′RACE擴增，獲得長661 bp的DNA片段；用上游引物和3′通用引物進行3′RACE擴增，獲得長1 096 bp的DNA片段(圖1)。序列分析表明所克隆的兩個cDNA片段為茶樹GPT的兩個末端序列。拼接后得到1條完整的GPTcDNA序列，長度為1 514 bp，Genbank登錄號為FJ648829。該序列包含一個完整的ORF，編碼一條由401個氨基酸殘基組成的多肽鏈。茶樹GPT基因的起始密碼子被包含在5′-ACCAUGG-3′序列中，這是一個典型的Kozak結(jié)構(gòu)。拼接cDNA的5′-UTR和3′-UTR的長度分別為27 bp和253 bp，并且在3′-UTR的末端有一多聚腺苷酸加尾信號序列(AATAAA)。

M.150 bp DNA Ladder Marker；1.CsGPT基因的5′RACE產(chǎn)物；2.CsGPT基因的3′RACE產(chǎn)物。

圖1茶樹CsGPT基因cDNA擴增結(jié)果

2.2CsGPT氨基酸序列同源性分析

BlastP比對發(fā)現(xiàn)CsGPT與多種植物的GPT蛋白的氨基酸序列具有同源性，與擬南芥、可可和蓖麻的GPT2的一致性分別為80%、80%和73%。疏水性分析顯示CsGPT是高度疏水的，成熟蛋白質(zhì)的總體極性指數(shù)(polarity indices)是34%，與已分離的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體33%～37%的總體極性指數(shù)相一致。已分離的TPT、PPT和GPT有6～8個跨膜區(qū)，TMHMM分析顯示CsGPT具有8個跨膜區(qū)，第1、第2和第8個跨膜區(qū)分別由18、22和20個氨基酸殘基構(gòu)成，其余5個跨膜區(qū)由23個氨基酸殘基構(gòu)成(圖2)。ChloroP預(yù)期CsGPT的轉(zhuǎn)運肽由78個氨基酸組成，磷酸轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運肽由大約70～90個氨基酸組成。已研究的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體第一個跨膜區(qū)距前體蛋白加工位點20～30個氨基酸殘基，CsGPT蛋白的第一個跨膜區(qū)在CsGPT前體的加工位點下游30個氨基酸殘基。

蛋白序列的基序分析[13]顯示所有的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體亞家族具有相同的基序2、基序3、基序4、基序5、基序6、基序11和基序12。不同的亞家族基序組成各有差異，其中基序1和基序7僅存在于GPT亞家族中，暗示其在植物GPT基因功能上扮演獨特的作用。XPT亞家族單獨具有基序8，PPT亞家族不具有特有的基序，TPT亞家族和GPT亞家族相似，也有2個特有的基序，分別是基序9和基序12(圖3)。此結(jié)果可以推測，不同亞家族在基序組成上的差異很可能是造成亞家族間功能分化的一個重要原因。

黑色表示在所有的序列中都相同的氨基酸殘基；灰色表示在多數(shù)序列中相同的氨基酸殘基；黑線表示預(yù)測的8個跨膜α-螺旋(Ⅰ～Ⅷ)。CsGPT.茶樹(FJ648829)；AtGPT2.擬南芥(NP_564785)；RcGPT2.蓖麻(XP_002518517);Tc_GPT2.可可(XP_007026011.1);Pt_GPT2.楊樹(XP_011037695.1);Ga_GPT2.樹棉(KHG03254.1);Pm_GPT2.梅花(XP_008224795.1);Eg_GPT1.桉樹(XP_010060420.1)。

圖2CsGPT編碼產(chǎn)物與其他物種GPT的同源性比對

2.3CsGPT蛋白的系統(tǒng)發(fā)育

選取代表性植物擬南芥、楊樹、蓖麻和可可中的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體基因同源序列，利用鄰接法構(gòu)建進化樹。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示茶樹CsGPT與其他植物的GPT亞家族聚為一支(圖3)。同時，不同亞家族的質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體相互聚類，最終各亞家族聚集成質(zhì)體磷酸轉(zhuǎn)運體家族。

2.4CsGPT基因的表達分析

熒光定量PCR分析表明，假眼小綠葉蟬取食12 h左右茶樹葉片CsGPT轉(zhuǎn)錄水平有小幅上升，然后逐步升高，在取食48 h前后達到最大值，較對照組增加了約28倍(表1)。在茶樹葉片中，CsGPT的表達受JA的誘導。在JA處理3 h左右CsGPT轉(zhuǎn)錄水平約為對照組的4倍，然后逐漸升高，在6 h前后達到峰值(表1)。

圖3　茶樹GPT系統(tǒng)進化樹

表1JA處理和假眼小綠葉蟬處理對茶樹幼苗CsGPT基因表達的影響

處理時間/h相對表達量(JA處理)處理時間/h相對表達量(假眼小綠葉蟬處理)01.00(0.90～1.10)01.00(0.91～1.10)21.10(1.06～1.14)124.92(4.59～5.20)33.96(3.84～4.05)249.50(8.57～10.55)49.72(8.88～10.62)368.65(7.62～9.78)644.67(37.53～52.34)4828.33(25.63～31.12)121.80(1.74～1.87)243.02(2.93～3.09)

注：表中括號內(nèi)數(shù)據(jù)表示誤差范圍。

3　結(jié)論與討論

本研究通過RACE技術(shù)從茶樹葉片中克隆得到CsGPT基因的全長cDNA序列。序列分析顯示該基因所編碼的蛋白質(zhì)，具有8個跨膜區(qū)和一個由78個氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)運肽區(qū)域。GPT屬于質(zhì)體內(nèi)膜上由核基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)運體家族，該家族可分為TPT、PPT、GPT和XPT 4個亞家族。

pPT表達的組織特異性與它們的功能相一致。正常情況下，GPT主要在異養(yǎng)組織中表達，向質(zhì)體轉(zhuǎn)運淀粉合成和戊糖磷酸途徑所需的G6P。然而，環(huán)境因素和植物體生理狀態(tài)的變化可以改變GPT的表達模式。用葡萄糖溶液處理離體的菠菜葉片可以誘導進行光合作用的葉片表達GPT基因，并導致葉片中淀粉的含量異常地升高[14]。在擬南芥pho3突變體中，由于蔗糖的積累，葉片中的GPT2基因被誘導高水平表達[15]。光照條件下，擬南芥3種淀粉合成缺陷型突變體(pgm、adg和pgi)的GPT2基因在葉片中被誘導表達，并且GPT2基因的表達與葉片中可溶性糖，尤其是葡萄糖水平的升高相關(guān)聯(lián)[16]。KUNZ等[16]提出擬南芥GPT2可能在葉綠體淀粉合成受損或植物體內(nèi)可溶糖濃度增加條件下起著安全閥的作用，由于淀粉的合成受阻，其底物G6P就在葉綠體中積累，根據(jù)葉綠體和胞質(zhì)中G6P的濃度梯度，GPT2可以輸入或者輸出G6P。

假眼小綠葉葉蟬為刺吸式口器昆蟲，主要吸食水稻韌皮部汁液。刺吸式口器昆蟲的取食會大量消耗植物的光合產(chǎn)物，并影響光合產(chǎn)物的運轉(zhuǎn)與分配。本試驗采用qPCR技術(shù)分析假眼小綠葉蟬的取食對茶樹葉片CsGPT基因表達的影響，結(jié)果表明該基因受假眼小綠葉蟬取食的誘導。有許多研究證明GPT基因在植物糖感知途徑中的作用，假眼小綠葉蟬取食后茶樹葉片CsGPT基因表達水平的改變可能是植株在受到蟲害后產(chǎn)生的糖應(yīng)答反應(yīng)途徑的組成部分。

植物的糖應(yīng)答途徑與植物激素應(yīng)答途徑之間存在相互作用[17]。植物的發(fā)育、生理和代謝過程受可溶性糖，例如葡萄糖和蔗糖，供應(yīng)水平的調(diào)控，其中許多過程也受到植物激素的調(diào)節(jié)。茉莉酸是傷反應(yīng)中重要的信號分子，昆蟲取食會導致JA在傷害部位迅速積累，大多數(shù)針對昆蟲的誘導抗性是由JA信號途徑引發(fā)的。在本試驗中，CsGPT的表達還受到茉莉酮酸甲酯的影響，說明在植物應(yīng)答刺吸式口器取食的過程中，傷信號和糖兩種應(yīng)答途徑之間存在著互作。

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Molecular Cloning and Expression Analysis of A Glucose-6-phosphate/phosphate Translocator Gene fromCamelliasinensis//

Zhang Yating, Sun Nan, Liu Ruirui, Han Yapeng, Cheng Lin, Wang Lei, Yuan Hongyu

(Xinyang Normal Univeristy, Xinyang 464000, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(2)：21-25.

Camelliasinensis; Glucose-6-phosphate/phosphate translocator; Gene expression

張婭婷，女，1976年11月生，信陽師范學院生命科學學院(讀碩士研究生期間參與的項目)；鄭州大學物理工程學院，博士研究生。E-mail:zyt@zzu.edu.cn。

袁紅雨，信陽師范學院生命科學學院，教授。E-mail:yhongyu92@163.com。

2015年7月20日。

S793

1)河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(092300410244)；河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目(12B180032)。

責任編輯：潘華。