林志坤　福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司　福州　350014

◆調(diào)查研究◆

兩種脾毒濃度對(duì)豬瘟活疫苗原料兔利用率的影響

林志坤福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

將原料兔隨機(jī)分成兩組（A、B），每組各4 772只。A組接種豬瘟活疫苗種毒，每毫升含0.05 g豬瘟兔化脾毒；B組接種的種毒，每毫升含0.02 g豬瘟兔化脾毒。每組分成30個(gè)批次，每個(gè)批次確定一個(gè)反應(yīng)率。結(jié)果表明，A組30個(gè)批次的平均反應(yīng)率（等同利用率）為90.49%，變動(dòng)幅度為±7.0%；B組的平均反應(yīng)率為67.71%，變動(dòng)幅度為±16.24%，差異極顯著。同時(shí)，A組的變異系數(shù)低于B組，表明A組利用率批間穩(wěn)定性優(yōu)于B組。

豬瘟活疫苗豬瘟活疫苗種毒

豬瘟活疫苗主要有豬瘟活疫苗（兔源）和豬瘟細(xì)胞苗，細(xì)胞苗包括牛睪丸細(xì)胞苗和ST傳代細(xì)胞苗［1］。用于活疫苗生產(chǎn)的豬瘟種毒均需通過(guò)大兔進(jìn)行傳代復(fù)壯，以保證該毒株的免疫原性、有效性和安全性。但在傳代過(guò)程中，由于受生產(chǎn)環(huán)境、家兔質(zhì)量、生產(chǎn)工藝、內(nèi)控指標(biāo)等多種因素的影響，導(dǎo)致大兔利用率較低，批間差異較大。福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司通過(guò)調(diào)整接種種毒的病毒含量，提高了大兔的利用率和批間質(zhì)量的均一性，實(shí)現(xiàn)了豬瘟種毒傳代及豬瘟脾淋苗標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1原料兔大兔9 544只，購(gòu)自符合生產(chǎn)檢驗(yàn)用動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的普通級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)合作兔場(chǎng)，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，置于GMP生產(chǎn)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，喂以含16%粗纖維的全價(jià)料，提供充足凈潔飲水，每個(gè)兔籠關(guān)1只兔。

1.2藥品及試劑豬瘟兔化弱毒（凍干毒），購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司傳代復(fù)壯；獸用生理鹽水，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司配制。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1豬瘟兔化弱毒生產(chǎn)種毒的制備將凍干毒以3 mL生理鹽水稀釋，按1 mL/只耳靜脈接種于健康原料兔進(jìn)行復(fù)壯。通過(guò)測(cè)溫觀察選取定型熱大兔，剖殺無(wú)菌提取脾臟即為第一代豬瘟兔化弱毒脾毒。將第一代豬瘟兔化弱毒脾毒用生理鹽水進(jìn)行50倍稀釋，按1 mL/只耳靜脈接種于健康大兔進(jìn)行復(fù)壯。通過(guò)測(cè)溫觀察選取定型熱大兔，剖殺無(wú)菌提取脾臟即為第二代豬瘟兔化弱毒脾毒。按照第二代豬瘟兔化弱毒脾毒生產(chǎn)的方法再?gòu)?fù)壯兩代，即為生產(chǎn)種毒。

1.3.2種毒鑒定按照中華人民共和國(guó) 《獸用生物制品規(guī)程》2000年版《豬瘟活疫苗（兔源）生產(chǎn)工藝規(guī)程》對(duì)生產(chǎn)種毒進(jìn)行鑒定，效價(jià)達(dá)到105RID/g的脾毒為合格的生產(chǎn)種毒，合格的生產(chǎn)種毒置于-15℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3常溫監(jiān)測(cè)對(duì)初步篩選的大兔常溫監(jiān)測(cè)2 d，每天測(cè)溫2次，上午和下午各1次。選取常溫合格的大兔隨機(jī)分成兩組，分別是A、B兩組。每組160只大兔。測(cè)溫時(shí)，兔仰臥放置于特制的固定架中，體溫計(jì)水銀球植入肛門(mén)內(nèi)3 cm，每只兔測(cè)溫1 min，每測(cè)完一只都將體溫計(jì)放入涼水中洗凈并將水銀柱甩至刻度線之下?？赏瑫r(shí)使用多個(gè)兔固定架和多支體溫計(jì)。

1.3.4制備種毒懸浮液選取合格的同一批次生產(chǎn)種毒，加生理鹽水研磨制成兩種不同濃度的種毒懸浮液，分別是A、B兩種。A種毒每毫升含0.05 g豬瘟兔化脾毒；B種毒每毫升含0.02 g豬瘟兔化脾毒。

1.3.5種毒接種并測(cè)溫用A、B兩種種毒分別耳靜脈接種大兔，其中A組接種A種毒，B組接種B種毒。接種24 h后上午和下午各測(cè)1次體溫，24 h后每隔6 h測(cè)1次體溫。按照判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組定型熱大兔的百分比即為各組大兔的利用率。

1.3.6重復(fù)試驗(yàn)重復(fù)上述試驗(yàn)30個(gè)批次，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組每批大兔的利用率，及各試驗(yàn)組30個(gè)批次總體的大兔利用率。

1.3.7定型熱即合格大兔的判定攻毒后，潛伏期24～36 h，體溫上升呈明顯曲線，至少有2個(gè)溫次超過(guò)常溫1℃以上，則判定該只兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)；其他情況為輕熱、可疑、不發(fā)熱時(shí)，兔脾淋組織不能用于生產(chǎn)疫苗。

2　結(jié)果

A、B兩組各進(jìn)行30個(gè)批次 ，各批次大兔利用率情況見(jiàn)圖1。

將各批次的大兔反應(yīng)率作為統(tǒng)計(jì)分析對(duì)象，以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，A組反應(yīng)率高于B組，且差異極顯著，表明不同濃度種毒對(duì)大兔反應(yīng)率的影響較大，該結(jié)果對(duì)提高大兔利用有指導(dǎo)意義。B組變異系數(shù)大于A組，表明B組批間大兔反應(yīng)率的差異較大，可控性程度低；A組的變異系數(shù)小且反應(yīng)率較高，表明A組每批間的大兔反應(yīng)率相對(duì)較一致，可復(fù)制性程度高。見(jiàn)表1。

表1　各組的批次利用率與變異系數(shù)

以各組定型熱的頭數(shù)及無(wú)反應(yīng)頭數(shù)作為統(tǒng)計(jì)分析對(duì)象，以卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。則A、B兩組之間差異極顯著，表明不同濃度種毒對(duì)大兔反應(yīng)率的影響較大。見(jiàn)表2。

3　討論

表2　A、B兩種濃度種毒的大兔利用率

1）由于外界環(huán)境、人員操作及豬瘟弱毒特性等因素的影響，在種毒研磨及使用過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致豬瘟弱毒部分損失［2］。因此，操作時(shí)要嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行，處處要細(xì)心，時(shí)時(shí)防污染。由于豬瘟弱毒的一些特性，當(dāng)種毒濃度較低時(shí)，接種到大兔體內(nèi)的有效豬瘟病毒粒減少，豬瘟病毒不能在兔體內(nèi)繁殖，導(dǎo)致利用率偏低。有研究表明，兔在運(yùn)輸過(guò)程中可能接觸豬瘟病毒，從而促使其體內(nèi)產(chǎn)生抗豬瘟病毒的中和性抗體［3］。生產(chǎn)豬瘟活疫苗（兔源）時(shí)是將種毒經(jīng)耳靜脈注入兔體內(nèi)，從理論上講，血液中的抗豬瘟病毒中和性抗體能將注入血液中的豬瘟兔化弱毒中和掉一部分，從而影響兔接種后的定型熱反應(yīng)和疫苗效價(jià)［4］。因此，在生產(chǎn)疫苗時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果可為接毒量的確定提供參考依據(jù)。

2）由于豬瘟病毒不能產(chǎn)生細(xì)胞病變，國(guó)際上對(duì)病毒含量或者疫苗效價(jià)的檢驗(yàn)主要依靠兔體定型熱反應(yīng)的方法［5］。由于不同個(gè)體對(duì)豬瘟兔化弱毒的敏感性不同，會(huì)造成一定的試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)結(jié)果也為豬瘟活疫苗 （兔源）檢測(cè)用原料兔的篩選提供參考依據(jù)。異物進(jìn)入機(jī)體，會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，當(dāng)種毒濃度偏低時(shí)，兔體將很快把豬瘟弱毒排出，使豬瘟病毒無(wú)法在兔體內(nèi)繁殖，從而導(dǎo)致大兔利用率偏低。當(dāng)種毒濃度高時(shí)，一部分豬瘟脾毒能避開(kāi)免疫排斥反應(yīng)，在大兔體內(nèi)繁殖，從而提高大兔的利用率。

3）試驗(yàn)結(jié)果表明，單位濃度高的種毒，無(wú)論從大兔利用率還是批間穩(wěn)定性來(lái)看均優(yōu)于單位濃度低的種毒。使種毒的單位濃度達(dá)到相對(duì)較高的滴度，可克服大兔之間的個(gè)體差異，使每批大兔都有相對(duì)穩(wěn)定且較高的利用率。

［1］冷和平，鐘超武，曾俊霞，等.豬瘟細(xì)胞苗與脾淋苗的免疫效果對(duì)比試驗(yàn)［J］.養(yǎng)豬，2009（5）：73-74.

［2］劉志華.在制取豬瘟兔化弱毒"濕苗"中的幾點(diǎn)體會(huì)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1987（7）：43-44.

［3］曾彥欽，吳潤(rùn)生，林志坤，等.酷暑對(duì)兔體溫和豬瘟定型熱比率的影響［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，22（3）：283-287.

［4］曾彥欽，吳潤(rùn)生，林志坤，等.福建省肉兔體內(nèi)豬瘟抗體水平的檢測(cè)［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2007，29（1）：3-4.

［5］祖立闖，謝金文，沈志強(qiáng)，等.豬瘟疫苗質(zhì)量的替代檢驗(yàn)方法研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015（2）：76-79.

Effect of two kinds of lapinized spleen virus concentration on utilization rate of raw material rabbit for production of hog cholera live vaccine

Lin Zhikun
（Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，F(xiàn)uzhou 350014）

The raw rabbits were randomly divided into two groups（A，B），each group has 4 772 rabbits.The rabbits of group A were vaccinated with HCLV，contained 0.05 g per mil spleen tissue of rabbit；the rabbits of group B were vaccinated with HCLV，contained 0.02 g per mil spleen tissue of rabbit；Each group were subgrouped into 30 randomly，each subgroup could get one response rate.The results showed that the average response rate of 30 subgroups in group A was 90.49%，the changing range was±7.0%.The average response rate of 30 subgroups in group B was 67.71%，the changing range was±16.24%.The analysis showed a significant difference. The confficient of variation of group A is lower than that of group B，which showed that the stability of utilization rate in group A was better than that in group B.

Classical swine fever live vaccines Hog cholera live vaccine lapinized virus（HCLV）

A

1003-4331（2016）04-0001-02