潘　鈺，楊明華，原　韜，于　沖，張靖坤，沈欣欣，夏海華（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020；.哈爾濱市兒童醫(yī)院，哈爾濱 150010；.哈爾濱學(xué)院理學(xué)院生物系，哈爾濱 150001）

三種方法提取腸道腺病毒核酸的比較

潘鈺1，2，楊明華3，原韜1，2，于沖1，2，張靖坤4，沈欣欣4，夏海華1，2
（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020；3.哈爾濱市兒童醫(yī)院，哈爾濱 150010；4.哈爾濱學(xué)院理學(xué)院生物系，哈爾濱 150001）

采用傳統(tǒng)的RNAiso法、以SiO2為吸附載體的二氧化硅吸附法及商品化吸附膜式柱提取試劑盒法三種方法提取陽性樣本腸道腺病毒核酸，測定核酸濃度，進(jìn)行實時熒光定量PCR，檢驗核酸提取對該反應(yīng)影響，發(fā)現(xiàn)吸附膜式柱提取試劑盒法提取腺病毒核酸效果最佳。

腺病毒；核酸提取；熒光定量PCR

人類腺病毒（Adenovirus）為雙鏈DNA病毒，大概35KB，它能引起一系列疾病，如急性呼吸道疾病、角膜結(jié)膜炎、腸胃炎［1］。它分為47個血清型和6個亞類（A 到F），近些年F亞類中的病毒型40和41被確認(rèn)為腸道感染的病原體，是僅次于輪狀病毒的引起小兒腸胃炎的主要病毒，腸道腺病毒的感染在全球范圍內(nèi)發(fā)生，4%～17%的小兒腹瀉是由它引起的。AD-40和AD-41主要感染2歲以下的孩子且在全年發(fā)生。臨床癥狀為水樣腹瀉伴有嘔吐、低燒、輕度脫水［2，3］。AD-40是1歲左右的嬰兒的感染源，AD-41則是一些大齡的幼兒的感染源［4］。

臨床上快速準(zhǔn)確地檢測病原體對疾病的診斷起到關(guān)鍵的作用，研究表明金標(biāo)法和熒光定量PCR方法都可用于檢測腸道病毒，通常是2種或多種病毒一起檢測，為方便操作，往往提取病毒的RNA，進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測的靈敏度較金標(biāo)法更高些［5］。因此，提取到質(zhì)量較高的病毒核酸為進(jìn)一步進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)監(jiān)測病毒打下了良好的基礎(chǔ)。筆者采取RNAiso法、二氧化硅法、商品化吸附膜式柱提取試劑盒法三種不同的方法提取腹瀉小兒糞便中的腺病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實時熒光定量PCR，通過分析Ct值以及提取的時間和成本來綜合評價3種提取方法，選擇對后續(xù)熒光定量PCR最有利的方法，為以后的腹瀉病毒快速準(zhǔn)確檢測奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

實驗室保存的腺病毒陽性樣本。選取3個樣本，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。

1.2試驗試劑

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、二氧化硅、Tris-Hcl、EDTA、Trizol。

1.3試驗主要儀器設(shè)備

Nanodrop 2000c，StepOne Real-Time PCR system。

1.4試驗方法

1.4.1病毒核酸提取

1.4.1.1RNAiso法

按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.1.2SiO2法

吸取10%的糞便樣本100μL加入到1.5 PV管中，繼續(xù)加入1 000μL的裂解緩沖液和40μL的分離硅溶液，渦流振蕩10s，室溫下靜置10min后，離心30s，棄上清液。第一次洗滌：加入1 000μL洗滌緩沖液，充分振蕩洗滌兩次；第二次洗滌：加入1 000μL70%的乙醇，充分振蕩洗滌兩次；第三次洗滌：加入1 000μL丙酮，充分振蕩洗滌兩次。在56±2℃加熱器上干燥10min（徹底干燥），將徹底干燥后的沉淀溶解于50μL的DEPC dH2O水中，用移液槍吹打溶解，在56±2℃加熱器上溫育10min，最大轉(zhuǎn)速離心5min，將上清液（約45μL）轉(zhuǎn)移到新的1.5 PV管中，在管壁上標(biāo)記樣本名稱、編號、提取時間，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.3吸附膜式柱提取試劑盒法提取法

參照 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit使用說明書進(jìn)行；實驗步驟中的3、4、5、6提取DNA以及步驟12中DNaseⅠ消化的步驟省略不做。

1.4.2核酸濃度純度檢驗

取核酸樣品2μL，利用Nanodrop 2000c微量分光光度計檢測其濃度及A260/A280、A260/A230的比值。

1.4.3反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.4實時熒光定量PCR檢測

引物和探針，同時設(shè)定陽性對照和陰性對照。陽性對照，前期實驗室檢測確定為陽性的樣本；陰性對照為配制PCR體系所用的去離子水。使用美國ABI公司StepOne Real-Time PCR system擴(kuò)增儀，每管反應(yīng)總體積為25μL，5μL的樣品cDNA，20μLPCR擴(kuò)增預(yù)混液，共45個循環(huán)。Ct值≤37且有對數(shù)增長曲線的為擴(kuò)增陽性。

表1　三種方法提取腺病毒核酸的濃度Tab.1 Concentration of adenovirus nucleic acid which extracted by three methods

2　結(jié)果與分析

2.1核酸的均一性

純的DNA樣品 OD260/OD280應(yīng)為 1.8～2.0，OD260/OD230應(yīng)大于2.0，OD260/OD280小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子。

從核酸濃度看RNAiso法提取的腺病毒核酸濃度相對較高，且重復(fù)性較好，MiniBEST試劑盒提取的病毒核酸濃度低，二氧化硅法提取核酸主要的不足是重復(fù)性不好。

圖1　三種方法提取腺病毒核酸的A260/A280平均值Fig.1 The A260/A280 average of adenovirus nucleic acid which extracted by three methods

三種提取方法獲得的腺病毒核酸的A260/A280平均值分別為1.55、1.67、1.78。MiniBEST試劑盒提取的病毒核酸質(zhì)量較好，從數(shù)值看還是有少量蛋白質(zhì)污染。

2.2Ct值

圖2　三種方法提取腺病毒核酸進(jìn)行熒光定量PCR所得Ct值Fig.2 The Ct value of adenovirus nucleic acid which extracted by three methods detected by Real-Time Quantitative PCR

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。圖2分別為采取三種不同方法提取三個腺病毒核酸，每個樣品三個重復(fù)，之后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)得到的Ct值；通過比較三種方法提取的核酸進(jìn)行熒光定量PCR所獲得的Ct值，結(jié)果顯示采用MiniBEST試劑盒提取的核酸經(jīng)過熒光定量PCR得到的Ct值最小，表明目的基因拷貝數(shù)最多，腺病毒含量最多。SiO2法提取的腺病毒核酸獲得的Ct值稍高于試劑盒法。RNAiso法提取得到的核酸進(jìn)行熒光定量PCR所得Ct值最大，表明目的基因含量最少。

3　討論

近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)由于具有較好的敏感性、特異性和可重復(fù)性，能實現(xiàn)多重反應(yīng)，具有自動化程度高、無污染性、實時性和準(zhǔn)確性的優(yōu)勢，在分子診斷領(lǐng)域發(fā)展最快，應(yīng)用最成熟也最常被采用。腸道病毒中具有代表性的腺病毒、輪狀病毒等引發(fā)腹瀉的病毒是我們在臨床診斷過程中比較常見的，在本研究中，三種方法的提取時間類似，費(fèi)用MiniBEST試劑盒相對高些，二氧化硅價格較低，RNAiso試劑成本居中。通過對三種方法提取腺病毒核酸的結(jié)果分析，雖然使用RNAiso法提取的核酸總濃度很高，但是從后續(xù)實時熒光定量PRC擴(kuò)增的結(jié)果看，這種方法靈敏度較低，提取的目的核酸較少；二氧化硅吸附法提取的核酸濃度不太穩(wěn)定，重復(fù)性不好，熒光定量PCR所得Ct值較RNAiso法低，說明該法提取的目的核酸濃度比RNAiso高；使用MiniBEST試劑盒提取的核酸總濃度雖然低，但是經(jīng)過熒光定量PCR擴(kuò)增獲得的Ct值最低，說明目的病毒核酸濃度最高，提取效率最高，因此使用該法提取腺病毒核酸效果最好，能更好地進(jìn)行病毒的鑒定及定量。

［1］ Dorden S，Mahadevan P.Functional prediction of hypothetical proteins in human adenoviruses［J］.Bioinformation，2015，11（10）：466-473.

［2］ 李林，查巍，金載璇，等.腹瀉患兒糞便中輪狀病毒與腸道腺病毒檢測結(jié)果分析［J］.臨床輸血與檢驗，2015，3（17）：212-214.

［3］ Uhnoo I，Svensson L，Wadell G，et.Enteric adenoviruses.［J］.Baillieres Clin Gastroenterol，1990，4（3）：627-642.

［4］ 王秀麗.腸道腺病毒感染引起小兒腹瀉臨床治療與研究［J］.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2014，1（6）：23-25.

［5］ 石利民，王璇，喬夢凱，等.病毒性腹瀉病原檢測方法比較研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（23）：4342-4344.

Comparison of three methods for extracting enteric adenovirus nucleic acid

PAN Yu1，2，YANG Ming-hua3，YUAN Tao1，2，YU Chong1，2，ZHANG Jing-kun4，SHEN Xin-xin4，XIA Hai-hua1，2
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China；3.Harbin Children's Hospital，Harbin 150010，China；4.Harbin University Department of Biology，F(xiàn)aculty of Science，Harbin 150001，China）

Extracted nucleic acid of positive samples of enteric adenovirus using the traditional RNAiso method，SiO2as carrier adsorption silica adsorption method and adsorption film column extraction kit method.We measured the concentration of the nucleic acid and tested nucleic acid extraction efficiency by real-time fluorescence quantitative PCR.It was found that the membrane adsorption column extraction kit method extract adenovirus nucleic acid has the best effect.

Enteric adenovirus；Nucleic acid extraction；Real time PCR

R450

A

1674-8646（2016）12-0033-03

2016-05-23

省科學(xué)院青年基金（CX15BPYV03）；省院所基本應(yīng)用技術(shù)研究專項（CZ14BXHH06）

潘鈺（1987-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，實習(xí)研究員，主要從事應(yīng)用醫(yī)學(xué)微生物研究。

夏海華（1971-），女，遼寧清源人，碩士，研究員，主要從事應(yīng)用醫(yī)學(xué)微生物研究。