高靜媛，邢磊，梁芳倩，于曉龍，孫堯，楊雨旸

· 論著 ·

RBP4基因rs17484721和rs36035572位點(diǎn)多態(tài)性與老年人2型糖尿病的相關(guān)性研究

高靜媛1，邢磊1，梁芳倩1，于曉龍1，孫堯1，楊雨旸2

目的 探討老年人視黃醇（維生素A）結(jié)合蛋白（RBP4）rs17484721和rs36035572位點(diǎn)基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系。方法 采用聚合酶鏈?zhǔn)健冃愿咝б合嗌V（PCR-DHPLC）技術(shù)篩查110例2型糖尿病患者和127例健康人RBP4基因rs17484721和rs36035572位點(diǎn)多態(tài)性；測(cè)定及比較兩組患者空腹血糖水平、空腹血胰島素水平，并計(jì)算計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI）、腰臀比（WHR）及胰島素抵抗指數(shù)。 結(jié)果 rs17484721和rs36035572兩位點(diǎn)的突變存在強(qiáng)連鎖不平衡。在健康組中TT-II基因型的WHR值顯著高于（TC-ID）+（CC-DD）基因型（P＜0.05）。老年人2型糖尿病組單體型TT-II的頻率為87.2%，明顯高于老年正常健康人組78.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 RBP4基因多態(tài)性可能與老年人糖尿病相關(guān)。

視黃醇（維生素A）結(jié)合蛋白4；多態(tài)性；2型糖尿??；單體型；胰島素抵抗

2型糖尿?。═2DM）的發(fā)病受遺傳及環(huán)境因素的綜合作用，遺傳基因可能參與調(diào)控其發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)。視黃醇（維生素A）結(jié)合蛋白基因（RBP4）是糖尿病易感基因，其非編碼區(qū)的基因多態(tài)性與胰島素抵抗相關(guān)，并在T2DM的發(fā)病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［1］，近年RBP4已作為糖尿病的候選基因正漸漸受到人們的關(guān)注。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)健冃愿咝б合嗌V（PCR-DHPLC）是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)分子生物學(xué)領(lǐng)域新的分析技術(shù)，是分離核苷酸片段及分析檢測(cè)已知和未知基因突變和單核苷酸多態(tài)性（SNP）的最佳技術(shù)平臺(tái)，與傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)相比具有快速、準(zhǔn)確、敏感、高效、自動(dòng)化等特點(diǎn)，是開展臨床基因診斷的一種有效手段［2］。本研究采用PCR-DHPLC測(cè)序技術(shù)對(duì)老年2型糖尿病群體RBP4基因rs17484721和rs36035572位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，探討RBP4基因多態(tài)性與老年人2型糖尿病的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2010年1月～2012年12月在河北理工大學(xué)附屬醫(yī)院老年病及內(nèi)分泌科住院的老年（年齡＞65歲）2型糖尿病組患者110例及門診查體老年（年齡＞65歲）健康組127例。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1999年WHO 2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及患有嚴(yán)重心肺腎疾病。患者均簽署知情同意。

1.2主要試劑 Taq DNA Polymarase（ 北京鼎國(guó)生物技術(shù)限公司）；蛋白酶K（美國(guó)Promega公司）；Tris 飽和酚（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；三乙銨乙酸酯（美國(guó)Transgenomic公司）；人胰島素ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（上海閎巨有限公司）。

1.3臨床資料收集

1.3.1一般資料 實(shí)驗(yàn)前采用問卷調(diào)查的方式，按照統(tǒng)一測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)， 對(duì)所有研究對(duì)象分別測(cè)量身高（cm）、體重（kg）、腹圍（cm）、臀圍（cm）和血壓（mmHg）等，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)（BMI）［3］、腰臀比（WHR）［3］。

1.3.2實(shí)驗(yàn)室檢查 所有受試對(duì)象空腹8 h后抽取靜脈血EDTA抗凝，測(cè)定空腹血糖、血脂，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定空腹血清胰島素，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。BMI =體重（kg）/身高2（m2）。

1.4分子生物學(xué)檢查

1.4.1基因組DNA提取 常規(guī)抽取研究對(duì)象靜脈血5 ml，EDTA抗凝，低滲法分離白細(xì)胞，SDS－蛋白酶K消化，用苯酚－氯仿法提取白細(xì)胞DNA后，溶于TE緩沖液，置-20℃冰箱保存［4］。

1.4.2DHPLC分析 參照GenBank中NT_030059序列設(shè)計(jì)一對(duì)用于RBP4基因第5內(nèi)含子區(qū)PCR擴(kuò)增的引物，正向引物序列為5'-AGGGTGCCTTC TGGCTCTTC-3'，反向引物序列為5'-CTTTA CTGGGCTGCTCAATC-3'，退火溫度為45℃。把產(chǎn)物置于WAVETM核苷酸片段分析系統(tǒng)（美國(guó)Transgenomic技術(shù)有限公司）的96孔板上，輸入DNA序列，根據(jù)序列用WAVEMAKER 4.0軟件選擇樣品最佳運(yùn)行溫度（60.5℃）和起始洗脫梯度后，自動(dòng)進(jìn)樣5 μl PCR產(chǎn)物，于DNASep分離柱（Transgenomic產(chǎn)品）用緩沖液A［pH7.0，0.1 mmol/L三乙胺乙酸鹽（TEAA），0.1 mmol/ L EDTA-4Na］、緩沖液B（pH 7.0，0.1 mmol/L TEAA中含250 ml/L乙腈）梯度洗脫，起始梯度為58%B，以每分鐘增加1.8%B的速率線性洗脫4 min，流速為0.9 ml/min，從分離柱洗脫的DNA溶液用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)OD260 nm波長(zhǎng)處。

1.4.3DNA序列分析 對(duì)DHPLC分析有異常峰型的PCR產(chǎn)物，行核苷酸序列測(cè)定（上海生工測(cè)序部）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SNPAlyze軟件組建分析單倍體。計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較使用立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分?jǐn)?shù)）表示，兩組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組人群一般情況比較 健康組共有127例入組，其中男性68例，占組內(nèi)人數(shù)的53.5%；糖尿病組共有110例入組，其中男性42例，占組內(nèi)人數(shù)的38.2%；健康人組平均年齡與糖尿病組相比（75.91±6.39 vs. 76.11±7.99）無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1　患者一般情況比較

2.2PCR-DHPLC篩查結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RBP4基因第5內(nèi)含子區(qū)部分序列，發(fā)現(xiàn)存在rs17484721與rs36035572兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，rs17484721位點(diǎn)有T、C兩種等位基因，TT、TC、CC三種基因型，rs36035572有I、D兩種等位基因，II、ID、DD三種基因型，且兩個(gè)位點(diǎn)的突變存在強(qiáng)連鎖不平衡。當(dāng)rs17484721位點(diǎn)核苷酸為T時(shí)，rs36035572位點(diǎn)核苷酸總為插入的T；當(dāng)rs17484721位點(diǎn)核苷酸為C時(shí)，rs36035572位點(diǎn)核苷酸總為缺失變異。本實(shí)驗(yàn)獲3種不同類型DHPLC色譜圖（圖1）分別代表三種基因型，即TT-II、TC-ID、CC-DD （I：插入突變；D：缺失突變）。其中發(fā)現(xiàn)48例健康人、26例T2DM患者為雜合型（TC-ID）；3例健康人、1例T2DM患者為純合型（CC-DD）；76例健康人、83例患者為野生型（TT-II）。

2.3糖尿病組與健康組間等位基因和基因型頻率的比較 基因型頻率分布符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律（2型糖尿病組：χ2=0.810，P=0.667；健康人組：χ2=0.403，P=0.813）。本研究人群中，BPR4基因rs1748472的C變異和rs36035572位點(diǎn)的缺失變異頻率均為32.9%（78/237）。在老年糖尿病患者組rs17484721位點(diǎn)TT、TC及CC三種基因型例數(shù)為83、26及1，而健康人組為76、48 及3。在老年糖尿病患者組rs36035572位點(diǎn)II、ID 及DD三種基因型例數(shù)為83、26及1，而健康人組為76、48及3（表2）。利用SNPAlyze進(jìn)行單體型分析后發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)顯示強(qiáng)連鎖不平衡（r2＞0.9）（表3）。

2.3不同基因型的臨床指標(biāo)比較 按單體型分組，各組之間代謝指標(biāo)進(jìn)行比較，在健康組中TTII基因型的WHR值顯著高于（TC-ID）+（CCDD）基因型（P＜0.05）。健康組及2型糖尿病組中TT-II基因型的BMI、HOMA-IR值高于（TCID）+（CC-DD）基因型，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

3　討論

圖1　DHPLC檢測(cè)PCR產(chǎn)物的色譜圖（1A：無突變患者色譜圖；1B：純合突變攜帶者色譜圖；1C：雜合突變攜帶者色譜圖）

表2　BPR4 SNPs等位基因、基因型頻率與糖尿病易感性的相關(guān)性（例）

表3　病例健康人單體型分析

2型糖尿病常見于老年人，有研究數(shù)據(jù)顯示60歲以上老年人糖尿病患病率可達(dá)19.6%，其主要機(jī)制為胰島素抵抗。近年來對(duì)于老年人糖尿病及胰島素抵抗的研究越來越受到人們重視。其中，易感基因研究成為研究熱點(diǎn)之一。RBP4是新近發(fā)現(xiàn)的糖尿病易感基因，各研究數(shù)據(jù)均提示RBP4非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)可增加糖尿病的易感性，與胰島素抵抗、胰島素分泌相關(guān)［5-8］。本實(shí)驗(yàn)以老年人為研究對(duì)象，利用PCR-DHPLC聯(lián)合測(cè)序法檢測(cè)了RBP4第五內(nèi)含子上的部分序列，并與胰島素抵抗的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBP4基因第五內(nèi)含子存在rs17484721 和rs36035572位點(diǎn)的變異。rs17484721位點(diǎn)有T、C兩種等位基因，TT、TC、CC三種基因型。rs36035572有I、D兩種等位基因，II、ID、DD三種基因型。

隨后進(jìn)行的病例健康人研究顯示在2型糖尿病組中rs17484721位點(diǎn)TT基因型頻率明顯高于其它基因型頻率，可認(rèn)為攜有TT基因型的人較其它基因型攜帶者更易患2型糖尿病。同樣，與健康人組相比在2型糖尿病組中rs36035572的II基因型頻率明顯高于其它基因型頻率，可認(rèn)為攜有II基因型的人較其它基因型攜帶者更易患2型糖尿病。rs1748472和rs36035572位點(diǎn)的最小等位基因頻率均大于5%，可用來構(gòu)建單體型模型。2型糖尿病組單體型TT-II的頻率明顯高于健康人組，健康人組CC-DD頻率明顯高于2型糖尿病組，揭示了單體型TT-II可能與2型糖尿病的易感性相關(guān)。rs17484721和rs36035572位于一個(gè)強(qiáng)連鎖的區(qū)域內(nèi)，且此區(qū)域包括RBP4下游基因（GPR120基因）的部分序列。已有研究顯示GPR120基因編碼的蛋白可刺激高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的分泌［9-11］。目前研究提示GLP-1可促進(jìn)高糖環(huán)境下的胰島素的分泌，與糖尿病發(fā)病直接相關(guān)。推測(cè)可能本研究的位點(diǎn)突變引起了GPR120基因的翻譯與轉(zhuǎn)錄?？梢哉J(rèn)為，RBP4的rs1748472和rs36035572位點(diǎn)可能與老年人糖尿病發(fā)病有一定相關(guān)性。

進(jìn)一步分析基因多態(tài)性與代謝指標(biāo)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在健康人組中TT-II基因型組的WHR值顯著高于（TC-ID）+（CC-DD）基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在2型糖尿病組中也發(fā)現(xiàn)這種升高的趨勢(shì)，但基因型組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果揭示了TT-II基因型可能與老年人群的WHR值密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)沒有顯著證據(jù)表明老年人RBP4基因多態(tài)性與胰島素抵抗相關(guān)，這與以往研究稍有不同，但研究發(fā)現(xiàn)無論在健康人組還是2型糖尿病組TT-II基因型的BMI、HOMA-IR值均高于其它基因型，雖然差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這種代謝指標(biāo)差異一致性不是偶然，有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步檢驗(yàn)。

本研究從一定角度揭示了RBP4基因與糖尿病的關(guān)系，但由于2型糖尿病屬多基因遺傳性疾病，每個(gè)易感基因的作用可能都是微效的，且導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生的機(jī)理受環(huán)境及個(gè)體差異影響較多。因此，有必要擴(kuò)大研究對(duì)象數(shù)量，為進(jìn)一步從基因水平揭示RBP4基因與糖尿病的關(guān)系提供確鑿依據(jù)。

表4　糖尿病組與健康組的部分臨床特征比較（±s）

表4　糖尿病組與健康組的部分臨床特征比較（±s）

注：BMI：體質(zhì)指數(shù)；WHR：腰臀比；FPG：空腹血漿葡萄糖；FINS：空腹血漿胰島素；HOMA-IR：胰島素抵抗指數(shù)。健康組TT-II亞組比較：aP＜0.05

組別亞組BMI（kg/m2）WHRFPG（mmol/L）FINS（mU/L）HOMA-IR健康組（n=127）TT-II（n=76）24.88±3.910.85±0.084.76±0.6816.71±8.212.57±2.28 （TC-ID）+（CC-DD）（n=51） 22.76±3.43 0.82±0.07a4.61±0.7012.09±9.712.08±2.07糖尿病組（n=110）TT-II（n=83）24.49±3.020.88±0.0812.11±6.2116.04±4.308.77±6.35 （TC-ID）+（CC-DD） （n=27）23.93±3.340.88±0.0912.41±6.7915.91±6.437.93±7.62

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Study on association between the rs17484721 and rs36035572 of RBP4 Gene Polymorphisms and Type2 Diabetes mellitus in old People

GAO Jing-yuan*， XING Lei， LIANG Fang-qian， YU Xiao-long， SUN Yao，YANG Yu-yang.*063000，Hebei，Tangshan，North China University of Science and Technology Affiliated Hospital .

YANG Yu-yang， E-mail: yang311605@126.com

Objective To study the associations between rs17484721 and rs36035572 of RBP4 （retinal binding protein 4） gene with Type 2 Diabetes mellitus （T2DM） in old People. Methods A combined method of polymerase chain reaction （PCR） and denaturing high performance liquid chromatography （DHPLC） was applied to detect the genotype of rs17484721 and rs36035572 among 110 T2DM patients and 127 healthy subjects. Fasting glucose and fasting insulin were measured and analyzed in two groups. Body mass index （BMI）， waist-hip ratio （WHR）and insulin resistance index were calculated. Results Strong linkage disequilibrium were found in rs17484721 and rs36035572. In health control group， the WHR was significantly higher in subjects with TT-II genotype. TTII frequency of T2DM group （87.2%） was higher than the control subjects （78.7%， P＜0.05）. Conclusions The polymorphism of RBP4 gene may be related to T2DM in old people

Retinal binding protein 4（RBP4）； Polymorphism； Type 2 Diabetes mellitus； Haplotype； Insulin resistance

· 論著 ·

R587.1

A

1674-4055（2016）04-0408-03

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題（20120414）

1063000 唐山，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科；2063000 唐山，華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

楊雨旸，E-mail：yang311605@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.04.07