曹振蘭，蘭曉霞，胡春秀，趙化冰

(1. 遼寧醫(yī)學(xué)院，錦州　121000；2. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津　300162；3. 天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室，天津　300309；4. 武警后勤學(xué)院部隊流行病學(xué)與統(tǒng)計學(xué)教研室，天津　300309)

?

大負(fù)荷運動對雌性大鼠雌激素及抗苗勒管激素的影響

曹振蘭1，2，蘭曉霞3，4 #，胡春秀2，趙化冰3*

(1. 遼寧醫(yī)學(xué)院，錦州121000；2. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300162；3. 天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點實驗室，天津300309；4. 武警后勤學(xué)院部隊流行病學(xué)與統(tǒng)計學(xué)教研室，天津300309)

目的探討大負(fù)荷運動對卵巢功能的影響，為防治運動性月經(jīng)失調(diào)，提高訓(xùn)練成績提供依據(jù)。方法選擇20只動情周期穩(wěn)定的健康雌性SD大鼠，隨機分為兩組，實驗組和對照組各10只，按預(yù)設(shè)方案進(jìn)行跑臺訓(xùn)練；動態(tài)觀察陰道脫落細(xì)胞；監(jiān)測大鼠的體重及血清雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)水平。結(jié)果隨著運動負(fù)荷增加，實驗組大鼠于第4周起開始出現(xiàn)動情周期紊亂現(xiàn)象；第5、6周實驗組大鼠的平均體重[分別為(288.80±8.51)g、(286.70±12.95)g]顯著低于對照組[分別為(305.76±7.57)g、(314.67±11.08)g](P均<0.01)；第5、6周實驗組大鼠的血清E2水平[分別為(349.86±25.84)pmol/L、(332.14±27.82)pmol/L]顯著低于對照組[分別為(412.80±36.81)pmol/L、(417.79±22.24)pmol/L](P均<0.01)，AMH水平[分別為(2.06±0.42)ng/ml、(1.81±0.48)ng/ml]亦顯著低于對照組[分別為(2.55±0.50)ng/ml、(2.46±0.55)ng/ml](P均<0.05)。結(jié)論持續(xù)的大負(fù)荷運動會造成大鼠動情周期紊亂，血清E2和AMH水平下降，提示大負(fù)荷運動應(yīng)激導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)的發(fā)生機制可能與卵巢功能下降有關(guān)。

大負(fù)荷運動；動情周期；雌激素；抗苗勒管激素

【Abstract】

Objective： To investigate the effects of high intensity exercise on ovarian function，in order to provide the basis evidences for preventing exercise-induced menstrual disorders and improving training results.

Methods： Twenty healthy female SD rats with stable estrus cycle were randomly divided into two groups according to different exercise training scheme： the experimental group and control group，ten for each group. The vaginal exfoliated cells and serum levels of estrogen & anti-mullerian hormone (AMH) were dynamically observed and monitored.

Results： Along with the exercise load increased，the rats in the experimental group began to appear estrus cycle disorder from the fourth week. In the fifth and sixth week，the average weight in experimental rats [(288.80±8.51) g and (286.70±12.95) g，respectively] was significantly lower than the control group [(305.76±7.57) g and (314.67±11.08) g，respectively] (P<0.01). The serum levels of estrogen [(349.86±25.84) vs. (412.80±36.81) pmol/L and (332.14±27.82) vs. (417.79±22.24) pmol/L] were significantly lower than those in the control group (allP<0.01), and AMH [(2.06±0.42) vs. (2.55±0.50) ng/ml and (1.81±0.48) vs. (2.46±0.55) ng/ml] were also significantly lower than those in the control group (allP<0.05).

Conclusions： The present experiment results suggest that high intensity exercise can result in abnormal estrus cycle，the decrease of serum levels of estrogen and AMH in female rats，which indicates that the mechanism lead to menstrual disorder by high intensity exercise may be related to a decline in ovarian function.

(JReprodMed2016，25(8)：725-730)

大負(fù)荷運動常可導(dǎo)致運動性月經(jīng)失調(diào)(EAMD)。資料顯示，EAMD在女性耐力運動員和舞蹈演員中的發(fā)生率約為5%～20%，包括運動性閉經(jīng)(AA)、月經(jīng)稀疏、無排卵周期和黃體功能不全(LPD)等[1]。EAMD的發(fā)生不僅影響運動員的運動能力，其對運動員生育功能的影響也越來越受到重視?？姑缋展芗に?AMH)作為反應(yīng)卵巢儲備功能最早的敏感性指標(biāo)[2-3]，在預(yù)測卵巢功能方面的作用已得到公眾認(rèn)可，但其在EAMD中的水平變化少見報道。本研究動態(tài)監(jiān)測大負(fù)荷運動中大鼠血清雌激素和AMH水平的變化，為探討EAMD的發(fā)生機制、預(yù)測EAMD患者的卵巢功能提供一定參考。

材料和方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：清潔級雌性8周齡SD大鼠25只，平均體重(238.53±8.35)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供[許可證號：SCXK-(軍)2012-0004]。參照實驗動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每天光照12 h，自由攝水進(jìn)食，室溫20～25℃，相對濕度45%～55%。

2. 實驗耗材和試劑：玻璃毛細(xì)管、吸管、24孔板、載玻片、1 ml注射器、EP管、試管架、記號筆、10%水合氯醛、苦味酸、生理鹽水，大鼠雌激素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠AMH ELISA試劑盒(均由上海拜沃生物科技有限公司提供)。

3. 主要實驗儀器：動物跑步機(FT-200動物跑步機，成都泰盟軟件有限公司提供)；微量高速離心機(TG16W，湖南長沙平凡儀器儀表有限公司提供)；酶標(biāo)儀(Sunrise-Basic，TECAN，澳大利亞)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080，蘇州江東精密儀器有限公司提供)；洗板機(AC8，Thermo，美國)；顯微鏡(Alphaphot-2 YS2，尼康，日本)。

二、實驗方法

1. 動物分組及適應(yīng)性訓(xùn)練：實驗前每天早上8：00～9：00對大鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，連續(xù)觀察兩個動情周期，選取具有正常動情周期的大鼠進(jìn)入實驗。按預(yù)設(shè)方案進(jìn)行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練1周(詳見表1)，選取能適應(yīng)跑臺運動且有規(guī)律動情周期的大鼠20只，參照隨機數(shù)字表隨機分成實驗組和對照組，每組10只。

表1　適應(yīng)性訓(xùn)練方案

2. 跑臺訓(xùn)練：本實驗參照Bedford等[4]動物運動的負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)及王人衛(wèi)等[5]大鼠動情周期抑制模型訓(xùn)練方案。實驗組采用泰盟FT-200動物跑步機進(jìn)行跑臺訓(xùn)練，以1周為一個周期(運動6 d，休息1 d)，共訓(xùn)練6周，訓(xùn)練方案詳見表2。對照組則自由活動。

3. 內(nèi)眥采血：每周于第7 d，給大鼠稱重，并行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查，盡可能于動情間期進(jìn)行采血。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(3 ml/kg)，左手拇指和食指抓住大鼠頸部，輕輕壓迫動物的頸部兩側(cè)，使眶后靜脈叢充血。右手拇指和食指持玻璃毛細(xì)管(長約3～4 cm，內(nèi)徑1.0 mm)，將光滑一端于內(nèi)眥部以45°角輕輕旋轉(zhuǎn)刺入約4～5 mm，待有血液流入毛細(xì)管，立即提起大鼠尾部，使其處于尾高頭低位，使血液自毛細(xì)管流到EP管中，一次采血1～1.5 ml，采血結(jié)束，停止壓迫大鼠頸部，將其平放于試驗臺，拔出毛細(xì)管。血液于4℃冰箱靜置30 min，3 500 rpm/min，離心20 min，取上清，-80℃保存。

表2　實驗組運動訓(xùn)練方案

4. 陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片：每天早上8：00～9：00，大鼠置于試驗臺上，輕撫大鼠使其安靜，左手拇指和食指固定尾部，其余三指輕壓大鼠背部，以暴露陰道，右手持無菌吸管(吸有少量生理鹽水)，輕輕旋轉(zhuǎn)插入陰道內(nèi)少許，輕輕吹打幾次，吸出混有陰道分泌物的生理鹽水，置入干凈的24孔板，吹打均勻，標(biāo)記。取1～2滴滴在載玻片上，顯微鏡下觀察，根據(jù)鏡下陰道涂片的細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)來確定動情周期。隨動情周期變化，陰道脫落細(xì)胞也發(fā)生變化，動情前期：細(xì)胞數(shù)量多，以有核的上皮細(xì)胞為主；動情期：大量細(xì)胞，以角化的上皮細(xì)胞為主；動情后期：可見3種形態(tài)的細(xì)胞：有核上皮細(xì)胞、無核角化的上皮細(xì)胞、白細(xì)胞，且三者數(shù)量相當(dāng)；動情間期：以白細(xì)胞為主，有時少見細(xì)胞[6]。

5. ELISA法測定血清E2、AMH水平：選擇處于動情間期的大鼠血清樣品測定E2水平，AMH水平測定則可以選用任何動情周期的大鼠血清樣品。試劑盒在室溫下平衡30 min，具體實驗步驟參照試劑盒說明書。

三、數(shù)據(jù)處理

結(jié)　　果

一、大負(fù)荷運動對大鼠體重的影響

隨著周齡的增加，對照組大鼠體重呈逐漸上升趨勢，實驗組大鼠跑臺訓(xùn)練前4周體重逐漸增加，第5周起體重呈下降趨勢。實驗組與對照組相比，前4周體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第5、6周實驗組大鼠的平均體重[分別為(288.80±8.51)g、(286.70±12.95)g]顯著低于對照組[分別為(305.76±7.57)g、(314.67±11.08)g](P均<0.01)(圖1、表3)。

注：與對照組比較，**P<0.01圖1　不同訓(xùn)練周期實驗組和對照組大鼠體重變化趨勢

二、大負(fù)荷運動對大鼠動情周期的影響

運動前各組大鼠均有正常動情周期，平均4～5 d，陰道脫落細(xì)胞呈規(guī)律性變化。實驗組大鼠在跑臺訓(xùn)練早期，有2只大鼠動情周期延長，分別為6 d和7 d，隨后恢復(fù)正常周期。隨著跑臺訓(xùn)練的進(jìn)行，于第4周開始實驗組大鼠出現(xiàn)動情周期紊亂現(xiàn)象：陰道涂片觀察到動情前期有核上皮細(xì)胞和動情期角化細(xì)胞逐漸減少，涂片中較少出現(xiàn)落葉狀大片角化細(xì)胞，動情間期粘液增多，動情后期、動情間期逐漸延長。第4周實驗組中有1只大鼠出現(xiàn)動情周期延長(達(dá)9 d)。至6周訓(xùn)練結(jié)束，實驗組大鼠均出現(xiàn)了動情周期紊亂現(xiàn)象，其中有2只大鼠連續(xù)15 d處于動情間期。

三、大負(fù)荷運動對大鼠血清E2和AMH水平的影響

整個實驗周期，對照組大鼠血清E2水平相對平穩(wěn)；實驗組大鼠血清E2水平隨運動訓(xùn)練的持續(xù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，運動訓(xùn)練前4周下降幅度較緩慢，第5～6周降幅顯著增大，顯著低于對照組(P<0.01)(圖2、表3)。對照組大鼠血清AMH水平相對平穩(wěn)，實驗組大鼠血清AMH水平前3周較平穩(wěn)，第4周起呈逐漸下降趨勢，第5、6周AMH水平顯著低于對照組(P<0.05)(圖3、表3)。

注：與對照組比較，**P<0.01圖2　不同訓(xùn)練周期實驗組與對照組大鼠血清E2水平變化

注：與對照組比較，*P<0.05圖3　不同訓(xùn)練周期實驗組與對照組大鼠血清AMH水平變化

時間(周)體重(g)E2(pmol/L)AMH(ng/ml)對照組實驗組對照組實驗組對照組實驗組1270.30±15.32267.07±9.64408.10±41.62442.93±46.722.48±0.772.46±0.502276.53±10.45276.54±10.89415.37±49.03430.56±38.872.52±0.702.44±0.573291.80±6.89286.58±11.25414.53±77.11407.81±38.762.48±0.572.45±0.504301.12±15.59293.32±13.02412.69±34.68401.50±26.132.59±0.562.31±0.355305.76±7.57288.80±8.51**412.80±36.81349.86±25.84**2.55±0.502.06±0.42*6314.67±11.08286.70±12.95**417.79±22.24332.14±27.82**2.46±0.551.81±0.48*

注：與同時期對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討　　論

一、大鼠動情周期變化

下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)維持著雌性大鼠體內(nèi)雌激素的水平，大鼠的陰道上皮細(xì)胞在雌激素水平作用下，不斷分裂、增生、成熟，最后角化脫落，稱為動情周期。大鼠動情周期約4～5 d，可分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。動情周期中陰道脫落細(xì)胞表現(xiàn)出不同的特點，因此可以通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查確定大鼠所處的動情周期[6]。如果出現(xiàn)上皮細(xì)胞周期性變化消失、動情期角化細(xì)胞減少直至消失、正常動情周期時間延長或沒有規(guī)律等，均提示大鼠發(fā)生了動情周期紊亂。

本實驗中，大負(fù)荷運動實驗組大鼠在跑臺訓(xùn)練早期，有兩只大鼠動情周期延長，隨后恢復(fù)正常周期。這可能與大鼠的個體差異有關(guān)，開始對運動訓(xùn)練比較敏感，之后產(chǎn)生了適應(yīng)性。隨著運動負(fù)荷進(jìn)一步增加，實驗組大鼠逐漸出現(xiàn)動情周期紊亂現(xiàn)象，提示大鼠已不適應(yīng)逐漸增大的運動負(fù)荷，出現(xiàn)動情周期的紊亂。本研究結(jié)果顯示6周的大負(fù)荷運動可以導(dǎo)致大鼠動情周期紊亂，并且運動性動情周期的紊亂是一個漸進(jìn)的過程，與以往的研究[7]相一致。有文獻(xiàn)報道長期參與劇烈運動的女運動員EAMD的發(fā)生率顯著高于正常人群[8]，這可能與大負(fù)荷運動抑制HPO軸的功能，使卵巢功能下降有關(guān)。

二、大負(fù)荷運動影響體重變化

體重下降是機體對超出機體耐受程度的運動負(fù)荷的一種反應(yīng)，常用來作為判斷過度訓(xùn)練的依據(jù)之一，也是大強度耐力運動導(dǎo)致運動性動情周期紊亂的表現(xiàn)形式之一，其下降程度與運動負(fù)荷及機體對負(fù)荷的耐受度有關(guān)。在長時間的大負(fù)荷運動中，能量消耗增加，導(dǎo)致體重降低。本實驗中前4周的訓(xùn)練，隨著運動負(fù)荷的增長，實驗組大鼠體重呈逐漸增長趨勢，且與對照組比較無顯著性差異，提示大鼠對運動負(fù)荷具有一定的耐受力。自第5周起，實驗組大鼠體重逐漸下降，與對照組比較開始出現(xiàn)顯著性差異，提示訓(xùn)練過度，大鼠機體已不再耐受負(fù)荷運動。

三、大負(fù)荷運動對大鼠體內(nèi)激素水平的影響

雌激素是由卵巢顆粒細(xì)胞及膜細(xì)胞合成并分泌的，受HPO軸的調(diào)節(jié)，其中E2生物活性最強。正常情況下，下丘腦合成促性腺激素釋放激素(GnRH)，并以脈沖方式將其釋放入垂體門脈系統(tǒng)，促進(jìn)垂體分泌釋放卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)，促進(jìn)卵泡的發(fā)育成熟和雌、孕激素的分泌。在性成熟的雌性動物體內(nèi)雌激素的合成分泌呈周期性變化，在動情期達(dá)到最高水平，在動情前期則處于最低水平。有研究顯示長期運動訓(xùn)練的女性，常表現(xiàn)出低性腺類固醇激素水平，月經(jīng)失調(diào)發(fā)生率較高[9]。動物實驗也表明長期大負(fù)荷的運動使大鼠動情周期抑制，血清雌激素濃度下降，促性腺激素水平降低[10]。提示長期的大負(fù)荷運動可以抑制卵巢的正常分泌功能。

本實驗運用ELISA方法檢測大鼠動情間期血清E2水平，結(jié)果顯示實驗組大鼠血清E2水平隨運動訓(xùn)練進(jìn)行呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，并在第5～6周降幅明顯增大，顯著低于對照組(P<0.01)。其原因可能是長期的大強度運動引起HPO軸功能抑制，尤其是下丘腦GnRH分泌的幅度、脈沖頻率降低，抑制垂體促性腺激素的分泌，使卵巢分泌功能下降、性腺激素分泌不足[11]。

AMH是轉(zhuǎn)化生長因子-β家族成員之一，主要由卵巢竇前卵泡以及小竇卵泡顆粒細(xì)胞分泌，與卵巢功能密切相關(guān)，是最新發(fā)現(xiàn)的評價卵巢年齡的重要指標(biāo)[12-13]。有研究證實當(dāng)卵巢功能和卵巢儲備能力發(fā)生變化時，AMH水平改變要早于E2和孕酮(P)水平的變化；月經(jīng)周期第3 d的血清AMH水平可反映出卵巢竇卵泡的數(shù)量，并且AMH水平在女性體內(nèi)保持相對穩(wěn)定，既不隨月經(jīng)周期發(fā)生變化，也不受促性腺激素的反饋調(diào)節(jié)，可準(zhǔn)確、靈敏地評估卵巢儲備功能[14-15]。目前AMH對卵巢功能評價的研究較多，但AMH在EAMD中的變化研究少見報道。

本實驗結(jié)果顯示，實驗組大鼠血清AMH水平自第4周起逐漸下降，于第6周降至最低水平，顯著低于對照組(P<0.05)，提示實驗組大鼠的卵巢功能受到了影響。之前有研究顯示，持續(xù)大負(fù)荷運動可導(dǎo)致大鼠卵泡發(fā)生閉鎖，竇前卵泡和竇狀卵泡數(shù)量減少[16]。鄭陸等[17]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)負(fù)荷運動可導(dǎo)致大鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，卵泡基本處于較原始狀態(tài)。因此，推測本實驗中動情周期紊亂的實驗組大鼠其卵巢結(jié)構(gòu)可能也發(fā)生了變化，從而影響了卵巢功能，但這仍需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，本實驗中對照組大鼠動情周期規(guī)律，體重逐漸增加，血清E2、AMH水平基本平穩(wěn)，提示對照組大鼠在整個實驗期間機體狀態(tài)較好，性腺軸功能基本正常。而6周的大負(fù)荷運動導(dǎo)致了實驗組大鼠的動情周期紊亂，血清E2、AMH水平顯著下降，提示持續(xù)的大負(fù)荷運動應(yīng)激導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)的發(fā)生機制可能與HPO軸的功能異常及卵巢功能下降有關(guān)，但其具體作用機制尚有待于進(jìn)一步的研究探討。

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[編輯：辛玲]

Effects of high intensity exercise training on estrogen and anti-mullerian hormone in female rats

CAO Zhen-lan1，2，LAN Xiao-xia3，4 #，HU Chun-xiu2，ZHAO Hua-bing1，3*

1.LiaoningMedicalCollege，Jinzhou121000 2.HospitalAffiliatedLogisticsCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300162 3.TianjinKeyLaboratoryforPreventionandControlofOccupationalandEnvironmentalHazard，Tianjin300309 4.DepartmentofEpidemiology，LogisticsCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300309

High intensity exercise training； Estrous cycle； Estrogen； Anti-mullerian hormone

2016-01-20；

2016-03-24

武警醫(yī)學(xué)院重大項目資助課題(wjz2007-4)

曹振蘭，女，山東臨沂人，碩士研究生，婦產(chǎn)科專業(yè).(#共同第一作者；*

，Email：lanxx1995@163.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.011