常婧琦　劉璟璇

研究背景及路線

金黃色葡萄球菌是牛奶中常見的一種致病微生物，因此，能夠上市的牛奶產(chǎn)品中不允許檢出金黃色葡萄球菌。生鮮乳中金黃色葡萄球菌主要來(lái)源是奶牛場(chǎng)。雖然奶牛場(chǎng)會(huì)定時(shí)對(duì)奶牛本身和牛舍進(jìn)行消毒，但還是避免不了金黃色葡萄球菌對(duì)生鮮乳的污染，這主要是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌對(duì)牛場(chǎng)中使用的抗生素產(chǎn)生了耐藥性。經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知，金黃色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，奶?；既榉垦资墙瘘S色葡萄球菌污染生鮮乳最主要的原因，會(huì)引起牛奶的腐敗變質(zhì)。因此，想要控制牛奶的奶源質(zhì)量，就必須對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥性進(jìn)行研究。我們對(duì)北京某牛場(chǎng)的牛群進(jìn)行隨機(jī)取樣，對(duì)其中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了分離鑒定，以及耐藥性的基因分析，建立了多重耐藥性的耐藥基因圖譜，可以更快速、合理地對(duì)奶牛場(chǎng)的用藥進(jìn)行指導(dǎo)。研究技術(shù)路線見圖1。

實(shí)驗(yàn)過程

樣品采集

從北京某牛場(chǎng)牛群中隨機(jī)選擇奶牛48頭，分別收集乳頭涂抹樣品（見圖2）、牛乳樣品及糞便樣品等144份樣品，將其放入冰盒中冷藏，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，乳房涂抹樣品：使用無(wú)菌拭子擦拭奶牛乳頭后置于無(wú)菌生理鹽水中保存，共采集48份；生鮮乳樣品：用溫水清洗奶牛乳房并使用75%酒精棉球?qū)θ轭^進(jìn)行消毒處理，然后收集第3把后的奶樣保存于無(wú)菌試劑瓶，共采集48份；糞便樣品：使用無(wú)菌手套從牛的肛門處采集新鮮糞便，分別裝入無(wú)菌藍(lán)蓋試劑瓶中保存，共采集48份。

菌種預(yù)培養(yǎng)

配制營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求進(jìn)行配置，再加入適量的蒸餾水。121℃20min高溫濕熱滅菌。在無(wú)菌室挑取平板上的菌落，放入滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

菌種分離純化

配制Baird Parker瓊脂培養(yǎng)基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求進(jìn)行配置，再加入適量的蒸餾水，121℃20min高溫濕熱滅菌，待溫度冷卻到50℃時(shí)，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，用于金黃色葡萄球菌的選擇性分離培養(yǎng)。每個(gè)平板倒入大約20mL的培養(yǎng)基，加入已活化的液體培養(yǎng)基1 mL，放入培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

菌體鏡檢和鑒定

鏡檢采用革蘭氏染色法，一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等4個(gè)步驟。

鑒定時(shí)，用取樣棒挑取未知菌株的單菌落，懸浮于200 uL樣品緩沖液中，95℃處理25min，分別加入5 uL裂解液A和裂解液B，選用EcoRI酶切程序。用全自動(dòng)微生物鑒定設(shè)備運(yùn)行約8h時(shí)后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出待測(cè)菌株的信息。

藥物敏感實(shí)驗(yàn)

使用比濁管對(duì)金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行標(biāo)定并校正。隨后將培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，涂布均勻后貼上藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片將其與培養(yǎng)基表面貼牢，15min內(nèi)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后測(cè)量抑菌圈直徑。并對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥結(jié)果進(jìn)行歸類分析。

耐藥基因圖譜的建立

采用BioNumerics分析軟件對(duì)全自動(dòng)微生物鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，得出金黃色葡萄球菌的耐藥基因圖譜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)特性

Baird Parker培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后菌落為圓形，直徑1～2mm，顏色灰或黑色，周圍環(huán)暈約2～3mm。營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24h后菌落為圓形，直徑2～3mm，表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣完整，未見明顯環(huán)暈。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12h后液體渾濁，靜止后底部有沉淀，輕搖后全部旋起溶解。

形態(tài)觀察

將提純培養(yǎng)的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢呈陽(yáng)性結(jié)果。顯微鏡下菌株呈葡萄球狀排列，邊緣散落菌體呈短鏈狀存在，不存在鞭毛、芽孢、莢膜。金黃色葡萄球菌在Baird Parker培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后的形態(tài)見圖3。金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結(jié)果見圖4。

菌種鑒定結(jié)果

分別調(diào)取平板培養(yǎng)的單菌落，懸浮于40 uL緩沖液中，預(yù)熱后加入裂解液，選用EcoR I酶，在全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)中自動(dòng)運(yùn)行8h，自動(dòng)酶切后得出雜交圖譜，將122株疑似金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的條帶型與鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)條帶型進(jìn)行比較，得出57株菌株為金黃色葡萄球菌，其檢出率為46.7%。

金黃色葡萄球菌的耐藥性

將從牛場(chǎng)取得的樣品中篩選出的57株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，分離得到53株菌株對(duì)多種藥物具有不同程度的耐受性，耐藥性的檢出率為92.9%，對(duì)氨芐西林和青霉素G耐藥的比率分別高達(dá)為78.9%和77.1%，而對(duì)克林霉素、紅霉素、氯霉素及四環(huán)素的耐藥性較低。

金黃色葡萄球菌耐藥基因圖譜

使用BioNumerics生物軟件對(duì)鑒定結(jié)果的圖譜進(jìn)行分析處理，建立金黃色葡萄球菌多重耐藥性的耐藥基因圖譜（見圖5）。由圖譜可知，5耐菌株圖譜為金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素、氯霉素耐藥的基因圖譜，4耐菌株圖譜為金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素耐藥的基因圖譜，3耐菌株為金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林、青霉素G、氯霉素耐藥的基因圖譜；2耐（a）菌株為金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林、青霉素G耐藥的基因圖譜；2耐（b）菌株為金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素耐藥的基因圖譜；2耐（c）為金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素、頭孢哌酮耐藥的基因圖譜；1耐菌株為金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥的基因圖譜；0耐菌株無(wú)明顯耐藥性。通過金黃色葡萄球菌多重耐藥性的耐藥基因圖譜可以更簡(jiǎn)捷分辨出從奶牛場(chǎng)分離出的金黃色葡萄球菌的耐藥情況，可以更快速、合理地指導(dǎo)奶牛場(chǎng)對(duì)奶牛的合理用藥。

討論與結(jié)論

討論

目前，尋找奶牛乳房炎發(fā)病原因最常用的方法是病原菌的分離鑒定，以往的研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，本文使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)針對(duì)從奶牛乳頭涂抹點(diǎn)、牛乳、糞便等樣品分離純化的疑似122株菌株進(jìn)行了快速鑒定，鑒定出57株為金黃色葡萄球菌，其檢出率為46.7%，說明金黃色葡萄球菌是該奶牛場(chǎng)存在的主要致病微生物。目前治療奶牛乳房炎的常用方法是使用抗生素，但大量抗生素的使用會(huì)使金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性，因此，針對(duì)分離純化鑒定得到的57株菌株分別進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，53株菌株對(duì)多種藥物具有不同程度的耐受性，耐藥性檢出率為92.9%，其中51株菌株具有多重耐藥性，主要集中在4耐和5耐，占總菌株的64.9%，而對(duì)氨芐西林和青霉素G耐藥的比率分別高達(dá)78.9%和77.1%，對(duì)克林霉素、紅霉素、氯霉素及四環(huán)素的耐藥性較低，說明該牛場(chǎng)的奶牛近期發(fā)生過乳房炎疾病且波及范圍較大，在此期間使用了大量的抗生素藥物，特別是青霉素類的抗生素。因此，建議奶牛場(chǎng)不要經(jīng)常或單獨(dú)使用含氨芐西林和青霉素的抗生素。

另外，對(duì)于奶牛乳房炎，除藥物防治外，還應(yīng)以預(yù)防為主，因此建議該牛場(chǎng)注意加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、注重?cái)D奶衛(wèi)生、平衡日糧、并進(jìn)行定期檢測(cè)，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，從根本上降低乳房炎的發(fā)病率。此外，還要加強(qiáng)干奶期的預(yù)防，干奶期是奶牛泌乳周期的一個(gè)重要階段，是對(duì)奶牛機(jī)體和乳房健康的重要調(diào)整期，也是控制和治療乳房炎發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，在此階段，藥物可以長(zhǎng)時(shí)間作用于乳房，對(duì)降低下一泌乳期乳房炎發(fā)病率具有顯著作用。

結(jié)論

本研究通過對(duì)從北京某牛場(chǎng)采集的乳頭涂抹樣品、牛乳樣品及糞便樣品等144份樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離純化，得到122株疑似金黃色葡萄球菌菌株，使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)快速確定了57株金黃色葡萄球菌，其檢出率為46.7%。耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其中53株菌株對(duì)多種藥物具有不同程度的耐受性，耐藥性檢出率為92.9%，而其中51株菌株具有多重耐藥性，主要集中在4耐和5耐，占總菌株的64.9%。根據(jù)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的結(jié)果圖譜，使用BioNumerics生物軟件進(jìn)行圖譜的分析處理，建立了金黃色葡萄球菌多重耐藥性的耐藥基因圖譜。因此，建議該奶牛場(chǎng)不要經(jīng)?；騿为?dú)使用含氨芐西林和青霉素的抗生素，而改用其他類抗生素，該實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果可用于指導(dǎo)奶牛場(chǎng)合理用藥，以降低金黃色葡萄球菌的耐藥性，保證生鮮乳的質(zhì)量安全。

創(chuàng)新點(diǎn)

◇全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)用于快速鑒定金黃色葡萄球縮短了鑒定時(shí)間，分析了奶牛場(chǎng)金黃色葡萄球菌的耐藥情況，可快速調(diào)整奶牛場(chǎng)用藥。

專家評(píng)語(yǔ)

該項(xiàng)目通過金黃色葡萄球菌的采集鑒定及其多重耐藥性研究，建立了金黃色葡萄球菌耐藥基因圖譜。研究手段先進(jìn)，具有較強(qiáng)的科學(xué)性.實(shí)用性和完整性。建議加強(qiáng)科學(xué)文獻(xiàn)的學(xué)習(xí)，進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，提高研究深度。