王長遠，全　越，沈冰蕾，姚　笛，于長青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶　163319）

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試驗研究

深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在畢赤氏酵母SMD1168中表達的研究

王長遠，全越，沈冰蕾，姚笛，于長青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

引物根據(jù)Δ6-脂肪酸脫氫酶（D6D）基因以及酵母蛋白表達載體pGAPZαA的多克隆位點進行引物設計，并在上游插入ECoRⅠ位點、下游插入XhoⅠ位點，從深黃被孢霉中克隆D6D基因，構(gòu)建pMD18-T-D6D載體與pGAPZαA-D6D載體。將重組質(zhì)粒線性化，并將其電轉(zhuǎn)導入到畢赤氏酵母（Pichia pastoris SMD1168）中，Zeocin抗生素篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，對重組菌進行誘導表達。經(jīng)過Tricine-SDS-PAGE分析和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western bloting）試驗，證明Δ6-脂肪酸脫氫酶融合蛋白具有免疫學活性。結(jié)果成功構(gòu)建了重組酵母pGAPZαA-SMD1168，為利用基因工程菌生產(chǎn)γ-亞麻酸（GLA）奠定理論基礎。

深黃被孢霉；Δ6-脂肪酸脫氫酶；畢赤氏酵母SMD1168；pGAPZαA表達載體

0　引言

γ-亞麻酸（GLA）作為人體必需不飽和脂肪酸之一，具有降血脂、抗血栓等多種生物性功能［1-4］，在臨床上常被用于防治心梗、冠心病等多種疾?。?］。另有大量研究表明，GLA對多種藻類、G-菌以及一些G+菌生長有一定程度的抑制作用［6-9］。由于GLA在人類健康中的具有重要作用，而成為被人們關注的非常有價值產(chǎn)品，但是由于其產(chǎn)量、生產(chǎn)成本、安全性等問題，使現(xiàn)有來源不能滿足日益增長的市場需求。在脂肪酸代謝途徑中，Δ6-脂肪酸脫氫酶是合成PUFAs途徑過程當中的主要樞紐酶［10-11］，對人體具有非常重要的生理意義。近些年，隨著分子生物學與基因工程技術的飛速發(fā)展，利用此方法構(gòu)建生產(chǎn)γ-亞麻酸的基因工程菌成為人們研究熱點［12］。因此，本試驗室選用適合外源蛋白表達的畢赤氏酵母SMD1168作為受體系統(tǒng)，采用pGAPZαA為表達載體，來探索生產(chǎn)γ-亞麻酸的新途徑。

1　材料

1.1菌株及質(zhì)粒

試驗所用的畢赤氏酵母（Pichia pastoris SMD1168）菌株、深黃被孢霉（Mortieralla isabellina As3.3410）菌株以及E.coli DH5α'由黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院微生物實驗室提供；兔抗D6D多克隆血清為實驗室自行制備；酵母蛋白表達載體pGAPZαA，質(zhì)粒pMD18-T均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2工具酶、試劑與培養(yǎng)基

T4DNA連接酶、XhoⅠ酶、ECoRⅠ酶、DNA Marke購自寶生物工程（大連）有限公司；設計的引物由上海生工合成；常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、含抗生素Zeocin酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基YPDS參照文獻方法［13-15］。

2　方法

2.1D6D基因的克隆與鑒定

按照深黃被孢霉D6D基因的序列，并根據(jù)酵母蛋白表達載體pGAPZαA的多克隆位點進行引物設計，并在上游插入ECoRⅠ酶切位點、下游插入XhoⅠ酶切位點。最終設計的上下游引物如下：

引物P1：5'-GAA TTC GCC GCC ACC ATG GGT ACG GAC C-3'

引物P2：5'-CTC GAG CTC TTC CTT GGG ACG GAG-3'

以深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶（D6D）基因的cDNA為模板，進行擴增目的基因片段。試驗方法：在95℃條件下，預變性5 min；在94℃條件下，繼續(xù)變性1 min；然后在55℃條件下，退火30 s；最后在72℃條件下延伸1.5 min，共計30個循環(huán)。用PCR純化試劑盒對D6D基因進行純化，取純化后的D6D基因與PMD18-T載體進行連接，從而構(gòu)建克隆載體pMD18-T-D6D。

2.2大腸桿菌感受態(tài)細胞、酵母感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化

按常規(guī)方法［13］進行。

2.3酵母蛋白表達載體pGAPZαA-D6D的構(gòu)建

用ECoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD18-T-D6D質(zhì)粒，回收酶切片段，克隆到相同內(nèi)切酶處理過的酵母蛋白表達載體pGAPZαA上，并轉(zhuǎn)化至制備好的感受態(tài)細胞，產(chǎn)物涂布在低鹽LB平板上，平板含25 μg/mL的抗生素Zeocin，在37℃條件下，培養(yǎng)16 h，直至呈現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。取新鮮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌株，提取重組質(zhì)粒，進行PCR，ECoRⅠ和XhoⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒命名為pGAPZαA-D6D。

2.4酵母細胞的轉(zhuǎn)化篩選與陽性克隆的PCR鑒定

取重組表達質(zhì)粒pGAPZαA-D6D進行AvrⅡ酶切線性化，通過電轉(zhuǎn)化法（1 500 V，25 μF，200 Ω），將重組質(zhì)粒 pGAPZαA-D6D電轉(zhuǎn)到畢赤氏酵母SMD1168中，取200 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在含Zeocin的YPDS平板上，在30℃下，培養(yǎng)2～10 d。篩選陽性酵母的單個菌落進行培養(yǎng)，收集液體培養(yǎng)基中的目標細胞，同時采用酸化玻璃珠的方法提取DNA基因組，利用PCR方法鑒定陽性重組克隆。

2.5重組蛋白的SDS-PAGE分析及Western bloting鑒定

將PCR檢測陽性單菌落接種于YPDS培養(yǎng)基中，15%Tricine-SDS-PAGE分析檢測上清液中蛋白的表達。通過轉(zhuǎn)印裝置將目的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，膜經(jīng)10%脫脂乳室溫封閉1 h后，經(jīng)1∶100倍稀釋的兔抗D6D多克隆血清于4℃下孵育過夜，經(jīng)PBST緩沖液充分漂洗3次，每次5 min；再經(jīng)1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫下孵育1 h，PBST緩沖液充分漂洗3次，每次5 min。將制備好的膜置入二氨基聯(lián)苯胺DAB-H2O2顯色液中，在避光的條件下顯色，直至出現(xiàn)條帶，隨后立刻將膜轉(zhuǎn)移到去離子水中終止顯色反應。

3　結(jié)果與分析

3.1深黃被孢霉D6D基因的PCR擴增結(jié)果

以深黃被孢霉D6D基因的cDNA為模板，利用設計的引物進行PCR。

PCR結(jié)果見圖1。

圖1　PCR結(jié)果

由圖1可知，目的基因在1 300 bp左右處出現(xiàn)一條明亮的條帶，其大小與目的片段大小基本一致。

3.2D6D基因重組質(zhì)粒pGAPZαA-D6D的PCR與雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pGAPZαA-D6D的PCR結(jié)果見圖2，重組質(zhì)粒pGAPZαA-D6D的雙酶切結(jié)果見圖3。

圖2　重組質(zhì)粒pGAPZαA-D6D的PCR結(jié)果

圖3　重組質(zhì)粒pGAPZαA-D6D的雙酶切結(jié)果

結(jié)果分析表明，在1 300 bp處有一亮帶，與預期目的片段的大小相似。重組質(zhì)粒經(jīng)ECoRⅠ和XhoⅠ限制性酶雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果分析表明，在1 300 bp和3 000 bp處各有一條明亮的條帶，與預期目的片段的大小一致，證明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPZαA-D6D。

3.3重組畢赤氏酵母SMD1168基因組的PCR鑒定

篩選陽性重組克隆，提取重組酵母SMD1168的基因組DNA，利用PCR方法鑒定。

重組畢赤氏酵母SMD1168基因組的PCR結(jié)果見圖4。

圖4　重組畢赤氏酵母SMD1168基因組的PCR結(jié)果

由圖4可知，在1 300 bp左右處出現(xiàn)一條亮帶，與預期片段大小相符，可以證明重組深黃被孢霉D6D基因已整合到酵母SMD1168的染色體上。

3.4表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析及Western bloting鑒定

經(jīng)PCR鑒定后的陽性重組子進行培養(yǎng)，通過Tricine-SDS-PAGE分析檢測上清液中蛋白的表達。

重組畢赤氏酵母SMD1168表達產(chǎn)物的SDSPAGE電泳見圖5，重組畢赤氏酵母SMD1168表達產(chǎn)物的Western bloting電泳見圖6。

圖5　重組畢赤氏酵母SMD1168表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳

圖6　重組畢赤氏酵母SMD1168表達產(chǎn)物的Western bloting電泳

由圖5可知，在約70 kDa的位置有一條明顯的蛋白條帶，其分子量與D6D的理論值相符，而陰性對照菌株在相應處無明顯的蛋白條帶，說明D6D基因在畢赤氏酵母SMD1168中得到表達。對重組畢赤酵母表達產(chǎn)物進行Western bloting電泳，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進行免疫學反應，可以觀察到在約70 kDa處呈現(xiàn)了特異的蛋白質(zhì)印跡帶，從而證明表達的重組蛋白具有良好的免疫學活性。

4　討論

本研究采用pGAPZαA為表達載體，SMD1168畢赤氏酵母為受體系統(tǒng)，來構(gòu)建高效、分泌型的畢赤酵母表達系統(tǒng)。酵母表達系統(tǒng)相對于原核表達系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢［16-17］，并且酵母菌與人類的關系十分密切，一般情況下沒有致病性。畢赤氏酵母組成型表達載體pGAPZα能生產(chǎn)比誘導型表達載體pPICZ和pPICZαA更高的外源蛋白，且不需要誘導，無毒性，操作簡單。深黃被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在酵母SMD1168中表達未見報道。本試驗構(gòu)建的重組酵母載體經(jīng)電轉(zhuǎn)化到畢赤氏酵母SMD1168中，通過鑒定證明Δ6-脂肪酸脫氫酶融合蛋白具有一定的免疫學活性，說明通過酵母表達系統(tǒng)表達重組此蛋白是可行的。但是通過試驗發(fā)現(xiàn)，其蛋白的表達量不高，達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，后期將通過更換表達載體與優(yōu)化表達條件等方法提高蛋白表達，為利用工程菌生產(chǎn)γ-亞麻酸奠定理論基礎。

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Study on the Expression of Mortieralla Isabellina Δ6-fatty Acid Desaturase Gene in the Pichia Pastoris Yeast SMD1168

WANG Changyuan，QUAN Yue，SHEN Binglei，YAO Di，YU Changqing
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Primers are designed based on Δ6-fatty acid desaturase（D6D） genes conserved region and pGAPZαA vector cloning sites.For primer design，downstream，respectively，introduced ECoRⅠand XhoⅠrestriction sites.From Mortierallaisabellina cloned Δ6-fatty acid desaturase gene（D6D） .D6D gene is cloned from Mortieralla isabellina，vector pMD18-TD6D with pGAPZαA-D6D.That recombination vector is obtained.After ligation of the plasmids by AvrⅡ，being integratedinto the genome of host yeast P.pastoris SMD1168 by electroporation and sereening the converter by Zeocin.To induce expression recombinant bacteria，and the Immunologic competence is detected with Tricine-SDS-PAGE and Western bloting.The Yeast pGAPZαA-SMD1168 plasmid is construeted suceessfully.For the mass production of GLA has laid a solid foundation.

Mortieralla isabellina；Δ6-fatty acid desaturase；Pichia pastoris SMD1168；expression vector pGAPZαA

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.030

2016-05-31

黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關項目（HNK125A-04-16）。

王長遠（1976— ），男，博士，教授，研究方向為食品科學。