李婷，郭鵬翔，雷霆雯，王季石

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550004；2.貴州省人民醫(yī)院；3 貴州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；4 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

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噻嗎洛爾對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI 8226增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

李婷1，郭鵬翔2，雷霆雯3，王季石4

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550004；2.貴州省人民醫(yī)院；3 貴州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；4 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的觀察非選擇性β-腎上腺素能受體阻斷劑噻嗎洛爾對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI 8226增殖及凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI 8226細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)1、2、3、4、5、6組，分別加入終濃度為1、2.5、5、20、50、100 μmol/L的噻嗎洛爾培養(yǎng)，以不添加細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，以不添加藥物的細(xì)胞液為陰性對(duì)照組，觀察培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖情況。另取適量RPMI 8226細(xì)胞，分為A、B、C組，分別加入終濃度為 2.5、20、50 μmol/L噻嗎洛爾培養(yǎng)，設(shè)只加細(xì)胞培養(yǎng)液的對(duì)照組。取培養(yǎng)72 h時(shí)各組細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)細(xì)胞Bax、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果隨濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率升高，且隨干預(yù)時(shí)間增加，細(xì)胞增殖抑制率升高，P均<0.05。培養(yǎng)72 h時(shí)A、B、C組及對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為7.17%±0.06%、10.56%±0.65% 、15.27%±0.86%、3.93%±0.25%，組間兩兩比較，P均<0.05。A、B、C組 Bax mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。B、C組Bcl-2 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)；C組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于A組(P<0.05)。B、C組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于A組(P均<0.05)。A、B、C組 Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論噻嗎洛爾可抑制RPMI 8226 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與噻嗎洛爾可上調(diào)Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

噻嗎洛爾;多發(fā)性骨髓瘤;細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；B細(xì)胞淋巴瘤因子2；Bax；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種漿細(xì)胞惡性克隆性疾病，病理特征為異常增生的漿細(xì)胞分泌大量單克隆免疫球蛋白及其片段，臨床可表現(xiàn)為廣泛骨質(zhì)破壞，伴有反復(fù)感染、貧血、高鈣血癥、高黏滯綜合征、腎功能不全等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖和凋亡的失衡是其發(fā)生、發(fā)展的重要因素，B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bax是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)分子，可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。放、化療及造血干細(xì)胞移植是臨床常用的治療方法，可改善MM預(yù)后[3]，但具有價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。以往臨床常用β受體阻滯劑治療心血管疾病[4]，近年研究發(fā)現(xiàn)其可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成、抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5，6]。噻嗎洛爾同為非選擇性β受體阻滯劑，具有生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)。2014年9月～2016年2月，我們觀察了噻嗎洛爾對(duì)人MM細(xì)胞株RPMI 8226增殖及凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、藥物、儀器及試劑RPMI 8226細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科所惠贈(zèng)，用含10%滅活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中隔天換液，24～48 h傳代1次。噻嗎洛爾購(gòu)自德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)BS購(gòu)于杭州四季青公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)ITC Annexin V Apoptosis Detection Kite I購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR引物由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人Bax 多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體、兔抗人Caspase-9多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2噻嗎洛爾對(duì)RPMI 8226細(xì)胞增殖的影響觀察采用MTT法。取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI 8226細(xì)胞，1×105/孔接種于96孔板，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)1、2、3、4、5、6組，分別加入噻嗎洛爾使藥物終濃度為1、2.5、5、20、50、100 μmol/L，以不添加細(xì)胞和藥物的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，以只添加細(xì)胞不添加藥物為陰性對(duì)照。分別于干預(yù)24、48、72 h各取200 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液接種于適量各組細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，離心后取上清，加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A)，重復(fù)3次，取平均值計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(A對(duì)照組-A給藥組)/A對(duì)照組×100%。

1.3噻嗎洛爾對(duì)RPMI 8226細(xì)胞凋亡的影響及細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9 mRNA和蛋白檢測(cè)①噻嗎洛爾對(duì)RPMI 8226細(xì)胞凋亡的影響觀察：采用流式細(xì)胞儀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI 8226細(xì)胞，1×106/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，分為A、B、C組，分別加入終濃度為 2.5、20 、50 μmol/L的噻嗎洛爾，每組5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)只加培養(yǎng)液的5個(gè)復(fù)孔為對(duì)照組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取適量各組細(xì)胞，1 000 r/min離心8 min，棄上清，3 mL PBS沖洗兩次。加入AnnexinV Binding Buffer和PI各5 μL，混勻后室溫避光孵育15 min。加入400 μL AnnexinV Binding buffer后混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組干預(yù)72 h細(xì)胞的凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。②各組RPMI 8226細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9 mRNA和蛋白檢測(cè)：采用RT-PCR法。檢測(cè)各組干預(yù)72 h時(shí)細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2 mRNA：采用TRIzol試劑盒提取總RNA，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。UltraSYBR Mixture試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，其中GAPDH作為內(nèi)參。Bcl-2上游引物5′-TGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3′，下游引物5′-GATCCAGGTGTGCAGGTG-3′)；Bax上游引物5′-TCTGACGGCAACTTCAACTG-3′，下游引物5′-GTCCCAAAGTAGGAGAGGAGG-3′;Caspase-3上游引物5′-CAAATGGACCTGTTGACCTG-3′，下游引物5′-ATGGCACAAAGCGACTGGATG-3′；Caspase-9上游引物5′-TGGATGCCCTGTGTCGGTC-3′，下游引物5′-CTGAAGACGAGTCCCCTGGC-3′；GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、1 min，延伸60 ℃、1 min。以GAPDH作為內(nèi)參校正，采用2-ΔΔCt法來(lái)分析基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Western blotting法檢測(cè)1.4方法中各組干預(yù)72 h細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)：取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，按照蛋白抽提試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg變性后蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；5%牛血清蛋白TBS溶液室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜，加二抗室溫孵育1 h。TBST 洗滌，顯影、曝光。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值

2　結(jié)果

2.1各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率見(jiàn)表1，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖抑制率均降低(P均<0.05)，且呈濃度、時(shí)間依賴性(P均<0.05)。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率±s)

2.2各組RPMI 8226細(xì)胞凋亡率比較干預(yù)72 h時(shí)A、B、C組及對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為7.17%±0.06%、10.56%±0.65% 、15.27%±0.86%、3.93%±0.25%，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3各組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較各組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白比較見(jiàn)表2。

表2　干預(yù)72 h各組Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與A組比較，◇P<0.05。

3　討論

目前，MM發(fā)病率占惡性血液疾病中的13.4%，病死率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤病死率的19%[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MM是一種克隆性B細(xì)胞疾病，其特征為骨髓漿細(xì)胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白過(guò)度生成，常伴有多種并發(fā)癥，且極易出現(xiàn)細(xì)菌性感染[6]。MM發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，與遺傳因素、細(xì)胞因子異常以及骨髓微環(huán)境等密切相關(guān)，目前的主要治療方法是化療及造血干細(xì)胞移植，普通化療以及蛋白酶抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑等新藥的應(yīng)用生存率有所提高[7]，但該病仍無(wú)法治愈，化療耐藥及副作用是難以逾越的難題。而造血干細(xì)胞移植其昂貴的價(jià)格也限制了其在中國(guó)患者中的應(yīng)用。多發(fā)性骨髓瘤及其治療常影響腎臟、免疫、骨骼、血液和神經(jīng)系統(tǒng)功能等。由此造成的器官功能障礙往往影響患者的生活質(zhì)量，并限制隨后的治療，甚至可能導(dǎo)致死亡，因此尋求有效藥物提高療效十分必要。

噻嗎洛爾又叫噻嗎心安，是一種非選擇性β-腎上腺素能拮抗劑,臨床常用于其治療高血壓病、心絞痛、心動(dòng)過(guò)速及青光眼，是治療青光眼的一線藥物。其主要作用機(jī)制是通過(guò)抑制腎上腺素能受體從而減慢心率、減弱心肌收縮力、降低血壓、減少心肌耗氧量,改善左室和血管的重構(gòu)以及減少房水生成。最新研究發(fā)現(xiàn)，噻嗎洛爾可用于治療嬰幼兒血管瘤[8]，其作用機(jī)制可能是：早期通過(guò)減少一氧化氮釋放使血管收縮;中期通過(guò)抑制促血管生成的信號(hào)如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶9，并導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯；后期通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而造成腫瘤消退[9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噻嗎洛爾能明顯抑制RPMI 8226細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間劑量依賴性，其對(duì)RPMI 8226增殖的IC50值約為20 μmol/L。在相同藥物時(shí)間作用下，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度升高而逐漸增加。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡，與維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定及腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)。研究顯示，凋亡抑制基因過(guò)表達(dá)及促凋亡基因活性減低與骨髓瘤的發(fā)病、治療耐藥及預(yù)后密切相關(guān)[10]，因此，干預(yù)細(xì)胞凋亡途徑，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為骨髓瘤治療的重要手段。目前凋亡發(fā)生的途徑有：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。線粒體途徑，也叫內(nèi)源性途徑，在細(xì)胞凋亡中起中心作用。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡通路中最為重要的一組信號(hào)分子，此家族分子包括抗細(xì)胞凋亡(如 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1)和促細(xì)胞凋亡(如Bax、Bad、Bak)蛋白兩大類[11]，其中Bax/Bcl-2在細(xì)胞凋亡過(guò)程中相互作用，調(diào)控細(xì)胞色素C等物質(zhì)從線粒體的釋放，最終調(diào)控線粒體凋亡途徑。Bax 可通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)上打孔、改變構(gòu)象或者發(fā)生寡聚化，破壞線粒體膜，引起細(xì)胞色素C釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。而B(niǎo)cl-2則相反，其主要分布于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，控制著線粒體膜的通透性，抑制細(xì)胞色素C的釋放及Caspase的激活進(jìn)而抑制凋亡。另外，Bcl-2還可通過(guò)與 Bax 形成復(fù)合物阻斷其功能從而抑制細(xì)胞凋亡[13]。在本研究顯示，與對(duì)照組相比抗凋亡蛋白Bcl-2在mRNA和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增加，使得Bax/Bcl-2比值升高，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，提示噻嗎洛爾誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI 8226凋亡可能是通過(guò)Bcl-2家族的變化而實(shí)現(xiàn)的。

Caspase細(xì)胞凋亡家族也與Bax/Bcl-2密切相關(guān)，Bax表達(dá)增多或Bcl-2表達(dá)減少均可誘導(dǎo)Caspase家族蛋白激活，繼而發(fā)揮促凋亡作用[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)Caspase家族成員共14個(gè)，其中Caspase-3被認(rèn)為是該家族中最關(guān)鍵的蛋白酶[15],有“死亡執(zhí)行蛋白酶”的稱號(hào)。正常情況Caspase-3以無(wú)活性酶原形式存在于胞漿中，被活化后可酶解切割DNA依賴的蛋白激酶等，從而干擾DNA復(fù)制及損傷修復(fù)等。Caspase-9是凋亡啟動(dòng)蛋白，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，常參與啟動(dòng)下游的蛋白酶，引起凋亡[16]。在本次噻嗎洛爾對(duì)RPMI 8226細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過(guò)程中Caspase-3及Caspase-9的mRNA表達(dá)均上調(diào)，而在蛋白水平未見(jiàn)明顯變化，出現(xiàn)以上差異的原因可能與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯等眾多因素有關(guān)。由此我們推測(cè)噻嗎洛爾可能是通過(guò)抑制Bcl-2和激活Bax信號(hào)通路途徑促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的，但是否還通過(guò)其它凋亡相關(guān)蛋白促進(jìn)其凋亡仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，噻嗎洛爾可抑制RPMI 8226 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of timolol on proliferation and apoptosis of human multiple myeloma cell line RPMI 8226

LI Ting1,GUO Pengxiang,LEI Tingwen,WANG Jishi

(1 Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

ObjectiveTo investigate the effects of timolol on cell proliferation and apoptosis of human multiple myeloma cell line RPMI-8226,and to explore its potential anti-tumor mechanism.MethodsThe RPMI 8226 cells in the logarithmic phase were divided into groups 1,2,3,4,5,and 6,and then were added with 1,2.5,5,10,20,50 and 100 μmol/L timolol,respectively.The nutrient solution without adding cells and drugs was taken as the blank control group.The negative control group was only added with cells.At 24,48 and 72 h of cultivation,MTT method was used to observe the proliferation of different groups.In addition,the appropriate amount of RPMI 8226 cells were divided into groups A,B and C which were added with 2.5,20 and 50 μmol/L timolol as the final concentrations,respectively.Meanwhile,the control group was only added with cell culture fluid.And then flow cytometry was used to detect the apoptosis effect.Changes in the expression of Caspase-3,Caspase-9,Bax and Bcl-2 protein and mRNA were detected by Western blotting and RT-PCR,respectively.ResultsAfter treated with timolol for 24,48 and 72 h,the inhibition rate increased with the increase of drug concentrations and the extension of the time(all P<0.05).After treated with timolol for 72 h,the apoptotic rates of groups A,B,C were 7.17%±0.06%,10.56%±0.65%,15.27%±0.86% and 3.93%±0.25%(all P<0.05).The mRNA and protein expression of Bax in the group A,B and C was significantly high than that of the control group(all P<0.05).The mRNA and protein expression of Bcl-2 in the groups B and C was much higher than that in the control group(all P<0.05).Compared with group A,the mRNA expression of Bcl-2 in the group C was higher.Meanwhile,the Caspase-3 mRNA expression was higher in groups B and C as compared with that of group A(all P<0.05).And the mRNA expression of Caspase-9 in the groups A,B and C was higher than that in the control group(all P<0.05).ConclusionTimolol inhibits the proliferation and promotes apoptosis of RPMI 8226 cells,the mechanism may be that it can up-regulate the expression of Bax,Caspase-3 and Caspase-9,and inhibit the Bcl-2 expression.

timolol;multiple myeloma;cell proliferation;apoptosis;Bcl-2;Bax;Caspase-3;Caspase-9

貴州省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(黔科合LH字2014-7010)。

李婷(1990-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)閻盒匝翰?。E-mail：1044207658@qq.com。

簡(jiǎn)介：郭鵬翔(1971-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠翰〉闹委?。E-mail：gxgdx118@sna.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.007

R730.2

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1002-266X(2016)27-0024-04

2016-02-25)