李　晶， 潘群皖， 朱再滿， 李　敏， 葉　政

(皖南醫(yī)學院生理教研室， 安徽 蕪湖 241002)

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嗎啡依賴位置偏愛大鼠穿梭狀態(tài)下內側前額皮層的腦電特征*

李晶， 潘群皖△， 朱再滿， 李敏， 葉政

(皖南醫(yī)學院生理教研室， 安徽 蕪湖 241002)

目的：研究嗎啡依賴位置偏愛大鼠穿梭狀態(tài)下內側前額皮層(mPFC)腦電特征與覓藥行為的相關性。方法：將40只大鼠隨機分為4組(n=10)：嗎啡PL組、鹽水PL組、嗎啡IL組、鹽水IL組。采用腦立體定位術在各組大鼠mPFC的邊緣前區(qū)(PL區(qū))或邊緣下區(qū)(IL區(qū))埋置電極，建立嗎啡依賴條件性位置偏愛(CPP)大鼠模型，遙測分析各組大鼠建模前后穿梭時mPFC腦電各波百分比的差異。結果：嗎啡PL組和IL組大鼠建模后戒斷癥狀明顯，在白箱活動時間和路程明顯增加。嗎啡PL組大鼠建模后與對照組相比，向白箱穿梭時，腦電δ波比例明顯減少，β波比例明顯增加；向黑箱穿梭時，上述腦波出現相反的改變。嗎啡IL組大鼠建模后與對照組比較，向白箱穿梭時，腦電δ波比例明顯增加，β波及α波比例明顯減少；向黑箱穿梭時，各腦波比例與對照組相比無明顯差異。結論：嗎啡CPP大鼠穿梭狀態(tài)下mPFC的PL區(qū)和IL區(qū)腦電改變不同，且向伴藥箱穿梭與非伴藥箱穿梭發(fā)生的腦電變化也不同，提示不同覓藥環(huán)境線索在mPFC不同腦區(qū)產生的腦電改變可能存在不同機制。

嗎啡依賴；條件性位置偏愛；內側前額皮層；腦電；遙測；大鼠

嗎啡等阿片類藥物長期使用后，可使機體成癮產生軀體和心理依賴，即成癮者陷入強迫性覓藥、用藥，甚至戒斷后復吸的惡性循環(huán)[1]。新近研究指出，藥物成癮的形成與內側前額皮層(medial prefrontal cortex，mPFC) 相關腦區(qū)的功能異常緊密相關[2，3]，其背側部的邊緣前區(qū)(prelimbic cortex，PL)和腹側部的邊緣下區(qū)(infralimbic cortex，IL)參與成癮有關的動機形成和調節(jié)過程[4,5]。本室通過立體定位腦內電極埋藏結合腦電遙測技術，在條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)視頻箱內，計測分析嗎啡依賴CPP大鼠穿梭狀態(tài)下mPFC不同腦區(qū)原始腦電活動的特異性改變，旨在進一步明確mPFC不同腦區(qū)在大鼠嗎啡依賴形成中的作用及覓藥環(huán)境線索對mPFC腦電活動和覓藥行為的影響，該方面研究少見報道。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物篩選40只符合實驗條件的SPF級雄性SD大鼠，體重(280～320)g，購自愛爾麥特科技有限公司〔合格證號：SCXK(蘇)2009-0001〕。動物自由攝食、飲水，室溫21℃～25℃，自然光照。將大鼠隨機分成4組(n=10)：嗎啡PL組、鹽水PL組、嗎啡IL組、鹽水IL組。

1.1.2藥品和儀器鹽酸嗎啡注射液(批號：110508-2)，沈陽第一制藥廠；CPP視頻分析系統(型號：JLBehv)，上海吉量科技有限公司；腦立體定位儀(型號：江灣2型)，第二軍醫(yī)大學；生理無線遙測系統(型號：BW-200)，成都泰盟科技有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠mPFC腦區(qū)電極埋藏經1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后(5 ml/kg)，俯臥位固定大鼠于腦立體定位儀上(耳間線高于門齒桿3 mm，使前、后囟位于同一水平面)。術區(qū)剪毛、消毒，切開、剝離頭皮和骨膜，暴露骨縫。參考腦立體定位圖譜[6]確定大鼠PL區(qū)和IL區(qū)位置：PL組大鼠定位PL區(qū)(前囟向前3 mm，中縫旁開0.6 mm，硬膜以下3.6 mm)；IL組大鼠定位IL區(qū)(前囟向前3.2 mm，中縫旁開0.6 mm，硬膜以下5.2 mm)。牙科鉆于定位點打孔，植入直徑0.3 mm的記錄電極，頭皮下放置參考電極，采用牙科水泥封固，縫合切口。術后單籠飼養(yǎng)，恢復7 d, 青霉素400 kU/kg皮下注射，每日1次，連續(xù)5 d。

1.2.2大鼠CPP箱適應性習服CPP視頻系統主要通過攝像追蹤技術實時記錄分析動物在CPP箱內的運動軌跡，進而定量計測動物的行為學指標。本實驗CPP箱由等體積的黑箱和白箱組成，兩箱之間有可抽動的不透明擋板間隔，當抽出擋板時，動物可在兩箱中自由穿梭。建模前抽出擋板，使各組大鼠在CPP箱中適應性習服3 d，每日在箱中自由活動15 min，于第3天觀察記錄大鼠15 min內在兩箱活動時間及運動路程。習服期CPP測試結果表明96%以上的大鼠天然偏愛黑箱，剔除偏愛白箱大鼠。

1.2.3建立嗎啡依賴CPP大鼠模型通過制作CPP模型研究動物對成癮藥物的精神依賴性。建模階段，插入擋板隔開黑、白箱通道，進行CPP訓練。實驗采用傾向性設計，以非偏愛箱白箱為伴藥箱。嗎啡PL組和嗎啡IL組大鼠每日皮下交替注射嗎啡和NS[3,7]，如第1天 8∶00注射嗎啡，18∶00注射生理鹽水(NS)，第2天 8∶00注射NS，18∶00注射嗎啡，以此類推共注射8 d，嗎啡注射后大鼠放入白箱45 min，NS注射后放入黑箱45 min。嗎啡首日劑量10 mg/kg，第2～6天每日遞增10 mg/kg，第6～8天劑量達到并維持60 mg/kg。鹽水組同法sc等體積NS。分別在CPP訓練結束24 h和72 h后，抽出隔板，任大鼠自由活動15 min，使用視頻攝像軟件記錄大鼠白箱活動時間和白箱運動路程。通過組間比較和組內給藥前后比較，以確定大鼠對伴藥箱產生CPP。

1.2.4大鼠戒斷癥狀觀察建模后停止給藥，使大鼠自然戒斷24 h～72 h，觀察其戒斷癥狀。大鼠戒斷癥狀以改良的柳田知司評分法[8]進行評分：輕微煩躁或間歇咬牙0.5分；碰觸激惹、間歇意向震顫、明顯煩躁、輕微流涎、連續(xù)咬牙各1分；靠近激惹、姿勢異常、連續(xù)意向震顫、明顯流涎各2分；軟便或流淚4分；腹瀉不成形為8分；體重減少2%～4%為5分，減重4%～6%為10分，減重6%～8%為15分。對每只大鼠的戒斷癥狀各項分值進行總和。

1.2.5mPFC自發(fā)腦電的遙測分析打開無線遙測發(fā)射子磁控開關，將其固定于大鼠背部，發(fā)射子輸入端兩極分別接記錄電極和參考電極，將大鼠投入CPP視頻監(jiān)控箱內，通過發(fā)射子實時采集大鼠自發(fā)腦電信號，并經智能接收機解碼、網絡中心機將腦電信號輸送至電腦輸出腦電圖，進一步利用系統軟件的快速傅里葉變換功能對原始腦電進行處理分析[9]。采用上述方法記錄各組大鼠建模前后、穿梭狀態(tài)下(黑箱-白箱穿梭、白箱-黑箱穿梭)mPFC腦電活動。

1.3統計學分析

2　結果

2.1嗎啡依賴CPP大鼠戒斷癥狀評分情況

建模前，大鼠均無戒斷癥狀(評分為0分)。建模24 h、72 h后，鹽水PL和IL組大鼠無戒斷癥狀出現(評分為0分)；嗎啡PL和IL組大鼠表現出不同程度的激惹、姿勢異常、煩躁、意向震顫、磨牙、流涎、流淚、腹瀉等戒斷癥狀。建模24 h、72 h后，嗎啡PL組大鼠戒斷癥狀評分(12.5±1.7)分、(15.7±1.4)分，明顯高于同時段鹽水PL組及建模前(P<0.01)；嗎啡IL組大鼠戒斷癥狀評分(14.1±1.6)分、(16.8±1.9)分，明顯高于同時段鹽水IL組及建模前(P<0.01)。

2.2CPP訓練前后大鼠在白箱活動時間和路程變化

建模前各組大鼠在白箱中活動時間和路程無明顯差異。建模后24 h、72 h，嗎啡PL和IL組大鼠與鹽水PL和IL組大鼠及建模前相比，在白箱活動時間及運動路程均明顯增加(P<0.05,P<0.01)，且建模后72 h，嗎啡PL和IL組大鼠對伴藥箱(白箱)表現出更強烈的CPP現象，建模后嗎啡PL和IL組大鼠同時段組間比較無明顯差異。鹽水PL和IL組大鼠組間比較及建模前后比較均無明顯差異(表1，表2)。

GroupBeforemodeling24haftermodeling72haftermodelingNSPLcontrol120.3±33.5118.4±28.7131.2±41.7NSILcontrol125.5±37.2129.6±42.4133.7±49.3MorphinePL116.3±25.5230.6±47.8**##365.2±62.7**##MorphineIL124.2±31.4221.8±50.6**##394.4±76.3**##

PL: Prelimbic cortex; IL: Infralimbic cortex

**P<0.01vsbefore modeling;?##P<0.01vsNS control group

GroupBeforemodeling24haftermodeling72haftermodelingNSPLcontrol6.55±4.468.66±4.189.21±3.77NSILcontrol9.47±3.199.16±3.437.47±4.11MorphinePL8.72±2.4016.63±5.95*#18.50±6.00*#MorphineIL7.96±4.1515.96±7.70*#16.46±6.74*#

PL: Prelimbic cortex; IL: Infralimbic cortex

*P<0.05vsbefore modeling;?#P<0.05vsNS control group

2.3大鼠穿梭時mPFC腦電變化

2.3.1大鼠穿梭時PL區(qū)腦電變化建模72 h后，嗎啡PL組大鼠與鹽水PL組相比，向白箱穿梭時，其PL區(qū)腦電活動呈現：δ波明顯減少(P<0.05)，β波明顯增加(P<0.01)，主要為β2波增加(P<0.01)；向黑箱穿梭時，δ波明顯增加(P<0.01)，β波明顯減少(P<0.01)，β1波和β2波均顯著減少。嗎啡CPP大鼠穿梭時PL區(qū)腦電θ波和α波變化與對照組相比無顯著差異(圖1)。

2.3.2大鼠穿梭時IL區(qū)腦電變化建模72 h后，嗎啡IL組大鼠與鹽水IL組相比，當嗎啡CPP大鼠由黑箱向白箱穿梭時，IL區(qū)腦電活動出現：δ波明顯增多(P<0.01)，α波明顯減少(P<0.05)，主要為α1波減少(P<0.05)，β波明顯減少(P<0.01)，β1波及β2波均明顯減少(P<0.05,P<0.01)；由白箱向黑箱穿梭時，嗎啡CPP大鼠IL區(qū)腦電各波與對照組相比均無統計學差異(圖2)。

A：From black to white box; B：From white to black box; PL: Prelimbic cortex

*P<0.05,**P<0.01vsPL control group

A: From black to white box; B: From white to black box; IL: Infralimbic cortex

*P<0.05,**P<0.01vsIL control group

2.3.3嗎啡CPP大鼠穿梭時PL區(qū)與IL區(qū)腦電比較建模72 h后，嗎啡IL組大鼠與嗎啡PL組相比，向白箱穿梭時，嗎啡IL組大鼠腦電δ波明顯增多(P<0.01)，θ波明顯增多(P<0.05)，β波(β1波及β2波)明顯減少(P<0.01)；向黑箱穿梭時，嗎啡IL組大鼠腦電δ波明顯減少(P<0.01)，θ波明顯增多(P<0.05)，其余各波與嗎啡PL組相比均無明顯差異(圖3)。

A：From black to white box; B：From white to black box； PL: Prelimbic cortex; IL: Infralimbic cortex

*P<0.05,**P<0.01vsPL morphine group

3　討論

mPFC在藥物依賴形成中的作用正逐漸被研究者認識，國內外有關mPFC的藥物依賴研究報道主要集中在mPFC參與的中樞獎賞通路、對成癮藥物的學習、記憶及成癮藥物引起的腦內蛋白表達改變等[10-12]?；趍PFC與伏隔核和中腦腹側背蓋之間存在神經環(huán)路[13]，有研究者認為mPFC在阿片藥物相關線索與獎賞效應聯合的學習過程中起調節(jié)作用[14]。如mPFC中PL區(qū)的NMDA受體阻斷，可影響中腦多巴胺邊緣系統的阿片獎賞通路[15], PL區(qū)參與的神經環(huán)路部分神經元損傷可減少成癮藥物誘導的CPP現象重現[16]，IL區(qū)損傷則可能影響成癮行為的抑制性調控。上述文獻表明mPFC在阿片成癮后的覓藥行為改變中起著重要作用。mPFC是形成隨意運動意識、動機的主要皮層聯絡區(qū)，阿片成癮者的mPFC腦電活動不僅反映了皮層神經元對阿片藥物的電生理反應特性，也反映了成癮期的認知活動和覓藥動機信息[17]。

本實驗主要研究嗎啡依賴CPP大鼠穿梭狀態(tài)下mPFC的遙測腦電變化與覓藥行為的關系。通過研究發(fā)現嗎啡CPP大鼠腦電的特異性變化，可能與嗎啡引起的中樞神經系統的適應性改變有關。有文獻指出[13]，嗎啡使用周期過長會引起mPFC參與的中樞神經環(huán)路功能、結構發(fā)生可塑性改變，進而使突觸傳遞活動發(fā)生變化，通過編碼相應的神經元集群發(fā)放的突觸后電位的總和波，引起PL區(qū)和IL區(qū)腦電活動的變化。有研究認為[18]PL區(qū)神經元有促進覓藥功能，阿片藥物的長期應用可能使PL區(qū)參與的神經環(huán)路轉變?yōu)橐捤巹訖C易化區(qū)，導致動物覓藥行為敏感化，趨向性藥物依賴行為增多。研究者對嗎啡依賴大鼠穿梭時PL區(qū)腦電的小波包提取、功率譜和熵分析顯示[19]：當成癮大鼠向伴藥箱穿梭時，PL神經元放電頻率增加，EEG平均波幅減小，α波和β波相對功率增加，θ波和δ波相對功率降低，β波小波信息熵增高(熵增高，表明腦電復雜性增高)；向非伴藥箱穿梭時，PL腦電表現出相反的改變。另有研究報道[16]，IL區(qū)是調控動機、行為的重要腦區(qū)之一，IL區(qū)中部分神經元具有覓藥抑制功能，當IL區(qū)神經元選擇性失活時，可促進海洛因成癮大鼠覓藥復燃，長期攝入阿片藥物能夠使IL區(qū)部分神經元功能、結構受損，導致成癮者對覓藥渴求、用藥行為的控制能力下降[20]。本研究與上述文獻報道的實驗結果均表明：嗎啡CPP大鼠在向白箱穿梭時，受到白箱等伴藥線索的刺激，PL的覓藥動機易化區(qū)神經元被激活，興奮性增高，其腦電活動呈高頻去同步化快波增多趨勢，腦電復雜度增高，精神行為學方面表現出覓藥探究意識增強；IL區(qū)的部分皮層神經元活動被抑制，興奮性降低，其腦電呈同步化慢波增多改變。嗎啡CPP大鼠在向黑箱穿梭時，非伴藥線索黑箱，可抑制PL區(qū)神經環(huán)路的興奮輸入，使其神經元興奮性降低，PL腦電活動呈同步化慢波增多，腦電相似性增高(熵值低)，精神行為學方面表現出相對安靜，覓藥探究意識減弱；IL區(qū)腦電活動在大鼠向黑箱穿梭時，與對照組相比，無顯著差異。進一步比較嗎啡IL組和嗎啡PL組大鼠腦電結果，發(fā)現嗎啡CPP大鼠向白箱穿梭時，IL區(qū)腦電慢波(δ波和θ波)比PL區(qū)明顯增多， 快波β波明顯減少，與前述結果分析相一致；當大鼠向黑箱穿梭時，IL區(qū)腦電與PL區(qū)相比，δ慢波明顯減少，而θ慢波明顯增多，為何在兩種穿梭狀態(tài)下IL腦電θ波均比PL區(qū)增多？比較鹽水PL組和鹽水IL組大鼠腦電發(fā)現，正常大鼠IL區(qū)腦電θ波比PL區(qū)增多，由此判斷θ波增多可能與戒斷期嗎啡CPP大鼠的覓藥動機改變無關。

綜上，嗎啡CPP大鼠穿梭狀態(tài)下mPFC的EEG結果表明，PL區(qū)和IL區(qū)在成癮過程中的作用不同。因此在同一穿梭狀態(tài)下其腦電改變不同，同時大鼠向伴藥箱穿梭與非伴藥箱穿梭發(fā)生的腦電變化也不同，可能不同覓藥環(huán)境線索在mPFC不同腦區(qū)產生的腦電改變存在不同機制。

[1]曾紅, 郭斯萍. 易感人格的工作記憶特征對藥物成癮的調節(jié)機制[J]. 心理科學進展, 2011, 19(3): 420-426.

[2]Saedi Marghmaleki V, Alaei HA, Azizi Malekabadi H,etal. Effect of Physical Activity on Symptoms of Morphine Addiction in Rats, after and before of Lesion of the mPFC Area[J].IranJBasicMedSci, 2013, 16(10): 1091-1099.

[3]李晶, 潘群皖, 白家明, 等. 嗎啡急性戒斷大鼠邊緣前皮層無線遙測腦電活動的研究[J]. 中國藥理學通報, 2014, 30(1): 122-125.

[4]王益琦, 劉惠芬. 覓藥行為消退的研究進展[J]. 中國藥物依賴性雜志, 2011, 20(5): 334-339.

[5]De Jaeger X, Bishop SF, Ahmad T,etal. The effects of AMPA receptor blockade in the prelimbic cortex on systemic and ventral tegmental area opiate reward sensitivity[J].Psychopharmacol, 2013, 255(3): 687-695.

[6]Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates[M/OL]. 6thedition. Elsevier Academic Press, 2007: 46-58.

[7]文迪, 馬春玲, 叢斌, 等. 側腦室注射八肽膽囊收縮素及其受體拮抗劑對嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀的影響[J]. 中國藥理學通報, 2011, 27(10): 1363-1368.

[8]李晶, 潘群皖, 朱再滿. 嗎啡依賴大鼠戒斷期額葉聯絡皮層腦電活動的分析[J]. 中國藥物依賴性雜志, 2012, 21(4): 273-277.

[9]朱再滿, 華田苗, 周鴻銘， 等. 海洛因誘導CPP大鼠伏隔核腦電活動的無線遙測研究[J]. 中國應用生理學雜志, 2014, 30(4): 368-372.

[10]Bossert JM, Stern AL, Theberge FR,etal. Role of projections from ventral medial prefrontal cortex to nucleus accumbens shell in context-induced reinstatement of heroin seeking[J].JNeurosci, 2012, 32(14): 4982-4991.

[11]Blouin AM, Han S, Pearce AM,etal. Role of medial prefrontal cortex Narp in the extinction of morphine conditioned place preference[J].LearnMem, 2013, 20(2): 75-79.

[12]虞冉, 葉政, 李晶, 等. 嗎啡誘導條件性位置偏愛大鼠伏隔核殼區(qū)遙測電活動分析[J]. 中國應用生理學雜志, 2015, 31(1): 49-53.

[13]Kalivas PW, O’Brien C. Drug addiction as a pathology of staged neuroplasticity[J].Neuropsychopharmacol, 2008, 33(1): 166-180.

[14]Doherty JM, Cooke BM, Frantz KJ. A role for the Prefrontal Cortex in heroin-seeking after forced abstinence by adult male rats but not adolescents[J].Neuropsychopharmacol, 2013, 38(3): 446-454.

[15]Tan H, Rosen LG, Ng GA,etal. NMDA receptor blockade in the prelimbic cortex activates the mesolimbic system and dopamine-dependent opiate reward signaling[J].Psychopharmacol, 2014, 234(24): 4669-4679.

[16]Hayen A, Meese-Tamuri S, Gates A,etal. Opposing roles of prelimbic and infralimbic dopamine in conditioned cue and place preference[J].Psychopharmacol(Berl), 2014, 231(12): 2483-2492.

[17]潘群皖, 朱再滿, 李晶, 等. 海洛因誘導條件性位置偏愛大鼠頂葉聯絡皮質遙測腦電分析[J]. 四川大學學報(醫(yī)學版), 2014, 45(1): 84-88.

[18]Kargari A, Ramshini E, Alaei H,etal. Different current intensities electrical stimulation of prelimbic cortex of mPFC produces different effects on morphine-induced conditioned place preference in rats[J].BehavBrainRes, 2012, 31(1): 187-192.

[19]BAI Yu, BAI Jia-ming, LI Jing,etal. Wavelet packet extraction and entropy analysis of telemetry EEG from the prelimbic cortex of medial prefrontal cortex in morphine-induced CPP rats[J].ActaPhysiologicaSinica, 2014, 66(6): 675-682.

[20]Ovari J, Leri F. Inactivation of the ventromedial prefrontal cortex mimics reemergence of heroin seeking caused by heroin reconditioning [J].NeurosciLett, 2008, 444(1): 52-55.

EEG characteristics of medial prefrontal cortex in rats with morphine dependent place preference under shuttling condition

LI Jing, PAN Qun-wan△, ZHU Zai-man, LI Min, YE Zheng

(Department of Physiology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To study the correlation between EEG characteristics of medial prefrontal cortex (mPFC) and drug-seeking behavior of rats with morphine dependent place preference under shuttling condition. Methods: Forty rats were randomly divided into four groups (n=10): morphine PL group, NS PL group, morphine IL group and NS IL group. After embeding the electrode in prelimbic (PL) or infralimbic (IL) cortex of each group by brain stereotaxic operation, the model of morphine dependent conditioned place preference (CPP) in rats was established. The differences of EEG wave percentage in mPFC were telemetered and analyzed when rats shuttled before and after the model. Results: After the model, the withdrawal symptoms were evident in morphine PL and IL group, and the activity time and distance in white box were increased obviously. Compared with control group, after the model, the EEG in morphine PL group showed that: when the rats shuttled to white box, δ wave decreased obviously, β wave increased obviously. When the rats shuttled to black box, brain waves showed opposite changes. The EEG in morphine IL group showed that: when the rats shuttled to white box, δ wave increased obviously, β and α wave decreased obviously. When the rats shuttled to black box, the brain wave had no significant differences compared with control group. Conclusion: The EEG changes are different in PL and IL cortex of morphine CPP rats under shuttling condition, and the EEG changes are also different when rats shuttling to white or black box. There is possibly different mechanism, when different drug-seeking environmental cues caused EEG changes in different regions of mPFC.

morphine dependence;conditioned place preference (CPP);medial prefrontal cortex (mPFC);EEG;telemetry;rat

安徽省高校自然科學研究重點資助項目(KJ2015A193)；安徽省自然科學基金資助項目(090413096)；皖南醫(yī)學院中青年科研基金資助項目(WK201406)

2015-02-25

2015-10-08

△Tel：0553-3932473； E-mail：panqunw@163.com，muzisanri520@163.com

R338.8

A

1000-6834(2016)01-092-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.024