嚴(yán)偉彤,孫海峰,崔 毅,閆佳駒,閆 萍
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.黑龍江省畜牧研究所,黑龍江 齊齊哈爾 161005)
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金絲草總黃酮的水提醇沉工藝優(yōu)化
嚴(yán)偉彤1,孫海峰1,崔毅2,閆佳駒1,閆萍1
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.黑龍江省畜牧研究所,黑龍江 齊齊哈爾 161005)
采用正交試驗(yàn)法考察水提醇沉法中提取水倍數(shù)、提取次數(shù)、藥液濃縮比例和醇沉濃度4 個(gè)因素對(duì)金絲草總黃酮提取率的影響。以蘆丁為對(duì)照,通過(guò)可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。結(jié)果表明:4種因素對(duì)總黃酮提取率雖然無(wú)顯著影響,但最佳提取工藝為10 倍水量提取3次,醇沉濃度為50%,藥液濃縮比例為1∶ 1,總黃酮提取率為4.894%。該提取工藝安全穩(wěn)定,簡(jiǎn)便可行,為工業(yè)生產(chǎn)提供參考,也為金絲草黃酮類化合物的深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
金絲草; 總黃酮; 水提醇沉法; 提取工藝
金絲草(Pogonatherum crinitum)異名落蘇、貓尾草、黃毛草等,為禾本科金絲草屬植物金絲草的全草。根據(jù)中藥大辭典記載金絲草性寒,具有清熱涼血、利濕解毒,利尿之功效,民間常用來(lái)治療糖尿病,黃疸型肝炎,尿路感染等??梢?jiàn)金絲草具有廣泛的藥用價(jià)值。金絲草資源十分豐富,廣泛分布于浙江,福建,臺(tái)灣,云南等地。近年來(lái)對(duì)金絲草的研究發(fā)現(xiàn),其中主要的活性成分為黃酮類化合物。而黃酮類化合物具有多種生物活性如具有心血管系統(tǒng)活性,抗菌及抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基活性等[1]。但是目前對(duì)金絲草總黃酮的研究甚少,水提醇沉法是工業(yè)上提取黃酮類化合物的重要方法,目前未見(jiàn)利用該方法對(duì)金絲草中總黃酮類提取工藝的研究報(bào)道。
本研究以金絲草干燥全草為原料,利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)水提醇沉法提取金絲草中總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化,為金絲草資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。
1.1材料與藥品
金絲草干燥全草,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫海峰教授鑒定,粉碎成粗粉備用; 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制劑品檢定所。亞硝酸鈉,氫氧化鈉,硝酸鋁,95%乙醇,以上試劑均為分析純。
1.2儀器
恒溫水浴箱:江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。
721A型分光光度計(jì):四川儀表九廠。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞容生化儀器廠。
電子分析天平:梅特勒-托利多上海有限公司。
其他:圓底燒瓶、冷凝管、燒杯、玻璃棒、量筒、布氏漏斗。
1.3方法
1.3.1正交設(shè)計(jì)
在金絲草水提醇沉過(guò)程中,影響水提醇沉工藝的因素主要是加水倍數(shù)(A)、提取次數(shù)(B)、藥液醇沉濃度(C),濃縮比例(D)。
為優(yōu)化各因素最佳工藝水平,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)[2]。采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)方案,因素水平見(jiàn)表1,平行重復(fù)3次(n=3)
表1 水提醇沉正交試驗(yàn)的因素及水平
1.3.2試驗(yàn)方法
總黃酮的提?。悍Q取藥材10 g,按表1方案進(jìn)行加水,浸泡12h后,再進(jìn)行加熱回流提取,每次回流提取2 h,趁熱抽濾合并濾液; 按表1方案加乙醇進(jìn)行醇沉,靜置24 h,濾取醇上清液,減壓并濃縮回收乙醇,定容至100 mL,搖勻,得1~9 號(hào)樣品,待測(cè)。
1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[3]。
對(duì)照品制備:精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5mg置50mL容量瓶中,加70%乙醇適量,置水浴上微熱使溶解,放冷,并加70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL中含蘆丁0.1mg)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5mL,分別置10mL容量瓶中,加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加氫氧化鈉試液4mL,用70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,放置15min后于510nm處測(cè)吸光度。
以濃度C為縱坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行先行回歸,得方程Y=1.197X+0.0075,R2=0.9974,表明被測(cè)溶液濃度在0.1~0.5mg/mL線性關(guān)系良好。
1.3.4樣品溶液制備和黃酮含量的測(cè)定
將以上樣品溶液用乙醇稀釋(用當(dāng)前醇沉濃度)成濃度為0.1mg/mL,然后重復(fù)操作標(biāo)準(zhǔn)蘆丁樣品吸光度的測(cè)定步驟,得樣品的吸光值。將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算,得樣品總黃酮的提取率。
1.3.5驗(yàn)證性試驗(yàn)
考慮試驗(yàn)誤差因素,按正交試驗(yàn)確定的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
如上法得到總黃酮水提醇沉正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)。為進(jìn)一步確定各因素對(duì)結(jié)果的影響,用Excel2013和正交助手軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表3) 。
由數(shù)據(jù)可知,各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小依次為C> A> B> D,D 因素在考察范圍內(nèi)影響最小。雖然各因素對(duì)提取率的影響水平不顯著,但從操作簡(jiǎn)便,經(jīng)濟(jì)及生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),擬定最佳工藝條件為醇沉濃度為50%,提取3 次,加水量為10 倍量,藥液濃縮比例為1∶1 。最佳工藝條件的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示,總黃酮提取率為4.894%,均高于正交試驗(yàn)的其他各組數(shù)據(jù),結(jié)果數(shù)據(jù)顯示優(yōu)選的工藝條件比較穩(wěn)定,實(shí)際操作也簡(jiǎn)便可行。
表2 水提醇沉正交試驗(yàn)
表3 方差分析
注:F 臨界值=19
表4 重復(fù)試驗(yàn)
試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)的方法來(lái)對(duì)金絲草總黃酮水提醇沉的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。
結(jié)果顯示,最佳工藝條件為10 倍水量加熱回流提取3 次,乙醇醇沉濃度為50%,藥液濃縮比例為1∶1。經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)該工藝提取總黃酮提取率達(dá)到4.894%。
在本實(shí)驗(yàn)中,乙醇醇沉這個(gè)因素對(duì)提取效率影響最大,所以在工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)乙醇濃度應(yīng)嚴(yán)格控制。本工藝作為金絲草總黃酮提取的新工藝,可能會(huì)在工業(yè)生產(chǎn)上有良好的應(yīng)用前景。
[1] 曹緯國(guó),劉志勤.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2003,23(12):2241-2247.
[2] 宋棋芬,高廣春.南湖菱殼總黃酮的水提醇沉工藝[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(8):1029-1031.
[3] 孫海峰,楊婷.翻白草降血糖活性部位提取工藝的優(yōu)化研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2009,3(3):49-51.
2016-02-04
嚴(yán)偉彤(1990-),女,黑龍江克山人,在讀碩士,研究方向:金絲草化學(xué)成分的研究。
孫海峰(1964-),男,教授,中藥學(xué)博士,研究方向:中藥資源與開(kāi)發(fā)研究。
S853.7
A文章編號(hào):2095-9737(2016)04-0010-02