董靖德　靳凌　張麗

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CYP2C19基因多態(tài)性對頸動脈支架植入術(shù)后支架內(nèi)血栓形成的影響

董靖德靳凌張麗

目的闡明CYP2C19基因多態(tài)性與頸動脈支架植入術(shù)(CAS)后支架內(nèi)血栓形成、氯吡格雷抵抗之間的關(guān)系。方法入選2013年1月至2014年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院老年神經(jīng)科及神經(jīng)科接受頸內(nèi)動脈動脈支架(裸支架)植入術(shù)的首次住院頸內(nèi)動脈狹窄患者102例,服用阿司匹林100 mg/d,頸內(nèi)動脈支架植入術(shù)前3 d開始予氯吡格雷 75 mg/d口服。多重高溫連接酶檢測反應(yīng)進行CYP2C19*2和*3位點分型,并記錄氯吡格雷抵抗和支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率。結(jié)果入選的102例患者中,按CYP2C19*2分型:CYP2C19*1*1型45例,CYP2C19*1*2型47例,CYP2C19*2*2型10例。攜帶CYP2C19*2基因者氯吡格雷抵抗的發(fā)生率為26.3%(15例),未攜帶CYP2C19*2基因者氯吡格雷抵抗的發(fā)生率為13.3%(6例),組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。攜帶CYP2C19*2基因者頸內(nèi)動脈支架植入術(shù)后支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率為19.3%(11例),未攜帶CYP2C19*2基因者支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率為11.1%(5例),組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CYP2C19*2基因位點的多態(tài)性可能是頸內(nèi)動脈支架植入術(shù)后不良事件發(fā)生的危險因素。

頸動脈支架植入術(shù); CYP2C19基因多態(tài)性; 氯吡格雷抵抗; 支架內(nèi)血栓形成

為了預(yù)防頸動脈支架植入術(shù)(CAS)后支架內(nèi)血栓形成及其他不良事件的發(fā)生,阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷的雙聯(lián)抗血小板治療已經(jīng)成為CAS術(shù)后常規(guī)治療方案[1]。然而并不是所有CAS術(shù)后的患者都能從雙聯(lián)抗血小板治療中獲益,部分患者在CAS術(shù)后6～12月支架內(nèi)會再次出現(xiàn)血栓形成。研究表明氯吡格雷通過細胞色素酶P450(CYP450)在其抗血小板聚集中起到了重要作用[2]。目前尚無研究報道CYP2C19基因多態(tài)性與CAS后支架內(nèi)血栓形成是否相關(guān)。本研究旨在闡明CYP2C19基因多態(tài)性與CAS后支架內(nèi)血栓形成、氯吡格雷抵抗(CR)發(fā)生率之間的關(guān)系,為CAS術(shù)后抗血小板個體化治療提供一定的依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對象均為來自2013年1月至2014年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院老年神經(jīng)科接受頸內(nèi)動脈支架(裸支架)植入術(shù)的首次住院頸內(nèi)動脈狹窄患者，共102例,頸內(nèi)動脈狹窄率≥70%。排除標準:有抗血小板藥物過敏史;嚴重的肝腎疾病或心功能Ⅲ級以上;腫瘤;凝血功能異常;有出血傾向或3月內(nèi)有出血史;既往有顱內(nèi)出血病史;血小板計數(shù)<80×109/L;其他不適宜使用氯吡格雷的情況。所有患者需簽署知情同意書。

1.2研究方法所有患者均予阿司匹林100 mg/d,頸內(nèi)動脈支架植入術(shù)前3 d開始予氯吡格雷 75 mg/d口服。

1.3基因型的檢測和患者的分組患者入院后經(jīng)知情同意抽取外周靜脈血5 ml于抗凝管中,-80 ℃超低溫凍存。提取全血DNA,并將濃度標化至10 ng/ml,通過多重高溫連接酶檢測反應(yīng)進行基因分型,CYP2C19*2的引物為F: AACCAGAGCTTGGCATAT,R: AGCAATCAATAAAGTCCC;CYP2C19*3的引物F: ACTTTCATCCTGGGCTGTG;R: AGGGCTTTGGAGTTTAGTG。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,擴增36個循環(huán);最后72 ℃ 7 min,4 ℃,最后對PCR產(chǎn)物進行基因測序。設(shè)立空白對照樣本和5%的重復(fù)樣本,以評價檢測結(jié)果的可靠性,對于基因型不明確的重新進行測定。根據(jù)CYP2C19基因分型結(jié)果對患者進行分組CYP2C19*2(*1*1;*1*2;*2*2)和CYP2C19*3(*1*1;*1*3)。

1.4血小板聚集功能檢測服用氯吡格雷≥5 d后取靜脈血4.5 ml,加至含0.5 ml枸櫞酸鈉溶液(1∶9)的采樣管中混勻,3 h內(nèi)檢測血小板聚集功能。用LTA(540VS,Chronolog公司,美國)檢測血小板聚集功能。將待測血樣經(jīng)200 r/min離心8 min,獲取富血小板血漿(PRP),檢測血小板計數(shù);將剩余血樣經(jīng)2465 r/min 離心10 min,獲取去血小板血漿(PPP),用 PPP 將 PRP 的血小板計數(shù)稀釋至250×109個/L。以 PPP 為空白對照,將校正的 PRP樣本置于光學(xué)血小板聚集儀的檢測槽,加入2.5 μl二磷酸腺苷(ADP),使ADP 終濃度分別至5 μmol/L,測定8 min 最大血小板聚集率(PL)。將5 μmol/L ADP誘導(dǎo)的殘余血小板聚集率(PLADP)>40%定義為CR[3]。

1.5隨訪和終點事件通過門診、電話、住院等在術(shù)后6、12月進行隨訪,此后每年隨訪1次。隨訪截止時間為2015年6月。臨床終點事件為頸動脈彩超檢查發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)血栓形成。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料以頻數(shù)和率表示,組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法。卡方檢驗比較單個基因型及基因頻率,以判斷基因型的哈迪-溫伯格遺傳平衡符合程度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1患者一般資料比較患者年齡50～80歲,平均(65.1±12.1)歲。根據(jù)不同基因型分組后,各組患者的臨床資料見表1。無論CYP2C19*2基因型分組還是CYP2C19*3基因型分組,各組患者在年齡、性別、卒中、冠心病、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　不同基因型分組患者的臨床資料

2.2基因分型按CYP2C19*2分型:CYP2C19*1*1型45例,CYP2C19*1*2型47例,CYP2C19*2*2型10例;按CYP2C19*3分型: CYP2C19*l*1型94例,CYP2C19 *1*3型8例。CYP2C19*2和CYP2C19*3的最小等位基因頻率分別為31.9%和3.8%?；蚍植碱l率均符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

2.3CR發(fā)生率CR的總發(fā)生率為20.6%(21例)。按患者是否攜帶CYP2C19*2基因分組后,攜帶CYP2C19*2基因者的CR的發(fā)生率為26.3%(15例),非攜帶CYP2C19*2基因者的CR的發(fā)生率為13.3%(6例),組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。按患者是否攜帶CYP2C19*3基因分組后,2組在CR的發(fā)生率上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4支架內(nèi)血栓形成隨訪結(jié)果患者隨訪期為(15.6±7.2)月,其中16例患者發(fā)生了支架內(nèi)血栓形成,發(fā)生率為15.7%。按患者是否攜帶CYP2C19*2基因分組后,攜帶CYP2C19*2基因者CAS后支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率為19.3%(11例),非攜帶CYP2C19*2基因者支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率為11.1%(5例),組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。按患者是否攜帶CYP2C19*3基因分組后,2組在CAS后支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3　討論

氯吡格雷主要通過CYP450酶系代謝轉(zhuǎn)化為有活性的物質(zhì),從而產(chǎn)生抗血小板聚集作用。CYP450酶系中的CYP2C19在氯吡格雷代謝轉(zhuǎn)化中起著重要作用。本研究表明攜帶CYP2C19*2基因者CR的發(fā)生率明顯高于非攜帶組。氯吡格雷的抗血小板作用受到多方面因素的影響,如個體差異、藥物相互作用、依從性和劑量等。對于CR是否受CYP2C19基因的影響,國內(nèi)劉倩等[4]研究發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因檢測為慢代謝基因型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)的患者發(fā)生CR的概率明顯高于快代謝型(*1/*1)及中間代謝型(*1/*2、*l/*3),攜帶CYP2C19慢代謝基因是發(fā)生CR的危險因素。王雷等[5]研究表明CYP2C19基因多態(tài)性可影響急性腦梗死患者氯吡格雷治療的療效。我們的研究結(jié)果與該研究結(jié)果類似。但Namazi等[6]的研究認為,CYP2C19、P2Y12等基因多態(tài)性與CR無關(guān),說明CYP2C19與CR之間的關(guān)系需要進一步研究。

本研究結(jié)果表明:攜帶CYP2C19*2基因者CAS后支架內(nèi)血栓形成的發(fā)生率明顯高于非攜帶組。Li等[7]發(fā)現(xiàn)在中國人中，CYP2C19基因多態(tài)性與亞臨床血栓的發(fā)生有關(guān),并且認為CYP2C19基因多態(tài)性是支架內(nèi)血栓惟一的獨立預(yù)測因子,而與血栓形成關(guān)系密切的為CYP2C19*2基因。Sawada等[8]對日本100例支架植入術(shù)后的患者進行隨訪研究,接受氯吡格雷治療患者出現(xiàn)血栓與CYP2C19*2基因多態(tài)性有關(guān)。Mega等[9]對9685例有過急性冠脈綜合征或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療患者的Meta分析表明,CYP2C19功能缺失基因攜帶者的卒中風(fēng)險明顯升高,并且支架內(nèi)血栓形成的不良事件增多。Yamamoto等[10]認為CYP2C19基因多態(tài)性可能與殘留血小板的高反應(yīng)性及心血管事件的高發(fā)生率有一定的關(guān)系。2013年臨床藥理協(xié)會(CPIC)指南建議盡早對急性冠脈綜合征或經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后患者行CYP2C19基因型檢測,尤其是攜帶CYP2C19*2功能缺失基因的患者群體,應(yīng)盡早干預(yù),防止不良事件發(fā)生[11]。

綜上所述,攜帶CYP2C19*2基因組術(shù)后的CR以及血栓形成的發(fā)生率高,常規(guī)給予CAS的患者檢測CYP2C19*2基因有助于患者更好地預(yù)防CR及術(shù)后支架內(nèi)血栓的再形成,從而減少頸內(nèi)動脈支架術(shù)后的不良事件。但本研究入組的患者人數(shù)有限,故結(jié)果有一定的局限性,需要在今后的工作中累積更多的病例。

[1]中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組缺血性腦血管病血管內(nèi)介入診療指南撰寫組.中國缺血性腦血管病血管內(nèi)介入診療指南[J].中華神經(jīng)科雜志,2011,44(12):863-869.

[2]談世進,楊建芬,李勝前. 氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林對老年不穩(wěn)定型心絞痛患者血小板活化的臨床干預(yù)研究[J]. 實用老年醫(yī)學(xué),2007,21(4):243-245.

[3]孔德玉,陳俊,李春堅,等. 冠心病患者阿司匹林與氯吡格雷抵抗發(fā)生情況的調(diào)查研究[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,33(6):788-791.

[4]劉倩,孫玉坤,黨大勝,等. 不同年齡段CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2011,28(4):320-324.

[5]王雷,袁良津,唐向陽. CYP2C19基因多態(tài)性與急性腦梗死患者氯吡格雷療效的相關(guān)性研究[J]. 臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2015,28(2):99-102.

[6]Namazi S, Kojuri J, Khalili A, et al. The impact of genetic polymorphisms of P2Y12, CYP3A5 and CYP2C19 on clopidogrel response variability in Iranian patients[J]. Biochem Pharmacol,2012,83(7):903-908.

[7]Li S, Shi Y, Wang H, et al. Impact of cytochrome P450 2C19*2 polymorphism on intra-stent thrombus assessed by follow-up optical coherence tomography in Chinese patients receiving clopidogrel[J]. J Thromb Thrombolysis,2015,40(1):88-96.

[8]Sawada T, Shinke T, Shite J, et al. Impact of cytochrome P450 2C19*2 polymorphism on intra-stent thrombus after drug-eluting stent implantation in Japanese patients receiving clopidogrel[J]. Circ J, 2011,75(1):99-105.

[9]Mega JL, Simon T, Collet JP, et al. Reduced-function CYP2C19 genotype and risk of adverse clinical outcomes among patients treated with clopidogrel predominantly for PCI: a meta-analysis[J]. JAMA,2010,304(16):1821-1830.

[10]Yamamoto K, Hokimoto S, Chitose T, et al. Impact of CYP2C19 polymorphism on residual platelet reactivity in patients with coronary heart disease during antiplatelet therapy[J]. J Cardiol,2011,57(2):194-201.

[11]Scott SA, Sangkuhl K, Stein CM, et al. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for CYP2C19 genotype and clopidogrel therapy: 2013 update[J]. Clin Pharmacol Ther,2013,94(3):317-323.

Effect of CYP2C19 gene polymorphisms on stent thrombosis after carotid artery stent placement

DONGJing-de,JINLing,ZHANGLi.

DepartmentofGeriatricNeurology,theBrainHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo clarify the relationship of CYP2C19 gene polymorphisms with stent thrombosis and the clopidogrel resistance after carotid artery stent(CAS) placement.MethodsOne hundred and two patients who firstly underwent carotid artery stent placement from January 2013 to December 2014 were enrolled in the department of neurology and geriatric neurology of Nanjing Brain Hospital. They were treated with aspirin 100 mg/d and clopidogrel 75 mg/d three days before CAS placement.CYP2C19 genotype was detected by improved multiple ligase detection reaction. The incidence rate of clopidogrel resistance and stent thrombosis was observed respectively.ResultsOf the 102 patients, 45 were wild-type homozygous, 47 were heterozygotes, and 10 were homozygous. The incidence rate of clopidogrel resistance was 26.3% (15 cases) in patients with CYP2C19 * 2 gene, and 13.3% (6 cases) in patients without CYP2C19 * 2 gene, and the difference between two groups was statistically significant (P<0.05). The incidence rate of stent thrombosis was 19.3% (11 cases) in patients with CYP2C19 * 2 gene, and 11.1% (5 cases) in patients without CYP2C19 * 2 gene, and the difference between two groups was also statistically significant (P<0.05).ConclusionsCYP2C19 * 2 loci polymorphism may be a risk factor for adverse events after CAS placement.

carotid artery stent placement; CYP2C19 genetic polymorphism; clopidogrel resistance; stent thrombosis

江蘇省衛(wèi)生廳課題(H201241)

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院老年神經(jīng)科

張麗，Email: 1374714800@qq.com

R 743.9

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2016.08.019

2015-09-15)