徐天宇，胡蘇瑩，周峻崗,呂　紅

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438)

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微桿菌Microbacteriumsp.FY1538降解赤霉烯酮的活性研究

徐天宇1,2，胡蘇瑩1,2，周峻崗1,2,呂紅1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438)

赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)主要是由鐮刀菌屬(Fusariumsp.)的某些種，如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等通過聚酮類合成代謝途徑生成并分泌的一種真菌毒素，具有類雌激素的性質(zhì). ZEN能引起家禽家畜和人的雌激素過多癥，造成生殖紊亂、肝腎損傷，嚴(yán)重時可以致癌. 本研究用環(huán)戊酮作為唯一碳源, 從土壤中篩選獲得一株可以有效降解ZEN的微桿菌(命名為Microbacteriumsp.FY1538). 該微桿菌在添加甲醇的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵所得的上清液具有降解ZEN的活性. 進一步的分析證明了FY1538培養(yǎng)液上清中含有能夠降解ZEN的酶. 經(jīng)高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)了ZEN生物降解的初步產(chǎn)物.

赤霉烯酮； 微桿菌； 生物降解

赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)，又稱為F-2毒素，主要是由鐮刀菌屬(Fusariumsp.)的某些種，如Fusariumgraminearum、F.culmorum、F.cerealis等通過聚酮類合成途徑生成并分泌的一種真菌毒素[1]. ZEN具有弱雌激素活性，可以與動物的雌激素受體(17β-雌二醇受體)結(jié)合并觸發(fā)細胞對雌激素的下游反應(yīng). ZEN并非甾體結(jié)構(gòu)，而是一種雷鎖酸內(nèi)酯，全稱為6-(10-羥基-6-酮基-反-1-十一碳烯基)β-雷鎖酸內(nèi)酯，相對分子質(zhì)量 318，對熱比較穩(wěn)定. ZEN不溶于水，但可以溶于堿性水溶液、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和乙腈等[1].

ZEN是一種雷鎖酸內(nèi)酯.1962年Stob等首先從發(fā)霉的玉米中分離得到了該毒素，命名為玉米赤霉烯酮[2].1966年Urry首次闡明了該毒素的結(jié)構(gòu)(圖1(a)，見第224頁)[3]. ZEN及其衍生物具有類雌激素活性，會使人和動物產(chǎn)生雌激素過量綜合癥，主要表現(xiàn)為影響雌性動物性征發(fā)育、抑制排卵會引發(fā)假孕、胎兒異?；巍⑿韵倌[脹發(fā)炎[4-5]. ZEN也會降低雄性動物的精液質(zhì)量，造成不育[4]. 除此之外，ZEN還會造成急性中毒[6]、肝損傷[7]、免疫損傷[8]及致癌[9].

ZEN的降解方法有物理法、化學(xué)法和生物酶解法3種. 物理法降解ZEN主要是熱處理和吸附. 在120～140℃加壓處理2h后可以除去食物中73%～83%的ZEN[10]. 吸附ZEN則利用活性炭、硅藻土、納米碳[11]等多孔材料. 然而，熱處理ZEN降解不完全，吸附則沒有根除ZEN本身，吸附劑的不恰當(dāng)處理還會造成再次污染. 化學(xué)法處理ZEN主要是利用強氧化劑來破壞ZEN的結(jié)構(gòu). Alla報道，臭氧在乙腈水溶液中能夠在15s內(nèi)將20μg/mL的ZEN完全清除[12]. 化學(xué)法高效快速，但不適合處理食物和飼料，乙腈、臭氧或雙氧水的毒性都甚于ZEN.

生物酶解法降解ZEN目前研究還不是很深入. 已報道可以降解ZEN的菌株很多，但明確降解機理的研究寥寥. 目前唯一降解機理完全研究清楚的是粉紅黏帚霉(Gliocladiumroseum)，其編碼一種α/β水解酶zhd101，能夠打開ZEN的大環(huán)酯鍵(圖1(b)[13])，產(chǎn)物沒有雌激素活性[5,13-14].

除此以外，雷元培等發(fā)現(xiàn)了一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ANSB01G可以使ZEN連接一個谷氨酸后酯鍵開環(huán)、脫水，產(chǎn)物無雌激素活性[15]，但沒有確定作用酶. 余元善等發(fā)現(xiàn)了一株不動桿菌(Acinetobactersp.)SM04表達的一種過氧化物酶和一種氧化酶對ZEN有活性，產(chǎn)物無雌激素活性，但產(chǎn)物結(jié)構(gòu)未知[16].Vekiru等發(fā)現(xiàn)了一株解毒毛孢子菌(Trichosporonmycotoxinivorans)可以在ZEN大環(huán)酮基處進行Baeyer-Villiger反應(yīng)，再水解打開大環(huán)，產(chǎn)物無雌激素活性，但酶未分離出[17]. 其他報道能降解ZEN的菌株還有粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)[18]、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[19]、黏質(zhì)塞氏桿菌(Setratiamarcescens)[20]等，多數(shù)并沒有明確降解機理，即降解酶或降解產(chǎn)物.

ZEN不溶于水，需要有少量甲醇、乙醇等有機溶劑助溶.本研究利用唯一碳源富集方法,從環(huán)境微生物中篩選獲得了一株降解ZEN的微桿菌，命名為Microbacteriumsp.FY1538. 初步解析了該微桿菌FY1538對ZEN生物降解的機理,分離了一部分的初始降解產(chǎn)物.

1　材料與方法

1.1材料

微桿菌FY1538(Microbacteriumsp.FY1538)篩選所用的培養(yǎng)基配方如下：

無機鹽培養(yǎng)基：0.67g NH4Cl，1.5g K2HPO4，0.5g KH2PO4，1.06g NaNO3，0.2g MgSO4·7H2O，0.023g CaCl2，加去離子水800mL溶解，pH調(diào)至7.2后定容至1L. 115℃滅菌20min. 使用前在無菌條件下加入10mL微量元素液.

微量元素液：200mg FeSO4·7H2O，50mg ZnSO4·7H2O，40mg MnCl2·4H2O，40mg CoCl2·6H2O，40mg CuSO4·5H2O，10mg H3BO2，50mg NaMoO4·2H2O，加80mL去離子水溶解，定容至100mL，用0.22μm 微孔濾膜過濾除菌.

唯一碳源培養(yǎng)基：在無機鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，使用時加入終濃度5g/L的唯一碳源物質(zhì)(如環(huán)戊酮)，搖勻使用.

表1　實驗所用的引物序列

LB培養(yǎng)基：10g/L 胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L 酵母提取物(Yeast extract)，10g/L NaCl(如做成固體培養(yǎng)基則再加入1.5%瓊脂糖). 調(diào)節(jié)pH為7.4后115℃滅菌20min.

實驗中用到的PCR引物見表1. DNA序列測定由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成. Taq酶購自TaKaRa公司. 薄層層析(TLC)硅膠板購自Merck公司. HPLC儀和C18色譜柱為Aglient公司產(chǎn)品. ZEN購自Sigma公司. 本實驗中在未特別說明情況下，ZEN一律由甲醇配置，濃度為 5mg/mL.

1.2方法

1.2.1ZEN降解菌的篩選和鑒定

本研究所用土壤樣品采自青海湖邊、北京、上海郊區(qū)、河北、山東農(nóng)村等地(表2).

表2　實驗所用土壤樣品列表

注：括號內(nèi)為經(jīng)緯度.

用適量0.15mol/L NaCl溶液振蕩洗滌土壤樣品，待其自然沉降2min后吸取1mL上清，加入到50mL 唯一碳源培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7d后，取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的50mL唯一碳源培養(yǎng)基中，繼續(xù)30℃培養(yǎng)7d. 反復(fù)轉(zhuǎn)接4～5次后，取菌液適當(dāng)稀釋涂布LB、YEPD、PDA平板，挑取單一菌落接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，加入終濃度25μg/mL ZEN，30℃培養(yǎng)2d. 培養(yǎng)液離心分離上清和菌體. 菌體用PBS重懸后用超聲波充分破碎，離心分離破碎上清液和殘渣. 用乙酸乙酯抽提培養(yǎng)液上清、破碎上清和破碎殘渣中的ZEN，用TLC檢測(檢測波長為254nm)，展開劑為石油醚∶丙酮∶乙酸乙酯(體積比5∶4∶1). 我們選出ZEN被有效清除的菌株，用16S rRNA引物(細菌)或18S rRNA引物(真菌)作菌落PCR擴增，鑒定種屬.

1.2.2ZEN降解酶分布情況的檢測

將ZEN降解菌株在含有終濃度25μg/mL ZEN的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后，培養(yǎng)液離心分離上清液和菌體. 菌體用PBS重懸后超聲波充分破碎，離心分離破碎上清和殘渣. 向培養(yǎng)液上清、破碎上清和破碎殘渣中分別加入終濃度50μg/mL ZEN，30℃ 水浴反應(yīng) 16h，用乙酸乙酯抽提ZEN后用TLC檢測.

將培養(yǎng)液上清用蛋白酶K 30℃處理過夜后，再加入終濃度50μg/mL的ZEN，30℃水浴16h，用乙酸乙酯抽提ZEN后用TLC檢測.

1.2.3ZEN降解酶表達條件的初步探索

將ZEN降解菌株分別接種到在含有終濃度5μL/mL甲醇、5μL/mL乙醇、25μg/mL ZEN(甲醇溶解)、25μg/mL ZEN(乙醇溶解)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后，培養(yǎng)液離心取上清液，加入終濃度50μg/mL 的ZEN，30℃水浴16h，用乙酸乙酯抽提ZEN后用TLC檢測.

1.2.4培養(yǎng)液上清ZEN降解酶酶活性質(zhì)

將ZEN降解菌株在含有終濃度5μL/mL甲醇的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后，培養(yǎng)液離心取上清作為ZEN降解酶液. 調(diào)節(jié)酶液不同的反應(yīng)溫度和不同的pH值，加入終濃度50μg/mL ZEN，水浴6h，用HPLC分別檢測反應(yīng)前后酶液中ZEN含量，以找到最適pH值及最適反應(yīng)溫度.

將酶液調(diào)至最適pH值，分別在40，50，60，70℃先水浴1h，然后加入終濃度50μg/mL ZEN，在最適反應(yīng)溫度下水浴反應(yīng)6h，用HPLC分別檢測反應(yīng)前后酶液中ZEN含量，以確定活性酶本身的熱穩(wěn)定性.

2　結(jié)果與分析

2.1微桿菌Microbacteriumsp.FY1538的鑒定

我們在環(huán)戊酮唯一碳源的培養(yǎng)基中于LB平板上分離得到了一株能夠有效清除ZEN的菌，通過16S rRNA鑒定該菌是屬于微桿菌屬(Microbacteriumsp.)，我們將其命名為 FY1538. 用Mega5.0對Microbacteriumsp.FY1538與其他微桿菌構(gòu)建16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbour-Joining，boot strap=500)，發(fā)現(xiàn)與FY1538最為相近的微桿菌屬模式菌株是Microbacteriumaerolatum(圖2). FY1538在LB平板上生長的菌落為圓形，培養(yǎng)36h后直徑大約1.5mm，不透明，有光澤，黃色(圖3).

2.2ZEN降解產(chǎn)物的TCL檢測

用含有ZEN的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌一段時間后，離心培養(yǎng)液分離上清和菌體，菌體超聲波破碎，離心. 向培養(yǎng)液上清、菌體破碎上清和PBS重懸的破碎殘渣中分別加入終濃度50μg/mL ZEN，30℃水浴反應(yīng)16h，TLC檢測(圖4(a)). 發(fā)現(xiàn)只有培養(yǎng)液上清中赤霉烯酮消失，說明ZEN于胞外降解. 用蛋白酶K處理培養(yǎng)液上清24h后，再加入終濃度50μg/mL ZEN，30℃水浴16h，TLC檢測(圖4(b)). 發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的培養(yǎng)液上清失去降解ZEN的能力，說明上清液的活性應(yīng)該源于酶.

由于本實驗中的ZEN均為甲醇溶解，因此我們用等量的純甲醇作為實驗對照，發(fā)現(xiàn)Microbacteriumsp.FY1538在加入純甲醇的LB培養(yǎng)液上清中同樣具有ZEN降解活性. 即在LB培養(yǎng)基中添加終濃度10μL/mL的純甲醇，但不添加ZEN，接種Microbacteriumsp.FY1538培養(yǎng)2d后取上清，在上清中加入終濃度50μg/mL ZEN，30℃水浴16h，用TLC檢測(圖4(c)). 發(fā)現(xiàn)純甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)液上清與之前ZEN甲醇溶液誘導(dǎo)的上清具有相同的降解ZEN的活性.

將ZEN的溶劑更換為乙醇，重復(fù)上述實驗，并用甲醇誘導(dǎo)上清去反應(yīng)乙醇溶ZEN，用TLC檢測(圖4(d)). ZEN溶劑更換為乙醇后，Microbacteriumsp.FY1538并沒有降解ZEN(lane1)；純乙醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)液上清也不具有降解ZEN的活性(lane5)，而純甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)液上清依舊可以降解更換溶劑的ZEN(lane6).這說明ZEN本身并非誘導(dǎo)劑，ZEN的降解活性源于甲醇誘導(dǎo)，乙醇不能誘導(dǎo).我們未試驗是否還有其他物質(zhì)可以誘導(dǎo).

2.3溫度、pH對Microbacteriumsp.FY1538降解ZEN活力的影響

將甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)液上清作為ZEN降解酶液，分析其最適反應(yīng)溫度. 加入終濃度50μg/mL ZEN，在不同溫度水浴反應(yīng)6h，用HPLC分別檢測反應(yīng)前后酶液中ZEN含量，得到的ZEN降解率. 發(fā)現(xiàn)該上清酶液最適反應(yīng)溫度為50℃左右，這時ZEN降解率達到95.6%. 低溫對降解活性影響較小，25℃時ZEN降解率下降約20%；高溫對降解活性影響很大，70℃時ZEN降解率下降約60%(圖5(a)). 為了分析活性酶本身對不同溫度的穩(wěn)定性，我們將酶液分別在40，50，60，70℃水浴熱處理1h，然后加入終濃度50μg/mL的ZEN，在最適溫度50℃下水浴反應(yīng)6h，用HPLC分別檢測反應(yīng)前后酶液中ZEN含量(圖5(b)). 發(fā)現(xiàn)該上清液在40℃、50℃熱預(yù)處理后，相對于未經(jīng)過熱處理的樣品，酶活基本無變化；在60℃、70℃熱處理后，酶活有比較明顯下降，ZEN降解率降至78.2% (60℃)和59.0% (70℃). 說明該酶的耐熱溫度與最適反應(yīng)溫度相近.

調(diào)節(jié)酶液不同的pH，加入終濃度 50μg/mL ZEN，50℃水浴反應(yīng)6h，用HPLC分別檢測反應(yīng)前后酶液中ZEN含量(圖6). 發(fā)現(xiàn)實驗最適反應(yīng)pH=9，這時ZEN降解率達到97.1%. 上清酶液的原pH為8.4，與之非常相近. 低pH對降解活性影響很大，pH=4時酶幾乎沒有活性；高pH對降解活性影響也比較明顯，pH=12時ZEN降解率下降約50%.

2.4ZEN降解產(chǎn)物的HPLC分析

將ZEN(甲醇溶)共培養(yǎng)得到的上清酶液加入終濃度50μg/mL ZEN(實驗組)，同時設(shè)置這樣的一組上清酶液加入等量純甲醇做對照(給出溶劑背景，以保證HPLC結(jié)果的精確性)，在pH=9，50℃水浴進行反應(yīng). 反應(yīng)0，1，2，3，4，5，6，10，15，20 h時用HPLC檢測反應(yīng)體系(圖7，見第228頁).

從圖7可知隨著反應(yīng)時間延長，實驗組中ZEN的含量明顯下降，在21.6，23.3，23.8，24.8，25.3，25.7，26.1min出現(xiàn)新的峰Z1～Z7. 對照組在這一段區(qū)間20h內(nèi)一直沒有新峰出現(xiàn). 推測這些新峰可能是ZEN的產(chǎn)物，微桿菌FY1538降解ZEN可能是多酶的連續(xù)反應(yīng).

圖7(b)中Z1～Z7、ZEN的 HPLC峰面積隨反應(yīng)時間變化見表3. 從表3可知，隨著反應(yīng)時間的推移，反應(yīng)體系中ZEN含量在不斷下降；Z1～Z7的含量都呈現(xiàn)了一個先上升后下降的趨勢，其中Z2含量在反應(yīng)2h達到最高，Z3、Z4在3h達到最高，Z1、Z5、Z6、Z7在4h達到最高.反應(yīng)經(jīng)過25h后，Z1、Z3、Z4、Z7還有微量殘存，Z2、Z5、Z6含量則低于檢測限.

表3　ZEN及產(chǎn)物Z1～Z7的隨反應(yīng)時間峰面積變化

注：括號內(nèi)是峰的名稱和出峰時間(min)，黑體標(biāo)記數(shù)字為產(chǎn)物Z1～Z7的最大峰面積.

3　討　論

本研究獲得了一株能夠降解ZEN的微桿菌Microbacteriumsp.FY1538. 目前尚未見到關(guān)于微桿菌降解ZEN的報道. 微桿菌是一類在土壤中分布廣泛、種類繁多但又研究稀少的一類細菌. 已有的研究發(fā)現(xiàn)微桿菌屬的細菌具有強大的有機物降解能力，有機大分子如黃原膠[21]、殼聚糖[22]，芳香化合物萘、菲、蒽、芘[23]、苯乙酮[24]、苯胺[25]，以及帶有雜環(huán)的尿酸[26]，除草劑氯乙酰[27]等多種化合物均有微桿菌可以降解的報道，不少研究已經(jīng)分離獲得了降解酶. 關(guān)于微桿菌的安全性方面,目前很少有資料表明該屬細菌與人類疾病直接相關(guān)，F(xiàn)unke等發(fā)現(xiàn)一例眼外傷導(dǎo)致的微桿菌屬感染[28]，Sharma等從一名肺移植患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一株耐藥性的微桿菌(Microbacteriumyannicii)[29]. 而微桿菌作為線蟲[30]等低等生物的病原體的報道較多. 目前在已有的研究報道中，還沒有發(fā)現(xiàn)微桿菌被特定物質(zhì)誘導(dǎo)后能夠產(chǎn)生某些特殊活性的報道.Microbacteriumsp.FY1538的全基因組測序工作即將開展，分析基因組測序信息將幫助我們更好地認(rèn)識微桿菌受到甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生降解赤霉烯酮的活性的原因.

本研究采用的是唯一碳源的方法從環(huán)境中富集篩選目標(biāo)微生物.實驗初期曾用ZEN干粉的無機鹽培養(yǎng)基懸濁液來富集，菌群幾乎沒有生長，ZEN也沒有明顯降解，富集沒有成功，推測ZEN的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性影響了微生物對其的利用. 從ZEN結(jié)構(gòu)上來看，酯鍵、酮基是比較容易打開的位點，斷開酯鍵的酶已經(jīng)有相關(guān)的報道(Gliocladiumroseum水解酶zhd101)，而斷開酮基相關(guān)的酶還沒有被發(fā)現(xiàn). 打開酮基需要BV單加氧酶(Baeyer-Villiger Monooxygenase， BVMO)，這類酶可以發(fā)生Baeyer-Villiger反應(yīng)，使酮基變?yōu)轷ユI，再用其他的酯酶水解打開. BVMO是B類黃素蛋白單加氧酶的一種，含F(xiàn)AD，依賴于輔酶NADPH[31]反應(yīng)，Yachnin等揭示了它的機理[32]. 本研究最終選擇了用環(huán)己酮、環(huán)戊酮、環(huán)十二酮、環(huán)十五酮代替ZEN作為唯一碳源來進行富集篩選，依據(jù)是這些化合物如果發(fā)生Baeyer-Villiger反應(yīng)并水解后，能形成微生物容易利用的結(jié)構(gòu)簡單的脂肪醇酸，是比較理想的富集碳源. 后續(xù)實驗也證實以這些環(huán)酮類作唯一碳源富集培養(yǎng)，培養(yǎng)液明顯渾濁，菌群有了明顯的生長.

對比已報道的其他ZEN降解菌的HPLC峰圖，微桿菌FY1538與它們的降解現(xiàn)象并不一致.粉紅黏帚霉(Gliocladiumroseum)降解ZEN的產(chǎn)物只有一個峰，出峰時間大大早于ZEN[13]；解毒毛孢子菌(Trichosporonmycotoxinivorans)降解ZEN的產(chǎn)物也只有一個峰，出峰時間略早于ZEN[17]，且峰面積與ZEN峰相當(dāng)，而本研究中產(chǎn)物峰面積遠小于ZEN峰；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ANSB01G降解ZEN的產(chǎn)物有兩個峰，出峰時間均略早于ZEN，峰面積遠小于ZEN峰，與本實驗現(xiàn)象最為相似，雖然產(chǎn)物峰數(shù)量較少[16]，很可能ANSB01G與FY1538在降解ZEN上有一部分反應(yīng)機理是相同或類似的. 其他的一些ZEN降解菌的研究并沒有呈現(xiàn)相關(guān)的HPLC數(shù)據(jù)，目前還不能確定FY1538與它們反應(yīng)機理之間的相似性.

ZEN被微桿菌降解后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、降解過程的機理，產(chǎn)物是否還有雌激素性質(zhì)或其他毒性等是需要進一步研究的課題.

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Analysis of Zearalenone-Degrading Activities ofMicrobacteriumsp.FY1538

XU Tianyu1, 2， HU Suying1, 2， ZHOU Jungang1, 2， Lü Hong1, 2

(1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University， Shanghai 200438， China；2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms，Shanghai200438，China)

Zearalenone(ZEN), is secreted by the numerousFusariumspecies, such asFusariumgraminearum, via the pathway of polyketide synthesis. It is a nonsteroidal oestrogenic mycotoxin with stable physicochemical property. ZEN causes hyperestrogenism in poultry, livestock and human beings. In human bodies, the accumulation of ZEN can make damage in reproductive system, kidney, liver, and even induce cancers. In this study, we isolated a bacterium ofMicrobacteriumsp. from soil, which can use cyclopentanone as the sole carbon source and degrade ZEN efficiently. We designated this bacterium asMicrobacteriumsp.FY1538, and preserved it in China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC NO.10614). Being cultured in LB medium and induced by methanol, thisMicrobacteriumproduces the enzymes for degrading ZEN in the supernatant. After analyzing the supernatant with degraded ZEN via HPLC, we found several potential products.

Zearalenone;Microbacterium; biodegradation

0427-7104(2016)02-0223-09

2015-05-21

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2013AA102803B，2014AA021301)，上?？莆亟ㄔO(shè)(13DZ2252000)和遺傳工程國家重點實驗室開放課題

徐天宇(1990—)，男，碩士研究生；呂紅，女，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail：honglv@fudan.edu.cn.

Q 939.96

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