巫寶霞，楊桂珍，溫智幸，姚小珍，林楚婷，鐘　慧

(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東　湛江　524048)

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響應(yīng)面法優(yōu)化野生蛤蔞多糖提取工藝*

巫寶霞，楊桂珍，溫智幸，姚小珍，林楚婷，鐘慧

(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東湛江524048)

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定野生蛤蔞中多糖的含量及采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法(RSM)優(yōu)化野生蛤蔞多糖的提取條件。超聲波輔助提取野生蛤蔞多糖，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法相結(jié)合的方法，確定最佳條件。通過試驗(yàn)，最佳測試波長為510 nm、顯色劑用量為1.5 mL、顯色時(shí)間5 min、HCl溶液的用量為0.15 mL，水解時(shí)間為20 min；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化確定提取野生蛤蔞多糖的最佳工藝條件如下：超聲功率160 W，超聲時(shí)間15 min，超聲溫度60 ℃，料液比1:16。此條件下蛤蔞的提取率為12.20%。

響應(yīng)面法；蛤蔞；多糖；超聲波提??；DNS法

蛤蔞，為胡椒科胡椒屬植物，別名假蔞、大柄蔞、山蔞、畢拔子，為野生匍匐或攀援藤本，葉子有一種特異的香味[1]。另因其具有醫(yī)療保健功效，目前有將其制成美味菜肴[2],其實(shí)可以作現(xiàn)代副食品作料以及添加劑，如作為保健品開發(fā)，或作為特殊人群的保健食品(即作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑直接加入食品中)[3]。另外，目前國內(nèi)外對蛤蔞的提取物活性和其揮發(fā)油的提取進(jìn)行了研究[4-7]，近年來，隨著生活水平提高，人們逐漸注重健康保健，隨之多糖作為保健食品[8-10]的成分已悄然興起。本研究通過采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法[11-14]對蛤蔞提取物中多糖的研究，從而為蛤蔞的食藥兩用及進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1試驗(yàn)材料

蛤蔞(供試)采摘于湛江市；由中國食品藥品檢定研究所提供蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品；供試試劑：鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉均為分析純。

DNS顯色試劑的配制：參考文獻(xiàn)[12]，加以修改。具體配制方法為：稱取10.5 g NaOH固體配成濃溶液，再準(zhǔn)確稱取DNS 3.15 g溶于約200 mL水中，在溫度為45 ℃水浴條件下邊攪拌邊依次加入91 g酒石酸鉀鈉，完全溶解后依次加入NaOH濃溶液，2.5 g苯酚及2.5 g無水亞硫酸鈉，待完全溶解后，將溶液冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，搖勻后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫放置一周后使用。

供試儀器：UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；AUY120型電子分析天平，日本島津天平有限公司；GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FW-200型高速萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，河南鞏義市英峪豫華儀器廠。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料預(yù)處理

將當(dāng)?shù)夭烧木奶暨x出葉子完好、綠色的蛤蔞葉，用自來水洗3次，再用蒸餾水重復(fù)洗3次。置于烘箱中80 ℃恒溫烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎過篩，貯于玻璃瓶(干燥帶塞)，置于干燥器中待用。

1.2.2提取劑的篩選

準(zhǔn)確稱取6份已處理好的蛤蔞粉1.000 g于潔凈圓底燒瓶中，加入16 mL的無水乙醇以去除有色物質(zhì)、單糖、低聚糖和小分子物質(zhì)[10]，置于恒溫80 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h后抽濾，取濾渣分別加入用蒸餾水、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60% 乙醇等6 種不同提取劑各16 mL，在60 ℃，功率為250 W，時(shí)間為15 min下超聲。抽濾，各吸取濾液0.5 mL于兩支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L鹽酸于一支，20 min沸水浴，快速冷卻加入4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9，兩支各加入1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴，快速冷卻至室溫，加蒸餾水定容，測定吸光度(波長為510 nm)，重復(fù)三次。

1.2.3液料比對多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取待用的蛤蔞粉1.000 g 5份于250 mL潔凈圓底燒瓶中，分別加入12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL的無水乙醇，置于恒溫80 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h后抽濾，取濾渣分別加入蒸餾水12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL，在60 ℃、功率為250 W、時(shí)間為15 min下超聲。抽濾，各吸取濾液0.5 mL于兩支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L鹽酸于一支，20 min沸水浴，快速冷卻加入4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9，兩支各加入1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴，快速冷卻至室溫，加蒸餾水定容，測定吸光度(波長為510 nm)，重復(fù)三次。

1.2.4超聲溫度對多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取待用的蛤蔞粉1.000 g 5份于250 mL潔凈圓底燒瓶中，加入16 mL的無水乙醇，置于恒溫80 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h后抽濾，取濾渣加入蒸餾水16 mL，分別在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，功率為250 W，時(shí)間為15 min下超聲。抽濾，各吸取濾液0.5 mL于兩支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L鹽酸于一支，20 min沸水浴，快速冷卻加入4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9，兩支各加入1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴，快速冷卻至室溫，加蒸餾水定容，測定吸光度(波長為510 nm)，重復(fù)三次。

1.2.5超聲時(shí)間對多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取5份已處理好的蛤蔞粉1.000 g 于潔凈圓底燒瓶中，加入16 mL的無水乙醇，置于恒溫80 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h后抽濾，取濾渣加入蒸餾水16 mL、在25 ℃、功率為250 W，時(shí)間為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min下超聲。抽濾，各吸取濾液0.5 mL于兩支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L鹽酸于一支，20 min沸水浴，快速冷卻加入4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9，兩支各加入1.5 mL DNS試劑，5 min沸水浴，快速冷卻至室溫，加蒸餾水定容，測定吸光度(波長為510 nm)，重復(fù)三次。

1.2.6超聲功率對多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取5份已處理好的蛤蔞粉1.000 g 于潔凈圓底燒瓶中，加入16 mL的無水乙醇，置于恒溫80 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h后抽濾，取濾渣加入蒸餾水16 mL，在25 ℃，功率為100 W、130 W、160 W、190 W、220 W，時(shí)間為10 min下超聲。抽濾，各吸取濾液0.5 mL于兩支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L鹽酸于一支，20 min沸水浴，快速冷卻加入4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9，兩支各加入1.5 mL DNS試劑，5 min 沸水浴，快速冷卻至室溫，加蒸餾水定容，測定吸光度(波長為510 nm)，重復(fù)三次。采用DNS法分別測定樣品提取液中還原糖和總糖的單糖含量，總糖與還原糖吸光度值的差就是樣品中多糖水解為還原糖部分的吸光度值(A多糖=A總糖-A還原糖)。

式中：m——蛤蔞質(zhì)量

1.2.7響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛤蔞多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間及超聲功率為響應(yīng)變量，用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法對蛤蔞葉多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素與水平表見表1。

表1　Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案(BBD)

2　結(jié)果與分析

2.1提取劑的篩選

由表2可知在6種提取劑中，吸光度最高是蒸餾水提取劑，吸光度達(dá)到0.035，而其他5種提取劑時(shí)的吸光度均在0.024～0.033 內(nèi)，均比蒸餾水提取劑低。故以下試驗(yàn)中都采用蒸餾水為提取劑。

表2　蛤蔞多糖在不同溶劑中的溶解性

2.2不同液料比的選擇

從圖1可知，當(dāng)提取劑體積小于16 mL時(shí)，隨體積的增大，其吸光度不斷增大，隨之逐漸變小。當(dāng)提取劑體積為16 mL，即液料比為1:16(g:mL) 時(shí)的吸光度值為最大，達(dá)到0.067，其多糖提取效果最佳。當(dāng)提取劑體積大于16 mL 時(shí)，吸光度則隨提取劑體積的增大而不斷下降，這可能由于達(dá)到最高提取率后再提高液料比，濃度被稀釋，吸光度又會下降。當(dāng)提取劑體積為18 mL時(shí)，多糖提取液吸光值下降到最小值，為0.049。

圖1　提取劑的影響

2.3不同超聲時(shí)間的選擇

從圖2可知，在10～15 min時(shí)，隨超聲時(shí)間增長，吸光度增大，在15 min 達(dá)到最高，此時(shí)吸光度最大，為0.093而在20～35 min 間，隨超聲時(shí)間增長，吸光度反而下降，從0.078下降到0.042，這主要是多糖隨提取時(shí)間延長而發(fā)生分解致使其吸光度下降。

圖2　超聲功率的影響

2.4不同超聲溫度的選擇

從圖3可知，隨溫度升高，吸光度不斷增加，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)吸光度達(dá)到最大值，為0.068。此后，吸光度值隨溫度的升高而不斷下降。在70 ℃和80 ℃時(shí)的吸光值分別為0.054、0.053，基本達(dá)到一個(gè)平衡值。因此，當(dāng)其他條件一定時(shí)，蛤蔞多糖提取的最適溫度為60 ℃。

圖3　超聲提取時(shí)間的影響

2.5不同超聲功率的選擇

從圖4可知，隨功率的增大，吸光度不斷增加，當(dāng)功率達(dá)到160 W時(shí)吸光度達(dá)到最大值，為0.074。此后，吸光度值隨功率的增大而不斷下降。因此，當(dāng)其他條件一定時(shí)，蛤蔞多糖提取的最適功率為160 W。

圖4　微波功率的影響

2.6試驗(yàn)結(jié)果與模型建立

表3　BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依表1進(jìn)行4個(gè)因素(液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率)與多糖提取率之間的4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果詳見表3。對4個(gè)變量中心復(fù)合設(shè)計(jì)后所測得的蛤蔞多糖提取率結(jié)果見表2所示。

用Design Expert 8. 05 軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得以提取液的吸光度Y(即多糖提取率)對編碼自變量A、B、C、和D的二次多項(xiàng)回歸方程多糖提取率=0.12+0.011A+5.467E-003B+3.385E-003C+5.741E-003D-1.225E-003AB+2.303E-003AC-2.550E-003AD+1.975E-003BC+3.950E-003BD-4.622E-003CD-0.024A2-0.026B2-0.028C2-0.025D2

式中A、B、C、D分別為料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率的編碼值。

據(jù)方差分析結(jié)果，上述回歸方程描述與響應(yīng)面值之間的關(guān)系時(shí)因其模型的極顯著(P≤0.01)，差擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.2759>0.05(不顯著)，表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，該方程是蛤蔞多糖提取率與提取工藝各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，所以，可以利用此回歸方程確定蛤蔞多糖提取率的最佳提取工藝。一次項(xiàng)A、B，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響顯著。即料液比，超聲時(shí)間對多糖提取率的影響最為顯著。

表4　方差分析

2.7響應(yīng)面分析

從響應(yīng)面(其是響應(yīng)值對各試驗(yàn)因子A、B、C和D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖)分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用，依據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等值線圖，結(jié)果見圖5～圖10。

從圖5～圖10中可較直觀地看出各因素交互作用對蛤蔞中多糖得率的影響，當(dāng)曲線越陡峭，表明該因素對多糖得率的影

響越大，則相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小。從等高線圖可看出存在極值的條件應(yīng)在圓心處。從圖5～圖10可以看出對多糖的得率影響最大是料液比，其次是超聲時(shí)間，表3回歸分析結(jié)果也正與此相吻合，料液比和超聲時(shí)間二者對應(yīng)的P值小于0.05，均達(dá)到了顯著水平。

圖5　料液比和時(shí)間對多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面3D圖

圖6　料液比和溫度對多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面3D圖

圖7　料液比和功率對多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面3D圖

圖8　時(shí)間和溫度對多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面3D圖

圖9　功率和時(shí)間對多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面3D圖

圖10　溫度和功率對多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面3D圖

2.8最佳工藝條件的驗(yàn)證

由Design Expert 8.05 軟件得到蛤蔞多糖提取的最佳提取條件為液料比1:16.1(g:mL)、超聲溫度61.1 ℃、超聲時(shí)間15 min，超聲功率160W，在這條件下，蛤蔞多糖提取液的吸光度為0. 121。為了便于實(shí)際操作的情況，將最佳工藝條件修正為液料比1:16(g:mL)、提取溫度61 ℃、提取時(shí)間15 min，在這條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得到蛤蔞多糖提取液的平均吸光度為0. 122，從而說明采用響應(yīng)面法得到的優(yōu)化工藝結(jié)果是可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié)　論

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛤蔞多糖提取工藝參數(shù)，得出最

佳工藝條件如下：超聲功率160 W，超聲時(shí)間15 min，超聲溫度60 ℃，料液比1V16，此條件下蛤蔞多糖的提取率預(yù)測值為12.10%，蛤蔞多糖的提取率實(shí)驗(yàn)值為12.20%±0.25%，此條件下與預(yù)測值十分接近，可說明模型比較可靠，為大規(guī)模提取蛤蔞多糖提供了一定的參考。

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Optimization of Extraction of Polysaccharide from Piper Sarmentosum Roxb by Response Surface Methodology*

WUBao-xia,YANGGui-zhen,WENZhi-xing,YAOXiao-zhen,LINChu-ting,ZHONGHui

(Chemistry and Chemical Engineering, Lingnan Normal University, Guangdong Zhanjiang 524048, China)

The determination of polysaccharide in piper sarmentosum roxb with 3，5-Dinitrosalicylic acid colorimitry and the improvement of measuring conditions for polysaccharide in piper sarmentosum roxb with RSM were studied. In this experiment, with the assitant of the ultrasonic, we can draw a conlusion of the optimum conditions for the determination with the combination of single factor test and RSM. Acoording to the experiment, the perfact wavelength, the dosage of chromogeric，the coloring time, the dosage of saline solution and the hydrolysis time were determined as 510 nm, 1.5 mL, 5 min, 0.15 mL and 20 min. On the basic of single factor test, when the optimal technical conditions including ultrasonic power, ultrasound time, tempereture of ultrasonic and the ratio of material liquid can individually reach 160 W, 15 min, 60 ℃ and 1:16, it can get the highest extraction rate of polysaccharide in wild clams with RSM. The highest extraction ratio can reach 12.20%.

the response surface method；piper sarmentosum roxb；polysaccharide ultrasonic extraction；DNS colorimetry

大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201310579004)資助。

巫寶霞(1992-)，女，本科，在讀學(xué)生。

楊桂珍。

TS201.1

B

1001-9677(2016)05-0089-05