■ 林偉 （信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 464000）

信陽(yáng)市鰱、鳙魚(yú)爆發(fā)性出血病口服疫苗的制備及免疫防治效果研究

■ 林偉 （信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 464000）

鰱、鳙魚(yú)生長(zhǎng)在淡水湖泊、河流、水庫(kù)、池塘里。多分布在水域的中上層，是中國(guó)特有魚(yú)類(lèi)，在中國(guó)分布范圍很廣，是池塘養(yǎng)殖及水庫(kù)漁業(yè)的主要對(duì)象之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。盛產(chǎn)于有“中原第一湖”美譽(yù)的信陽(yáng)南灣湖的南灣魚(yú)，就是鰱、鳙魚(yú)，獨(dú)特的氣候條件和優(yōu)質(zhì)的水資源孕育出的南灣魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美爽口，年產(chǎn)量達(dá)180萬(wàn)kg，是地道的無(wú)公害綠色食品。

近年來(lái)，信陽(yáng)市很多養(yǎng)殖鰱、鳙魚(yú)的池塘發(fā)生了爆發(fā)性出血病，病魚(yú)體表、頭部、魚(yú)鰭基部大量出血，一旦發(fā)病死亡率可達(dá)90%以上。給養(yǎng)殖戶(hù)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)鑒定病原為嗜水氣單胞菌，目前，對(duì)該病多采用化學(xué)藥物治療，療效不是很理想，容易誘導(dǎo)耐藥菌株產(chǎn)生，引起環(huán)境污染，同時(shí)還會(huì)引起藥物殘留。研究表明，疫苗接種是控制養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物疾病的有效途徑之一。然而，采用注射法和浸泡法接種在操作上有著很多的不方便性?？诜臃N具接種方便、不損傷機(jī)體、可用于各種規(guī)格的水生動(dòng)物。但直接口服菌體可能在胃腸中被降解或不能被腸道有效吸收，因而效果不佳。因此，制備一種可口服疫苗來(lái)預(yù)防嗜水氣單胞菌感染十分必要。

利用生物可降解材料如丙烯酸樹(shù)脂、海藻膠或脂質(zhì)體等包裹弧菌或殺鮭氣單胞菌抗原制成口服疫苗微粒，免疫魚(yú)體后可誘導(dǎo)腸道粘膜免疫和全身性免疫應(yīng)答。在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用聚乳酸一乙醇酸共聚物（poly（1actide—CO—glycolide），PLG）包裹抗原制成疫苗微粒，經(jīng)口服免疫后亦顯示明顯的免疫保護(hù)效應(yīng)。這些生物可降解材料均可防止抗原在胃腸中被降解。其中，PLG疫苗微?？芍瞥筛煞?，保存、使用方便。此外，在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)PLG具有佐劑效應(yīng)，可確保低劑量的抗原被提呈，從而誘導(dǎo)粘膜免疫和全身性免疫。本實(shí)驗(yàn)制備了含嗜水氣單胞菌滅活菌體的PLG疫苗微粒，并以鰱、鳙魚(yú)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究這種疫苗微粒的免疫保護(hù)效應(yīng)。

表1 口服疫苗后鰱、鳙魚(yú)的抗體滴度

表2 口服疫苗后腸粘膜抗體滴度

表3 嗜水氣單胞菌對(duì)鰱、鳙魚(yú)LD50的測(cè)定

表4 口服疫苗后感染嗜水氣單胞菌后鰱、鳙魚(yú)存活情況

l 材料與方法

1.1 主要試劑和菌株生長(zhǎng)條件

PLG（RG 505）為上海某公司產(chǎn)品，聚乙烯醇1788（PVA一1788）為鄭州某石化維綸廠產(chǎn)品，親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶為鄭州愛(ài)科生物工程公司產(chǎn)品，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。嗜水氣單胞菌分離自染病鰱、鳙魚(yú)，用胰酶大豆瓊脂（TSA）于28℃培養(yǎng)。

1.2 疫苗微粒的制備和檢測(cè)

采用復(fù)乳揮發(fā)法制備疫苗微粒。蛋白含量測(cè)定采用BCA法，測(cè)定前疫苗微粒用3.0mLl mol/LNaOH（含5%SDS）室溫溶解24h，室溫離心（4,000×g，10 min）收集上清液。

1.3 鰱、鳙魚(yú)的免疫接種

選取體重約為200g的健康鰱、鳙魚(yú)，隨機(jī)分為2組，即全菌疫苗微粒免疫組及空微粒組，每組鰱、鳙魚(yú)各50尾，每組兩個(gè)平行。各組鰱、鳙魚(yú)均口服免疫3次，時(shí)間間隔為2周，免疫前停飼24h。每次免疫劑量為10mg疫苗微?；蚩瘴⒘＃謩e于初種后第20d，34d，48d隨機(jī)在每組取鰱、鳙魚(yú)各5尾，采集心臟血液和后腸粘液，于-40℃保存。

1.4 抗體滴度檢測(cè)

生物素標(biāo)記的兔抗鰱、鳙魚(yú)Ig 按以下方法制備：注射免疫致敏鰱、鳙魚(yú)的血清經(jīng)IgM 純化柱純化后，收集IgM 并用弗氏完全佐劑乳化，進(jìn)行家兔免疫，采集家兔抗血清用Protein A/G柱純化，收集兔抗鰱、鳙魚(yú)Ig 并進(jìn)行生物素標(biāo)記。ELISA檢測(cè)按文獻(xiàn)等介紹的方法進(jìn)行。酶標(biāo)板用適量滅活菌體懸液包被，第1抗體為適當(dāng)稀釋的鰱、鳙魚(yú)血清或腸粘液，第2抗體為生物素標(biāo)記的兔抗鰱、鳙魚(yú)Ig。親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶用來(lái)結(jié)合第2抗體。以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為顯色底物，于405nm測(cè)定光吸收值。陰性對(duì)照為未免疫鰱、鳙魚(yú)的血清或腸粘液，待測(cè)樣品與陰性對(duì)照的A 比值≥2即視為陽(yáng)性反應(yīng)?？贵w滴度用稀釋度表示，當(dāng)待測(cè)樣品A405比值≥2時(shí)，以（A樣品一A對(duì)照）/A對(duì)照的比值作為基本稀釋度的系數(shù)，求出最終的抗體滴度。

1.5 菌株毒力測(cè)定

嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測(cè)定在約26℃的水體中進(jìn)行。100尾健康鰱、鳙魚(yú)（體重約200g）隨機(jī)分為5組，除對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌PBS外，其余4組均腹腔注射5×108～8×108cfu/g嗜水氣單胞菌，觀察3周，記錄注射菌量及死魚(yú)數(shù)，并通過(guò)病理檢驗(yàn)確定死因是否為嗜水氣單胞菌感染。按Bliss 統(tǒng)計(jì)法計(jì)算LD50。

1.6 免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)水溫約26℃。鰱、鳙魚(yú)第3次口服疫苗微?；蚩瘴⒘：蟮?周（即初種后第42d），用1%（v/v）乙醚溶液進(jìn)行輕度麻醉。然后腹腔注射400 μL嗜水氣單胞菌液（含20 LD50），觀察3周。記錄死魚(yú)數(shù)，并進(jìn)行病理檢驗(yàn)，計(jì)算存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非配對(duì)t檢驗(yàn)用于各組的抗體滴度比較，F(xiàn)isher，s雙側(cè)檢驗(yàn)用于存活率差異分析，平均存活時(shí)間的計(jì)算和比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 口服疫苗微粒的特性

利用PLG包裹細(xì)菌滅活菌體，制備了菌體疫苗微粒。經(jīng)顯微鏡檢測(cè)表明，疫苗微粒形態(tài)基本一致，呈圓球狀，直徑約10μm。BCA法測(cè)定顯示，菌體疫苗微粒的蛋白質(zhì)含量分別為5.67 %±0.34%；蛋白質(zhì)包裹效率為93.29 %±3.26% ，說(shuō)明菌體被有效包裹入PLG微粒。

2.2 血清的抗體應(yīng)答

ELISA法測(cè)定了第1次和第2次加強(qiáng)免疫后的鰱、鳙魚(yú)血清。結(jié)果表明，全菌疫苗微粒組可檢測(cè)到明顯的血清抗體，并且，在第2次加強(qiáng)免疫1周后（即初種后第34d），疫苗誘導(dǎo)的血清抗體達(dá)到最高水平，到第2次加強(qiáng)免疫3周后（即初種后第48d），血清抗體水平明顯下降（表1）?？瘴⒘＝M的3批血清經(jīng)ELISA檢測(cè)時(shí)，其A405與陰性對(duì)照的A405比值均小于2，表明空微粒不會(huì)誘導(dǎo)鰱、鳙魚(yú)產(chǎn)生抗嗜水氣單胞菌抗體。這些結(jié)果表明全菌口服疫苗微?？烧T導(dǎo)鰱、鳙魚(yú)產(chǎn)生血清抗體應(yīng)答。

2.3 腸粘液的抗體應(yīng)答

鰱、鳙魚(yú)免疫接種前或接種后，分別采集鰱、鳙魚(yú)腸道后半段的腸粘液，用ELISA法測(cè)定腸粘液的抗體水平。結(jié)果表明，全菌疫苗組的腸粘液檢測(cè)到抗體，但抗體滴度遠(yuǎn)低于血清（表2）。空微粒組的腸粘液則無(wú)一例呈陽(yáng)性反應(yīng)。由此可見(jiàn)，疫苗微?？烧T導(dǎo)低水平的粘膜抗體應(yīng)答。

2.4 菌株毒力

在本實(shí)驗(yàn)條件下，鰱、鳙魚(yú)經(jīng)腹腔注射不同細(xì)菌劑量后的死亡情況見(jiàn)表3。所有死亡鰱、鳙魚(yú)經(jīng)病理檢均為嗜水氣單胞菌感染致死。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Bliss統(tǒng)計(jì)法處理，求得嗜水氣單胞菌對(duì)鰱、鳙魚(yú)的LD50為3.7×106cfu/g，95 %可信區(qū)為1.1×106～1.3×106cfu/g。

2.5 疫苗微粒的保護(hù)效應(yīng)

各組鰱、鳙魚(yú)經(jīng)3次口服免疫后，腹腔注射20LD50嗜水氣單胞菌。接種后第1d，各組鰱、鳙魚(yú)都有部分出現(xiàn)感染癥狀，但未出現(xiàn)死亡，死亡時(shí)間主要在第3d到第8d（表4）。全菌疫苗組及空微粒組的存活率分別為58%及8 %。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)表明，嗜水氣單胞菌全菌疫苗可誘導(dǎo)鰱、鳙魚(yú)的免疫應(yīng)答?？诜臃N疫苗微粒后，魚(yú)血清和腸粘液均有抗嗜水氣單胞菌抗體產(chǎn)，表明魚(yú)腸道可吸收PLG微粒包裹的抗原。魚(yú)類(lèi)后腸的腸道相關(guān)淋巴組織可能是抗原吸收的場(chǎng)所 。

魚(yú)類(lèi)的血清抗體應(yīng)答和粘膜抗體應(yīng)答可能是2種相對(duì)獨(dú)立的免疫應(yīng)答機(jī)制，血清抗體應(yīng)答屬全身性免疫應(yīng)，粘膜抗體應(yīng)答為局部免疫應(yīng)答。一般情況下，只有抗原與腸粘膜表面直接接觸，才能誘導(dǎo)腸粘膜免疫應(yīng)答。某些抗原經(jīng)適當(dāng)免疫途徑可同時(shí)引起血清及粘膜抗體應(yīng)答，但由于應(yīng)答機(jī)制，血清及粘膜抗體應(yīng)答水平必然存在差異。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，疫苗微粒誘導(dǎo)的血清抗體水平都大大的高于腸粘液抗體水平。

細(xì)菌攻擊實(shí)驗(yàn)表明疫苗微粒具有較好的保護(hù)效應(yīng)?？傊?，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌全菌疫苗微?？烧T導(dǎo)鰱、鳙魚(yú)的血清及腸粘液抗體應(yīng)答，表明疫苗微粒可作為預(yù)防嗜水氣單胞菌感染的鰱、鳙魚(yú)用疫苗。（參考文獻(xiàn)略）