■ 周陽(yáng) 胡先勤 周建軍 彭銀蘇 王超 羅一帆 陳潛雙

（武漢輕工大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

環(huán)孢素A對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰皰疹病毒增殖的影響

■ 周陽(yáng) 胡先勤 周建軍 彭銀蘇 王超 羅一帆 陳潛雙

（武漢輕工大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）是從國(guó)外引進(jìn)的一種重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類，深受消費(fèi)者青睞。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度日益提高，養(yǎng)殖環(huán)境惡化，斑點(diǎn)叉尾鮰病害日趨嚴(yán)重，其中由斑點(diǎn)叉尾鮰皰疹病毒（channel catfish virus，CCV）引發(fā)的斑點(diǎn)叉尾鮰皰疹病毒?。╟hannel catfish virus disease，CCVD）危害最大。CCVD的暴發(fā)造成魚(yú)苗、魚(yú)種的死亡率高達(dá)90%以上，且無(wú)有效的治療方法，給斑點(diǎn)叉尾鮰的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大量研究表明，環(huán)孢素A（CsA）對(duì)多種病毒的增殖具有抑制作用，而關(guān)于CsA對(duì)CCV的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究CsA對(duì)CCV增殖的影響，以期為防治斑點(diǎn)叉尾鮰皰疹病毒病提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與培養(yǎng)

斑點(diǎn)叉尾鮰卵巢細(xì)胞系（channel catfish ovary cell，CCO）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院提供。CCO細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在280C含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通常2～3d傳代1次，將細(xì)胞用PBS洗1次，在每個(gè)T25培養(yǎng)瓶中加入1ml的胰酶消化1min左右，隨后再將胰酶除去，最后再添加含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基15ml，將細(xì)胞吹散，搖勻分到3個(gè)T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2 病毒與感染

CCV病毒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院提供。待CCO細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，以適當(dāng)比例傳代于大瓶中培養(yǎng)，24h內(nèi)進(jìn)行CCV的感染，首先吸去瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞用無(wú)胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液清洗1遍，隨后吸去沒(méi)有用的廢液，然后向細(xì)胞內(nèi)加入稀釋過(guò)107倍的CCV懸液0.5ml，使液體覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)面，280C孵育1h，期間每隔20min輕搖晃1次使液體完全覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)面，之后吸棄CCV懸液，加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)、增殖，隨后在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞完全病變后就放入-800C下保存。

1.3 抑制劑（CSA）的配制及其細(xì)胞毒性檢測(cè)

將CSA粉末溶入DMSO中配制成不同的濃度分開(kāi)裝好后置于-200C冰箱中保存。在96孔板上接種CPB細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到單層時(shí)，更換含有不同濃度CsA的培養(yǎng)液（0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L），在培養(yǎng)12h、24h、36h、48h和72h后用MTS法分別檢測(cè)其細(xì)胞活性。

1.4 CSA對(duì)CCV病毒增殖的影響

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接種CCO，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至55%左右融合時(shí)，就開(kāi)始加入含不同濃度CSA培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立DMSO為對(duì)照組，CsA作用12h后接種1 MOI 的CCV，吸附完成后換入含不同濃度CsA的培養(yǎng)基，CCV感染后72h收取樣品。用TCID50法檢測(cè)病毒滴度。

1.5 CsA對(duì)CCV誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的影響

將CCO細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，等細(xì)胞長(zhǎng)到50%～60%融合時(shí)，換入含有CsA的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立DMSO為對(duì)照組。CsA作用12h后接種1 MOI 的CCV。另設(shè)一組接種無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，作為正常細(xì)胞對(duì)照組。感染后12h、24h、36h和48h收取樣品，加入TRizol試劑裂解，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol試劑盒提取總RNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒，每個(gè)樣品使用1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR染料法（Takara的SYBR Premix Ex Taq試劑盒）進(jìn)行相對(duì)定量PCR，以斑點(diǎn)叉尾鮰的18s rRNA作為內(nèi)參，用△△CT法計(jì)算，以全培養(yǎng)基組作為100%。使用ABI 7,500熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為：首先95℃ 30s進(jìn)行預(yù)變性；隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)為95℃ 5s，60℃ 34s。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，進(jìn)行溶解曲線分析，以確定引物的特異性。實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CSA對(duì)CCO細(xì)胞毒性檢測(cè)

從圖1中可以看出，當(dāng)CsA的濃度小于等于10μmol/L的時(shí)候，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)CCO細(xì)胞的活力均無(wú)顯著影響。因此，后續(xù)研究中使用CsA的最大濃度為10μmol/L。

表1 qRT-PCR引物

2.2 CSA對(duì)CCV病毒增殖的影響

從圖2中可以看出，CsA濃度在0～10μmol/L之間，隨著細(xì)胞中添加的CSA濃度的增加，細(xì)胞被病毒感染的感染率在不停降低，說(shuō)明CsA對(duì)CCV的增殖起著抑制作用。

2.3 CsA對(duì)CCV誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的影響

CCV的感染會(huì)誘導(dǎo)宿主的先天性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致宿主的一些細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生變化，為研究CsA 對(duì)CCV感染后的細(xì)胞因子表達(dá)的影響，于感染后的6h、12h、24h、36h、48h和72h分別收樣，用qRT-PCR方法檢測(cè)CPB細(xì)胞中細(xì)胞因子的變化。結(jié)果表明，CsA對(duì)CCV感染后誘導(dǎo)的IL-8和TNF-α的表達(dá)均有抑制作用（圖3，圖4）。

3 討論

環(huán)孢素A（CsA），是一種使用廣泛、作用強(qiáng)效的免疫抑制劑，可以特異和可逆地作用于淋巴細(xì)胞，抑制淋巴細(xì)胞的激活和增殖，抑制某些細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，從而起到抑制細(xì)胞免疫的作用。CsA是由11個(gè)氨基酸組成的多肽。CsA進(jìn)入細(xì)胞后先與CypA形成復(fù)合物（CypACsA），再與鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CN）結(jié)合，抑制CN酶活性，從而使其底物——激活的T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NF-AT）不能去磷酸化，抑制了NF-AT從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，進(jìn)一步抑制IL-2、IL-4、γ-干擾素等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。CsA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)阻斷T細(xì)胞的活化，從而實(shí)現(xiàn)免疫抑制效果。

關(guān)于CsA對(duì)病毒增殖的抑制作用已有很多的研究報(bào)道。Kim等對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）研究發(fā)現(xiàn)，CsA能抑制PEDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制PEDV的增殖。CsA 對(duì)多種冠狀病毒的增殖都有抑制作用。CsA通過(guò)調(diào)節(jié)干擾素途徑的關(guān)鍵因子的表達(dá)，促進(jìn)I型干擾素的先天性免疫功能，從而抑制輪狀病毒的復(fù)制。在對(duì)甲型流感病毒和丙型肝炎病毒等研究中，也有類似的結(jié)果[10,11]。胡先勤等研究表明，CsA可以顯著抑制鱖魚(yú)虹彩病毒（ISKNV）的增殖。本文的研究結(jié)果表明，CsA也能顯著抑制CCV的增殖，有關(guān)于其作用機(jī)理需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

病毒感染會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，本文研究結(jié)果表明，CsA對(duì)CCV感染后誘導(dǎo)的IL-8和TNF-α的表達(dá)有抑制作用。提示CsA對(duì)CCV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，可能在相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，有關(guān)其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

由于CsA對(duì)CCV的增殖具有顯著的抑制作用，由此推測(cè)CsA及其衍生物將來(lái)可以作為防治CCV的候選藥物。

略）【基金項(xiàng)目：武漢輕工大學(xué)大學(xué)生科研項(xiàng)目（xsky2016026）；武漢輕工大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（2016RZ10）】

圖1 MTS法檢測(cè)CsA對(duì)CCO細(xì)胞的毒性

圖2 不同濃度CsA對(duì)CCV增殖的影響

圖3 CsA對(duì)CCV感染后細(xì)胞中IL-8表達(dá)的影響

圖4 CsA對(duì)CCV感染后細(xì)胞中TNF-α表達(dá)的影響