吳春紅

(中國石油化工股份有限公司北京化工研究院燕山分院，橡塑新型材料合成國家工程研究中心，北京 102500)

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綜述

LC-NMR聯(lián)用技術(shù)的研究進展

吳春紅

(中國石油化工股份有限公司北京化工研究院燕山分院，橡塑新型材料合成國家工程研究中心，北京 102500)

本文從NMR的靈敏度，溶劑的相容性、溶劑譜峰的抑制、聯(lián)用儀器NMR探頭的設(shè)計、LC-NMR操作模式等方面對LC-NMR聯(lián)用儀器的發(fā)展過程進行了較為詳細的介紹，并依托文獻的研究實例對連續(xù)流(continuous flow)方式和駐流(stopped flow)方式兩種操作模式進行了對比分析。

LC-NMR聯(lián)用連續(xù)流駐流

1　引言

最近的幾十年，應(yīng)用與分離技術(shù)相關(guān)的儀器聯(lián)用技術(shù)進行復(fù)雜基體的定性和定量分析發(fā)展很快。分離技術(shù)中高效液相色譜(HPLC)是分析復(fù)雜有機物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段，近年來相關(guān)技術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用的實際應(yīng)用，但MS本身并不能夠提供清晰的分子結(jié)構(gòu)信息，而且在實際HPLC-MS的使用中，常常需要核磁共振(NMR)的數(shù)據(jù)。隨著近年來NMR儀器靈敏度的不斷提高，HPLC與NMR直接相連已經(jīng)成為可能，HPLC與MS或NMR的物理連接增強了解決未知化合物結(jié)構(gòu)問題的能力[1，2]。 20世紀70年代末，第一次有人將HPLC-NMR聯(lián)用，由于技術(shù)方面的原因，直到80年代末HPLC-NMR技術(shù)才作為一種有效的分析手段而得到了承認。最近幾年HPLC-NMR的分析方法迅速發(fā)展并取得了巨大的成功，已經(jīng)被證明為生物化學(xué)和藥物化學(xué)分析中最重要的分子結(jié)構(gòu)鑒定方法之一[3]。

1978年，第一篇關(guān)于LC-NMR聯(lián)用的文章問世，采用駐流操作的方法分析了一個含有兩至三個已知化合物的混合物，那時，NMR方面的局限比較嚴重，主要是NMR溶劑、軟件、硬件以及只有在旋轉(zhuǎn)狀態(tài)才能得到較高分辨率的譜圖，使得NMR直接與HPLC聯(lián)用比較困難[4]。M.V. Silva Elipe[5]曾經(jīng)使用四氯乙烯或四氯化碳作溶劑，ETH-Silia作為正相柱進行過聯(lián)用實驗，但由于當(dāng)時溶劑峰抑制技術(shù)的欠缺，使得他只能將精力集中在NMR的軟件、硬件以及色譜上使用反相柱等來拓展聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用范圍。LC-NMR聯(lián)用技術(shù)采用反相色譜柱，使得這個技術(shù)更復(fù)雜，這是因為：(1)使用多于一種的含質(zhì)子溶劑，會嚴重干擾樣品的分析；(2)如果使用梯度柱，在色譜運行過程中，溶劑在發(fā)生變化；(3)分析物質(zhì)的信號強度與溶劑的信號強度相比太小。1995年，Smallcombedeng[6]克服了上述困難，發(fā)展了溶劑抑制技術(shù)，大大改善了流動和駐流模式LC-NMR技術(shù)的譜圖質(zhì)量。WET(T1效應(yīng)水峰抑制技術(shù))優(yōu)化抑制溶劑產(chǎn)生了高質(zhì)量的1D譜以及2D譜，采用的兩維譜技術(shù)有WET-TOCSY，WET-COSY，WET-NOESY等。

2　LC-NMR

到底是使用NMR還是LC-NMR來分析混合物，取決于色譜分離能力以及NMR的結(jié)構(gòu)分析能力，LC-NMR主要考慮的技術(shù)細節(jié)是NMR的靈敏度，溶劑的相容性、溶劑的抑制、NMR探頭的設(shè)計、色譜峰以及NMR流動池的體積。采用Bruker公司的核磁共振譜儀的LC-NMR聯(lián)用儀器構(gòu)造示意圖[7]如圖1。

2.1NMR靈敏度

相對于MS來說，NMR是一個不靈敏的分析方法，MS分析的檢出限在皮克(pg)數(shù)量級，而現(xiàn)代高場NMR譜儀(400MHz或更高)能檢測得到的信號為納克量級(MW300)。對于結(jié)構(gòu)分析來說，亞毫克量級可以較好地解決，樣品量的下限一般是在幾百納克左右。采用超低溫探頭技術(shù)，NMR的靈敏度可以大大改善，可以檢測到幾納克量級的樣品信號。因為質(zhì)子的高靈敏度、高豐度，以及有機化合物中普遍存在的特點，使得質(zhì)子是NMR分析中最廣泛使用的原子核；相對而言，C-13作為有機化合物的基本骨架結(jié)構(gòu)使它成為另一個較主要的核，但由于其天然豐度較低(1.108%)，只有在目前儀器改進了靈敏度的情況下才成為了一個常規(guī)分析的原子核。F-19，自然界中100%的豐度，但使用相對較少，因為只有大約10%的藥物使用含氟的化合物。NMR所能測試的原子核的種類很多，凡是具有核磁矩的原子核都可以進行測試。

在做NMR譜的時候，信號需要累加的時間取決于樣品量和所測試核的種類，為了獲得較好的信噪比，對于1～10μg的樣品量，一般累加過夜是很正常的。

2.2NMR和色譜相容的溶劑

液體NMR需要氘代試劑，一般將溶劑放置在5mm或3mm的樣品管中，容積相當(dāng)于500μL或150μL，HPLC需要大量的溶劑，這必然大大增加運行成本，D2O是最便宜的氘代試劑，但是價格超過300美元/升；氘代乙氰(CD3CN)的價格取決于D2O的含量，但是也超過1000美元/升。氘代甲醇則更貴，因此使用氘代試劑作為正相溶劑根本承受不了高昂的價格，這就必然要采用反相柱。另外我們必須要考慮的是HPLC梯度柱與NMR操作的相容性，HPLC梯度柱中由于溶劑的相互混和引起磁場的不均勻性大于2～3%/分鐘。

2.3HPLC高濃度溶劑導(dǎo)致的NMR信號抑制

由于LC-NMR運行過程中，溶劑峰的信號強度要大大高于樣品的信號峰強度，我們必須壓制溶劑峰的強度，即使采用氘代試劑，我們也必須抑制溶劑峰。以乙氰為例，CH3或CD3的C-13的兩個衛(wèi)星峰強度要高于樣品的信號峰強度。WET溶劑峰抑制技術(shù)[8]自1995年開發(fā)以來，大大改善了LC-NMR譜的質(zhì)量，而且WET溶劑壓制技術(shù)成為一種常規(guī)技術(shù)。WET溶劑抑制技術(shù)是LC-NMR的標(biāo)準技術(shù)，因為相對與其他抑制技術(shù)如預(yù)飽和或WATERGATE技術(shù)，WET技術(shù)有能力同時抑制幾個溶劑峰，而基線又不受太大的影響；其缺點就是：在溶劑峰附近的樣品峰的強度也會受到相應(yīng)的影響，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)信息的丟失。

2.4NMR流動探頭設(shè)計

常規(guī)NMR流動池的設(shè)計，有效體積為60μL (相當(dāng)于接收線圈的長度)，整個流動池的體積為120μL，這就意味NMR只能“看”60μL的色譜峰，假定HPLC的流動速率為1mL/min，采用4.6mm的柱子，那么只有3.6s的色譜峰能被NMR檢測到，而色譜峰寬一般來說要寬于4s，這是LC-NMR與常規(guī)的3mm NMR探頭相比明顯的缺陷，常規(guī)探頭與色譜峰的寬度是無關(guān)的。

2.5 LC-NMR靈敏度

由于NMR是一個低靈敏的技術(shù)，需要的樣品量在幾個mg范圍，HPLC如果注入如此多的樣品量的話，HPLC柱子會飽和，這將影響色譜的分辨率和分離效果；另一個影響色譜性能的因素是氘代溶劑，因為一般情況下，采用氘代溶劑會使得色譜峰加寬，偶然情況下色譜峰的保留時間還會改變，這是應(yīng)該改進色譜技術(shù)來得到可靠的分辨率的原因，方法之一是降低流速到低于1mL/min來增加LC-NMR的靈敏度，這種情況下，大部分的色譜峰能被NMR看到；但無論如何，上述情況只有在LC體系的泵在低于1mL/min的流速下可以精準控制時才能實施。

2.6LC-NMR操作模式

HPLC與NMR的連接是通過紅色的聚醚酮(PEEK)，由于超屏蔽NMR磁體的屏蔽效應(yīng)，HPLC與磁體的距離可以短至30～50cm，常規(guī)磁體，HPLC與NMR磁體的距離在1.5～2m之間。聯(lián)用時一般使用UV檢測器來監(jiān)測HPLC的運行，放射性或者熒光檢測器也可以用來檢測感興趣的色譜峰。目前HPLC-NMR的主要操作方式：連續(xù)流(continuous flow)方式和駐流(stopped flow)方式，其中駐流方式又分為3種：時間分割(time-sliced)駐流方式、脫機駐流方式和UV-檢測器自動控制NMR取樣方式。

2.6.1 連續(xù)流模式

在HPLC-NMR所使用的操作模式中，連續(xù)流方式是最簡單的一種。在連續(xù)流操作中，HPLC的流動是連續(xù)的，不受NMR 進樣的影響，當(dāng)每一組分由HPLC流經(jīng)NMR檢測池時儀器就會掃描出這個組分的譜圖。使用這種方法可以在很短的時間內(nèi)完成樣品的分析并得到各組分分子結(jié)構(gòu)方面的信息。因此連續(xù)流操作方式在一些要求較快得出檢測結(jié)果的分析中得到了應(yīng)用。連續(xù)流NMR探頭的幾何結(jié)構(gòu)[7]如圖2所示。

Siderman等[8]在1996年首次報道了使用750MHz HPLC-1H NMR采用連續(xù)流操作方式進行同分異構(gòu)體分析，分離2-，3-，4-，氯苯酸葡萄糖苷酸取得了非常理想的效果。Godejohann[9]通過實驗證明了HPLC-NMR的連續(xù)流操作方法在某些實際分析中有良好的定量性能，報道中使用了兩種定量方法來分析環(huán)境樣品中的硝基爆炸殘余物。分析結(jié)果表明標(biāo)準偏差在mg級不超過2%，在檢測限附近小于40%，完全可以滿足環(huán)保定量分析的要求。但是，連續(xù)流操作方式在應(yīng)用上有諸多的限制：首先只能檢測出1H和19F的NMR譜，而目前在生物化學(xué)和藥化研究中很多情況下需要用到31P譜的信息；其次若在操作中HPLC采取梯度流出的方式，則NMR溶劑峰位置會隨溶劑組成而變化，這樣必須準確知道不同組成溶劑峰的位置才能有效地抑制溶劑的NMR信號；再次是流動或連續(xù)流動需要更多的樣品量來在線檢測，因為樣品在NMR探頭中的停留時間很短，在流動速率為1mL/min時停留時間僅為3.6s，這種方式?jīng)Q定了只能收集NMR一維譜，而且只能分析混合物中的含量較高的組分，使用連續(xù)流方式不能夠?qū)Υ郎y組分作NMR二維譜，使結(jié)構(gòu)信息的獲得受到了很大的限制。由于以上的缺陷，連續(xù)流操作方式在很多情況下不能滿足當(dāng)今分析研究的需要。

2.6.2駐流模式

如果待測組分的保留時間已知或可用UV、MS等檢測器有效地檢測到色譜峰的存在，則可以使用駐流操作模式。在駐流操作中，NMR不再隨著色譜的連續(xù)流動對各個峰進行即時掃描，而是通過不同方式對樣品中各組分(或感興趣的組分)進行單個的、較長時間的掃描。目前較常用的駐流方式主要分為三類：時間分割(time-sliced)駐流方式、脫機駐流方式和UV-檢測器自動控制NMR取樣方式。

駐流模式需要進行延遲時間的校正，所謂的延遲時間就是樣品從UV檢測器到NMR流動池(探頭)的時間，當(dāng)然延遲時間受到流動速率以及連接HPLC和NMR流動池的距離的影響。一旦色譜峰進入流動池，色譜即暫停工作，這種方式可以使用更少的樣品量，而且還能作2D-NMR實驗，如WET-COSY,WET-TOCSY以及其他，這種模式樣品可以在NMR探頭中停留幾天；短時間或色譜峰較少的情況下，可以得到一系列色譜峰的詳細信息，而不會發(fā)生色譜柱的擴散以及降低色譜的分辨率(要求在2小時內(nèi)完成NMR實驗)。如果采用低溫探頭，還能進一步提供靈敏度。

R. Singh[10]使用LC-NMR應(yīng)用駐流流動模式進行了下面的化合物在狗和老鼠的尿液代謝產(chǎn)物中的研究(圖3)。

他們所采用的實驗條件是梯度柱5～75% B，0～25min，75～95% B， 25～35min， A：D2O， B：ACN(乙腈)，1mL/min, 235nm, BDS Hypersil C18柱，15cm × 4.6cm, 5μm,即使使用非氘代的乙腈，也能得到較好的NMR峰。

圖4是狗的膽汁和狗的尿液的UV檢測色譜圖，M9保留時間為10min，M11保留時間為21min。M11代謝產(chǎn)物也可以在老鼠的尿中發(fā)現(xiàn)。為了利用NMR分析M9和M11的結(jié)構(gòu)，采用駐流方式，加大注射量，M9的1H- NMR譜(Varian Inova500MHz，帶H-C梯度場反相探頭，流動池體積60ul)顯示1,2,4-三取代苯環(huán)存在。

圖5是利用溶劑抑制技術(shù)對目標(biāo)化合物進行的核磁共振氫譜的測試，但由于溶劑抑制技術(shù)效果不理想，他們應(yīng)用LC-NMR聯(lián)用技術(shù)進行的目標(biāo)化合物的代謝產(chǎn)物實驗不是很成功。于是分別收集樣品，在Varian Unity 400MHz，3mm梯度反相探頭上用兩天的時間收集波譜信號得到NOE圖。

雖然收集的樣品中有很多雜質(zhì)，但是能看到葡萄糖苷酸連接在C-4位，照射亞甲基，I峰從H-2和H-6得到NOE信號。對M11樣品進行LC-MS分析，只是1-(3-氯苯基)哌嗪，1H -NMR譜缺乏獨立的亞甲基峰，也說明該物質(zhì)為1-(3-氯苯基)哌嗪(圖6)。

2003年，M.V. Silva Elipe[11]實驗室還利用LC-NMR研究了分子量較小的放射性的揮發(fā)性代謝物，利用 UV檢測器來標(biāo)定代謝物，實驗證實較少的進樣量，UV檢測器即能分辨出代謝物。Wilson等[12]使用駐流操作方式進行了安替比林的藥物代謝研究。給自愿者服用1g 4-羥安替比林(antipyrine)后，收集其尿液冷凍干燥處理，然后用乙睛/水作流動相，以駐流的操作方式進行HPLC-NMR分析。

駐流操作方式和連續(xù)流方式相比，具有如下優(yōu)點：首先使用駐流方式進行分析，可以長時間對樣品掃描，因此所得譜圖精度高，結(jié)構(gòu)信息較充分；其次即使含量較少的組分也可以通過NMR累加掃描來得到結(jié)構(gòu)信息，從而實現(xiàn)了系統(tǒng)較高的靈敏度，這是連續(xù)流操作方式所不能做到的；最后，使用駐流操作方式可作COSY、TOCSY等二維譜，得到大量通過一維譜不易獲得的結(jié)構(gòu)信息。所以，駐流操作方式是目前應(yīng)用最廣泛的HPLC-NMR操作方式。

2.7其他與NMR技術(shù)聯(lián)用的分離手段

其他色譜技術(shù)也在與NMR進行在線聯(lián)用，例如，尺寸排阻色譜(SEC)與NMR聯(lián)用方法來分析聚合物中的添加劑，固相萃取(SPE)與NMR聯(lián)用進行痕量分析，毛細管電泳與NMR聯(lián)用(CE-NMR)以及毛細管電泳色譜與NMR聯(lián)用(CEC-NMR)分析小樣品量的代謝物。CE-NMR和CEC-NMR采用小體積池帶毛細管分離的NMR探頭，取得了很大的進步，毛細管HPLC(capLC)與NMR聯(lián)用(capLC-NMR)采用了商業(yè)化的微量探頭，這樣分析的樣品量達到了納克的量級。采用該技術(shù)，色譜峰的體積與NMR探頭的流動池的體積相當(dāng)，流動池的體積大約1.5μL，而且比常規(guī)的LC-NMR有更寬的溶劑梯度；capLC-NMR不需濃縮的純化合物，只需分析混合物的柱子，唯一的要求就是樣品必須溶解在5μL或更少的溶劑中。capLC的UV檢測器與NMR流動池之間的延遲時間必須校正，因為不同的色譜條件，不同的溶劑組成，溶液的粘度不同，會影響泵的效率。現(xiàn)在開發(fā)了一種多線圈的探頭，同時采集不同成分的NMR譜，至今為止，可以同時采集4種樣品，以后也許可以同時采集96個樣品，就像LC-MS一樣[5]。

2.8 LC-NMR應(yīng)用

在天然產(chǎn)物領(lǐng)域，LC-NMR廣泛用于分析萃取物中的植物堿和海洋植物堿、類黃酮、倍半萜烯內(nèi)酯、皂石、維生素E同系物以及抗菌成分；在藥物代謝物研究方面，LC-NMR廣泛由于代謝物、極性代謝物或不穩(wěn)定代謝物的指認；最后，LC-NMR還可用于降解產(chǎn)物、藥物雜質(zhì)以及藥物開發(fā)、食品分析等方面。

一般來說，在藥物和藥理分析中樣品的組成是非常復(fù)雜的，如果要得到樣品中組分的明確結(jié)構(gòu)，必須先將各組分很好地分離開在作結(jié)構(gòu)鑒定。HPLC-NMR能夠?qū)⒎蛛x和結(jié)構(gòu)鑒定連為一體，大大簡化了分析過程。因此HPLC-NMR在藥物化學(xué)中得到了相當(dāng)普遍的應(yīng)用，并已經(jīng)被證明是這一領(lǐng)域中最強有力的分析手段之一。Akira[13]利用HPLC-NMR研究了一種新型?；撬嵯嚓P(guān)代謝物的代謝組學(xué)，Spraul[14]報道了使用HPLC-NMR進行藥物代謝研究：將服用了消炎藥布洛芬的實驗者的尿液冷凍干燥處理后，分別使用HPLC-NMR的連續(xù)流和駐流操作方法進行分析，并在駐流操作時使用了二維譜得到代謝產(chǎn)物的明確結(jié)構(gòu)。后來又有人用同樣的方法作了動物尿液中布洛芬第二階段代謝產(chǎn)物的分析。從此HPLC-NMR在藥物化學(xué)特別是在藥物代謝中的應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。

另外，已經(jīng)有人開始把HPLC-NMR方法應(yīng)用于質(zhì)量控制。例如：Pasch等[15]用HPLC-NMR對低聚苯乙烯的構(gòu)型規(guī)整度進行評估，還有用HPLC-NMR監(jiān)測手性合成、控制產(chǎn)物比例[16]等。

3　展望

HPLC-NMR技術(shù)分析復(fù)雜樣品速度快且能得出明確的結(jié)構(gòu)信息，已成為最強有力的分析手段之一。但這種分析手段目前還存在檢出限高，不能分析太大分子等特點，所以目前這一方面發(fā)表的論文數(shù)量不多。預(yù)計今后主要有三個發(fā)展方向：(1)提高NMR儀器的技術(shù)性能。這方面包括使用超高頻的NMR儀器(目前已經(jīng)有900MHz譜儀投入使用)、改進NMR探頭和使用低溫液體冷卻前置放大器，從而大大提高儀器靈敏度，降低檢出限。(2)研究HPLC-NMR-MS技術(shù)。HPLC-MS技術(shù)自從電噴霧電離方法(Electrospray Ionization)的使用以來，已經(jīng)成為一種比較成熟的和強有力的混合物分析手段。如果將MS甚至MS/MS與HPLC-NMR連接，則可能在一次色譜分析中同時得到MS和NMR的信息。國外的一些學(xué)者已經(jīng)在這方面作了一些嘗試并取得了初步的成功。(3)研究CE-NMR技術(shù)。毛細管(CE)和HPLC不同之處在于使用外加壓力來達到分離目的。其分離效率要比HPLC高很多。目前CE-NMR聯(lián)用技術(shù)的主要困難在于CE進樣量比起NMR的檢出限小很多，只有樣品中組分濃度較高時才能體現(xiàn)其靈敏度高的特點。最近有人嘗試用CE-NMR分析納米級的樣品并取得了一定的成功。由于CE在分離性能上的優(yōu)勢，隨著硬件技術(shù)的發(fā)展，CE-NMR很可能會成為一種非常重要的結(jié)構(gòu)鑒定手段。

儀器聯(lián)用技術(shù)增強了化合物結(jié)構(gòu)分析的能力，如今LC-NMR技術(shù)的發(fā)展使之拓展了復(fù)雜混合物的結(jié)構(gòu)分析能力，但是LC-NMR由于其檢測靈敏度偏低，昂貴的氘代試劑、溶劑峰的抑制、色譜峰體積與NMR流動池之間的兼容性等方面的原因，因此是無法與LC-MS相提并論的；為了克服上述缺陷，開發(fā)capLC(毛細管液相色譜)-NMR聯(lián)用技術(shù)，減少溶劑量，色譜峰的體積也與NMR流動池體積兼容，將是LC-NMR聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展方向。

至于采用哪一項聯(lián)用技術(shù)，具體情況具體分析，取決于問題的難度和本質(zhì)，每一項技術(shù)均有它的優(yōu)缺點，要了解它們的優(yōu)缺點，便于我們作出準確的選擇。

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Research progress of LC-NMR technology.

Wu Chunhong1,2

(1.YanshanBranchofBeijingResearchInstituteofchemicalindustry,SINOPEC,Beijing102500,China;2.NationalEngineeringResearchCenterforSynthesisofNovelRubberandPlastic,Beijing102500,China)

This article introduced the development process of LC-NMR including NMR sensitivity and solvent compatibility, solvent peak suppression, NMR probe design, operation modes. And the operation modes of continuous flow and stopped flow were compared.

LC-NMR; continuous flow; stopped flow

吳春紅，分析化學(xué)專業(yè)博士學(xué)位，高級工程師，研究方向是核磁共振波譜分析，E-mail:wuch.bjhy@sinopec.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.001

2015-09-06