李燕淑，李　彥，高配科，代學(xué)成，田會梅，劉雪蓮，?！?，李國強(qiáng)，馬　挺

（1.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071；2.新疆油田實(shí)驗(yàn)檢測研究院，新疆克拉瑪依834000；3.大慶油田責(zé)任有限公司第二采油廠第一作業(yè)區(qū)，黑龍江大慶150000）

枯草芽胞桿菌M15101強(qiáng)化內(nèi)源微生物驅(qū)油模擬實(shí)驗(yàn)

李燕淑1，李彥1，高配科1，代學(xué)成2，田會梅1，劉雪蓮3，常寧3，李國強(qiáng)1，馬挺1

（1.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071；2.新疆油田實(shí)驗(yàn)檢測研究院，新疆克拉瑪依834000；3.大慶油田責(zé)任有限公司第二采油廠第一作業(yè)區(qū)，黑龍江大慶150000）

以分離自油藏環(huán)境的產(chǎn)脂肽枯草芽胞桿菌M15-10-1為研究對象，探究了外源表面活性劑產(chǎn)生菌強(qiáng)化油藏內(nèi)源微生物驅(qū)油過程中的原油乳化分散效果和菌群間的相互作用。配伍性實(shí)驗(yàn)表明，該菌株與油藏常見采油功能菌——迪茨氏菌、紅球菌和腸桿菌具有良好的配伍性。熒光定量PCR和高通量測序分析結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌M15-10-1對內(nèi)源菌群結(jié)構(gòu)無不利影響。搖瓶激活實(shí)驗(yàn)和氣象色譜分析結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌M15101能夠顯著改善內(nèi)源菌群激活初期油相乳化分散效果，促進(jìn)原油降解，為后續(xù)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

枯草芽胞桿菌；生物強(qiáng)化；內(nèi)源微生物；微生物驅(qū)油；原油乳化

油藏是一個缺氧、寡營養(yǎng)的極端環(huán)境，但其中蘊(yùn)含豐富的微生物群落［1-2］。內(nèi)源微生物采油技術(shù)就是通過注入營養(yǎng)劑，激活油藏微生物的生長和代謝，產(chǎn)生生物表面活性劑、生物聚合物、有機(jī)酸和氣體等物質(zhì)，改善原油流動性，提高石油采收率［3-4］。由于油藏的極端環(huán)境，營養(yǎng)物質(zhì)對內(nèi)源微生物的激活需要一個漫長過程，這極大地制約了油藏內(nèi)源微生物的作用效果［5］。如果將營養(yǎng)物質(zhì)和由其他油田分離的高效采油功能菌一同注入油藏儲層中，外源采油功能菌的快速生長和驅(qū)油物質(zhì)的迅速生成是否會對油藏內(nèi)源微生物的激活和代謝產(chǎn)生較大促進(jìn)作用？

據(jù)此，本文中，筆者以分離自油藏環(huán)境的1株產(chǎn)脂肽枯草芽胞桿菌M15-10-1為研究對象，首先探究了該菌株的生長和代謝對油藏常見采油功能菌——紅球菌、迪茨氏菌、腸桿菌的影響，然后將菌株M15-10-1用于強(qiáng)化激活油藏內(nèi)源微生物驅(qū)油實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而從原油乳化分散、原油降解組分和菌群結(jié)構(gòu)變化等角度探究了枯草芽胞桿菌M15-10-1強(qiáng)化激活油藏內(nèi)源微生物的驅(qū)油效果，以期為微生物驅(qū)油現(xiàn)場試驗(yàn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1油水樣采集與分析

實(shí)驗(yàn)所用油水樣采集自新疆陸梁油田中溫水驅(qū)油藏3037采油井。該油藏深度約為1 200 m，地層溫度40℃。地層壓力為10.2 MPa，孔隙度達(dá)29.9%。油水樣的理化性質(zhì)經(jīng)分析，其中氮、磷營養(yǎng)鹽含量極低，分別為12.7和18.1 mg/L，是制約油藏內(nèi)源微生物生長代謝的主要限制性營養(yǎng)因子。

1.1.2菌種

枯草芽胞桿菌M15-10-1分離自大慶油田二廠某區(qū)塊采出液；紅球菌M、迪茨氏菌ZQ-4和腸桿菌T-1來源于筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）:酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）:Na2HPO40.6，KH2PO40.2，NaNO34，CaCl20.01，F(xiàn)eSO40.01，MgSO40.3，酵母粉0.2，pH 7.2；

以上培養(yǎng)基均用蒸餾水配制，調(diào)pH至7.2后121℃滅菌30 min。

激活實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基（g/L）:（NH4）2HPO4·3H2O 2，NaNO34，原油20，葡萄糖、甘油、糖蜜或玉米漿2；pH 7.2。采用產(chǎn)出水配制培養(yǎng)基，不必滅菌。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1枯草芽胞桿菌M15-10-1的鑒定

提取純化菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用27F和1541R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠純化后送至華大基因公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果采用BLAST軟件分析，與GenBank中16S rRNA基因進(jìn)行同源性比對。應(yīng)用MEGA 5.0軟件計(jì)算遺傳距離，通過Neighbor-Joining距離距陣法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖［6］。以基因組DNA為模板，利用srfA F和srfA R引物擴(kuò)增產(chǎn)脂肽基因srfA，利用以上方法建立srfA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

枯草芽胞桿菌M15-10-1強(qiáng)化內(nèi)源微生物驅(qū)油進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)后，使用JK99B型全自動界面張力儀測量表面張力，通過與激活培養(yǎng)前產(chǎn)出水中表面張力大小的對比，進(jìn)一步確定菌株M15-10-1是否可產(chǎn)生表面活性劑——脂肽。

1.2.2油藏微生物群落微環(huán)境的建立

人工模擬枯草芽胞桿菌M15-10-1、紅球菌M、迪茨氏菌ZQ-4、腸桿菌T-1微生物共生菌群。首先制備上述4種菌的種子液，在含有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)4種菌，40℃、180 r/min條件下過夜培養(yǎng)。然后取1 mL菌液接入含有100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h。將4種菌的種子液分別以相同接種量接入含有100 mL LB培養(yǎng)基和100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中。實(shí)驗(yàn)組一:4種菌接種量1 mL；實(shí)驗(yàn)組二:4種菌接種量10 μL；對照組:在LB培養(yǎng)基和BSM培養(yǎng)基中分別單獨(dú)培養(yǎng)枯草芽胞桿菌M15101，接種量為100 μL，每組做2個平行。實(shí)驗(yàn)在40℃條件下振蕩培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)速為120 r/min。分別在8、17、28、72、168、264和336 h保存菌液1 mL。使用磁珠研磨法提取基因組，利用實(shí)時熒光定量PCR方法定量群落豐度。

1.2.3枯草芽胞桿菌M15-10-1強(qiáng)化內(nèi)源微生物驅(qū)油模擬實(shí)驗(yàn)

選用以葡萄糖、甘油、糖蜜和玉米漿為碳源的激活實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)水樣選用陸梁油田3073井的產(chǎn)出水?？莶菅堪麠U菌M15-10-1首先在含2 g/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，然后按5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入含6 g/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將液體離心收集菌體后用等體積不含原油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸制得菌劑。根據(jù)產(chǎn)出水中微生物濃度確定枯草芽胞桿菌M15101的加入量，將菌劑接入含100 mL激活實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，錐形瓶用膠塞封口以保持缺氧環(huán)境，置于40℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)后保存菌液，使用磁珠研磨法提取基因組DNA，以備后續(xù)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)和高通量測序。

1.2.4基因組的提取

基因組提取使用磁珠研磨法。菌液在12 000 r/min條件下離心1 min，沉淀的菌體用600 mL裂解緩沖液懸浮沉淀后加入研磨管，在研磨管中加入0.2 g磁珠。利用研磨機(jī)進(jìn)行研磨，冰浴交替3 min。再加入1 mg/mL溶菌酶50 μL，40℃水浴1 h，之后加入120 μL 100 g/L SDS，65℃水浴1 h。接著使用AxyPrepTM基因組DNA小提試劑盒完成操作。所提基因組保存于-80℃條件下，以便進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5實(shí)時熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)所用引物如表1所示。經(jīng)檢測，枯草芽胞桿菌M15-10-1、紅球菌M、迪茨氏菌ZQ-4和腸桿菌T-1這4對引物具有特異性，只對目的菌具有特異性擴(kuò)增。細(xì)菌分子標(biāo)記16S rRNA基因被用來檢測激活實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中油藏內(nèi)源微生物總菌群豐度，分子標(biāo)記alkB基因用來評估烴降解菌菌群豐度。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線由重組質(zhì)粒建立。將引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化后，連接于T1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的白色單克隆提取質(zhì)粒DNA，測序確定插入片段正確。測定質(zhì)粒DNA濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對不同基因構(gòu)建相對應(yīng)的重組質(zhì)粒［7］。將重組質(zhì)粒梯度稀釋至102～108，以稀釋樣品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV，%）在規(guī)定范圍內(nèi)，且標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的精確度和良好的重復(fù)性。利用此標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，得出最終定量結(jié)果。熒光定量PCR程序在95℃變性2 min，接著94℃反應(yīng)30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行30個循環(huán)。熒光采集在72℃延伸階段進(jìn)行。

表1　實(shí)時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

1.2.6高通量測序

高通量測序樣品提取基因組DNA，采用微生物通用引物515f（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806r（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)（300～350 bp）。PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［8］。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至北京諾禾致源有限公司的Illumina MiSeq平臺上進(jìn)行測序，序列數(shù)據(jù)存儲于National Center for Biotechnology Information。

數(shù)據(jù)分析使用專門進(jìn)行微生物群落分析的QIIME軟件，該軟件用于分析和解釋真菌、病毒、細(xì)菌和古細(xì)菌群落核酸數(shù)據(jù)。利用軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行總體過濾，再利用UPARSE pipeline將序列進(jìn)行聚類分析，OTUs相似度大于97%歸為一類，使用RDP classifier進(jìn)行物種注釋，確定序列對應(yīng)微生物的分類學(xué)地位，用柱狀圖表示每個樣品的構(gòu)成。

1.2.7石油烴組分GC-MC氣質(zhì)色譜分析

參照GB/T 18606—2001《氣相色譜質(zhì)譜法測定沉積物和原油中生物標(biāo)志物》對微生物作用前后的石油烴組分進(jìn)行分析。對于殘油的處理按照文獻(xiàn)所描述方法進(jìn)行［9］。殘余原油經(jīng)氯仿萃取2次后，使用硅膠氧化鋁層析柱將殘油分為飽和烴、芳香烴、瀝青質(zhì)和非烴物質(zhì)。使用Agilent7890-5975c氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行后續(xù)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1枯草芽胞桿菌的鑒定

圖1是枯草芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖1可知，菌株M15-10-1的16S rRNA與枯草芽胞桿菌相似度達(dá)99%。經(jīng)鑒定該菌含有srfA——產(chǎn)脂肽基因，表明菌株M15-10-1是1株含有srfA的枯草芽胞桿菌。

圖1　枯草芽胞桿菌M15-10-1系統(tǒng)發(fā)育分類圖及srfA系統(tǒng)發(fā)育分類圖Fig.1 Phylogenetic relationship based on the 16S rDNA gene and srfA gene sequences between the Bacillus subtilis M15-10-1 strain and related species

通過測定激活前后油水樣的表面張力變化，確定枯草芽胞桿菌M15-10-1可產(chǎn)生表面活性劑——脂肽，結(jié)果如表2所示。由表2可知:產(chǎn)出水經(jīng)過激活培養(yǎng)后，表面張力從60.3 mN/m降至32.9 mN/m，而單獨(dú)發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽胞桿菌M15-10-1，所得發(fā)酵液表面張力經(jīng)測得為29.5 mN/m。由此可知M15-10-1在生長過程中可產(chǎn)生表面活性劑——脂肽。

2.2枯草芽胞桿菌M15-10-1對模擬微生物群落的影響

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:在LB培養(yǎng)基中，對照組中枯草芽胞桿菌M15-10-1的生長曲線與實(shí)驗(yàn)組4種菌混合培養(yǎng)時的生長曲線基本一致，表明菌株M15-10-1的生長不受油藏3種功能菌［10］（紅球菌M、迪茨氏菌ZQ-4［11］和腸桿菌T-1）的影響，且對其他3種菌的生長無抑制效應(yīng)。在BSM培養(yǎng)基中，盡管枯草芽胞桿菌M15-10-1不能利用原油生長，通過圖2可知，在4種菌混合培養(yǎng)時，其菌量有所增加，表明菌株M15-10-1可以利用其他3種菌所產(chǎn)代謝產(chǎn)物生長。4種菌混合培養(yǎng)結(jié)果說明，枯草芽胞桿菌M15-10-1的生長及代謝產(chǎn)物對其他3類油藏功能菌的生長影響甚微，且可利用其他烴降解菌的代謝產(chǎn)物在含油培養(yǎng)基中生長。

表2　激活前后油水樣表面張力變化Table 2 Surface tension change in the water samples stimulated by nutrients or in combination with Bacillus subtilis M15-10-1

圖2　4種典型的采油微生物混合培養(yǎng)生長曲線Fig.2 Growth curves of Bacillus subtilis M15-10-1，Dietzia sp.ZQ-4，Rhodococcus sp.M，and Enterobacter cloacae FY-07

2.3外源菌與營養(yǎng)劑協(xié)同作用對石油乳化和降解的影響

根據(jù)產(chǎn)出水中微生物濃度確定外源菌——枯草芽胞桿菌M15-10-1的加入量為5 g/L（圖3）。由圖3可知:在AG組和BG組中原油乳化效果，以葡萄糖為碳源，可以激活內(nèi)源微生物的生長（AG），但對于提高原油的乳化卻無明顯效果（BG），但當(dāng)加入枯草芽胞桿菌M15-10-1后，能很好地改善原油乳化分散效果（CG）。以玉米漿為碳源的實(shí)驗(yàn)組，不僅可以激活油藏內(nèi)源微生物的生長（AC），還可明顯促進(jìn)石油的乳化分散（BC），但是仍存在原油掛壁現(xiàn)象。加入菌株M15-10-1后（Cc），乳化分散原油效果進(jìn)一步得到改善，油水樣均勻，分層現(xiàn)象消失。該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外加枯草芽胞桿菌M15-10-1能夠有效強(qiáng)化內(nèi)源微生物激活過程中原油的乳化分散。

圖4是利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析原油烴降解組分。由圖4可知:以葡萄糖為碳源（BG）的體系不能有效降解原油烴，枯草芽胞桿菌M15-10-1（CG）的加入起到加速原油烴的降解作用，烴含量明顯減少，且圖3的CG組結(jié)果同樣證實(shí)該作用。而在玉米漿為碳源的條件下，添加營養(yǎng)物質(zhì)（Bc）可達(dá)到原油烴降解的效果，但是枯草芽胞桿菌M15-10-1的加入不僅使脂肪烴明顯降解（Cc），對于姥鮫烷和植烷烴的降解同樣起到促進(jìn)作用，兩者含量下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用油田常用的廉價(jià)碳源玉米漿，結(jié)合外源表面活性劑產(chǎn)生菌—枯草芽胞桿菌M15-10-1的生長和代謝，兩者協(xié)同作用可進(jìn)一步定向激活油藏內(nèi)源菌的生長以及對原油的乳化和降解。

圖3　外源菌強(qiáng)化激活搖瓶實(shí)驗(yàn)Fig.3 Oil emulsification during stimulation with nutrients or in combination

2.4枯草芽胞桿菌M15-10-1對油藏微生物群落的響應(yīng)

以葡萄糖、甘油、糖蜜和玉米漿為碳源的激活實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中菌群實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果如圖5所示。由圖5可知:各實(shí)驗(yàn)組中16S rRNA拷貝數(shù)都達(dá)到108數(shù)量級以上，高于對照組中16S rRNA拷貝數(shù)，表明營養(yǎng)物質(zhì)可以激活油藏內(nèi)源微生物生長［12］。雖然以葡萄糖和甘油為碳源可以激活內(nèi)源微生物生長，但由于該營養(yǎng)不能使內(nèi)源菌產(chǎn)生大量表面活性劑，因此需要外加菌株M15-10-1，利用其生長和代謝作用促進(jìn)原油的乳化。而油田常用廉價(jià)碳源糖蜜和玉米漿，不僅可以激活內(nèi)源微生物生長，加入外源菌枯草芽胞桿菌M15-10-1后，還可增加表面活性劑的產(chǎn)生，進(jìn)一步協(xié)同作用定向加速原油的乳化和降解。并且，枯草芽胞桿菌M15-10-1的加入對內(nèi)源菌的生長也并未產(chǎn)生不利影響。

圖4　激活前后原油氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatography profile of total hydrocarbonduring stimulation with nutrients or in combination

圖5　16S rRNA和alkB熒光定量PCR基因拷貝數(shù)柱狀圖Fig.5 Copy numbers and average copy numbers of 16S rRNA and alkB genes detected in the water samples stimulated by nutrients or in combination

圖6　Lu3073井采出液激活實(shí)驗(yàn)聚類分析圖Fig.6 Clustering and histogram analysis of the microbial communities in Lu3073 water samples stimulated by nutrients or in combination

高通量測序結(jié)果進(jìn)行聚類分析，同樣反映出在不同碳源條件下枯草芽胞桿菌M15-10-1對油藏微生物群落的響應(yīng)。圖6為油藏微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖6可知:不同碳源條件下，微生物菌群多樣性和豐度有差異。與對照組相比，加入營養(yǎng)物質(zhì)（AG、Ag、AC、AM）可激活內(nèi)源微生物生長，使微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性出現(xiàn)變化。在此基礎(chǔ)上，外加原油烴實(shí)驗(yàn)組（BG、Bg、BC、BM）和枯草芽胞桿菌M15-10-1實(shí)驗(yàn)組（CG、Cg、CC、CM）中微生物群落的組成和豐度變化較小。熒光定量PCR反應(yīng)和高通量測序結(jié)果說明枯草芽胞桿菌M15-10-1的生長及代謝所產(chǎn)表面活性劑脂肽對于油藏內(nèi)源微生物無抑制作用。相反地，枯草芽胞桿菌M15-10-1通過其生長和代謝促進(jìn)原油烴的乳化，乳化后的原油可作為碳源與營養(yǎng)物質(zhì)協(xié)同定向激活油藏內(nèi)源微生物，增強(qiáng)對原油乳化和降解作用，有利于提高原油采收率。

3　結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)室條件下，以分離自油藏環(huán)境的產(chǎn)脂肽菌——枯草芽胞桿菌M15-10-1為研究對象，探究了枯草芽胞桿菌M15-10-1強(qiáng)化油藏內(nèi)源微生物驅(qū)油過程中的原油乳化分散效果和菌群間相互作用。配伍性實(shí)驗(yàn)表明，枯草芽胞桿菌M15-10-1可與其他三類內(nèi)源菌共同生長；熒光定量PCR和高通量測序分析表明該菌對內(nèi)源菌群無不利影響；搖瓶激活實(shí)驗(yàn)和氣象色譜分析結(jié)果說明枯草芽胞桿菌M15-10-1能夠顯著改善內(nèi)源菌群激活初期油相乳化分散效果，促進(jìn)原油烴降解，促進(jìn)油藏內(nèi)源烴降解菌的生長。該方法為后續(xù)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Enhancement of indigenous microbial flooding by exogenous Bacillus subtilis

LI Yanshu1，LI Yan1，GAO Peike1，DAI Xuecheng2，TIAN Huimei1，LIU Xuelian3，CHANG Ning3，LI Guoqiang1，MA Ting1
（1.Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology of the Ministry of Education，College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China；2.Institute of Experiment and Detection，Xinjiang Oil Field Company，Karamay 834000，China；3.The 1stWorking District，Second Oil Production Plant，Daqing Oil Field Limited Company，Daqing 150000，China）

We used Bacillus subtilis M15-10-1 as the research object.Bacillus subtilis M15-10-1 is separated from the reservoir environment and can produce lipopeptide.We explored the exogenous surfactant producing bacteria to strengthen endogenous microbial flooding reservoirs in the process of crude oil emulsion dispersion effect and the interaction among bacterial flora.Compatibility experiments showed that Bacillus subtilis M15-10-1 and the oil reservoir functional bacteria，Dietzia sp.ZQ-4，Rhodococcus sp.M，and Enterobacter cloacae T-1 has good compatibility.Fluorescence quantitative PCR and high-throughput sequencing analysis showed that Bacillus subtilis M15-10-1 was the structure of reservoir indigenous microorganism without adverse impact.Activation experiment in laboratory and meteorological chromatography analysis showed that Bacillus subtilis M15-10-1 could significantly improve the oil water activation in early oil phase emulsifying dispersion effect and promote the petroleum hydrocarbon degradation.This method provides the foundation for subsequent field test.

Bacillussubtilis；bio-augmentation；indigenousmicro-organisms；microbialflooding；oil emulsification

TE3

A

1672-3678（2016）03-0046-07

2016-02-04

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2013AA064402）；國家自然科學(xué)基金（41373074）

李燕淑（1991—），女，河北雄縣人，研究方向:石油微生物；馬 挺（聯(lián)系人），教授，E-mail:tingma@nankai.edu.cn