丁月文，　曾麗娟，　李潤(rùn)峰，　王玉濤，　陳俏妍，　楊子峰，　張奉學(xué)

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州　510405；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所，廣東廣州　510230；3.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州　510120）

連花清瘟顆?？购粑篮习《靖腥綛ALB/c小鼠的藥效作用研究

丁月文1，2，曾麗娟1，2，李潤(rùn)峰2，王玉濤2，陳俏妍3，楊子峰2，張奉學(xué)1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所，廣東廣州510230；3.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州510120）

【目的】觀察連花清瘟顆粒體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒（RSV）感染的藥效作用。【方法】采用BALB/c小鼠RSV感染模型，通過(guò)觀察小鼠體質(zhì)量變化、肺病毒滴度、肺內(nèi)炎癥因子mRNA表達(dá)及肺組織病理變化評(píng)價(jià)藥物的體內(nèi)抗病毒藥效?！窘Y(jié)果】連花清瘟顆粒高劑量組可顯著降低RSV感染小鼠肺內(nèi)病毒滴度（P＜0.05）。連花清瘟高、低劑量組可顯著降低RSV感染小鼠肺內(nèi)炎癥因子白細(xì)胞介素IL-6，IL-1β mRNA的表達(dá)量（P＜0.01）；肺組織病理檢查結(jié)果顯示：連花清瘟顆粒高、低各劑量組均可以緩解病毒所致肺組織病理性炎癥?！窘Y(jié)論】連花清瘟顆粒可有效抑制RSV感染小鼠肺內(nèi)病毒滴度，對(duì)小鼠病毒性肺炎具有一定的改善作用。

連花清瘟顆粒/藥理學(xué)；呼吸道合胞病毒；肺/病理學(xué)；基因表達(dá)調(diào)控；疾病模型，動(dòng)物；小鼠

呼吸道合胞病毒（RSV），屬于副黏液病毒科。臨床感染RSV病毒，通常表現(xiàn)為輕微的上呼吸道疾病，但仍有約5%的1歲以下的患兒需要接受住院治療［1］。研究表明：RSV感染主要引起毛細(xì)支氣管病變，也可累及肺泡和支氣管而導(dǎo)致呼吸道合胞病毒肺炎，與嬰幼兒反復(fù)喘息、氣道高反應(yīng)性及哮喘的發(fā)生有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確［2］。目前，批準(zhǔn)使用的抗RSV藥物包括單克隆抗體帕利珠單抗及廣譜抗病毒藥物利巴韋林，兩種藥物都僅限于針對(duì)重癥感染患者或高危人群的治療［3］，在對(duì)兒童病例中使用利巴韋林治療的有效性和安全性依然受到質(zhì)疑［4］。

連花清瘟顆粒，由連翹、金銀花、炙麻黃、板藍(lán)根、貫眾等藥物組成，臨床常用于預(yù)防和治療呼吸道感染所致的相關(guān)疾病，相關(guān)研究證實(shí)它在抗病毒、抗菌以及提高宿主免疫方面有一定的效果［5-6］，在對(duì)治療甲型H1N1流感病毒的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中顯示了良好的治療效果［7］，一些研究還顯示連花清瘟顆粒在抑制肺部炎癥反應(yīng)及提高宿主免疫功能方面有較好的表現(xiàn)［8］。本研究旨在建立呼吸道合胞病毒感染小鼠模型，并初步探討連花清瘟顆粒動(dòng)物體內(nèi)抗RSV病毒作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1藥物連花清瘟顆粒干粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：20150612；陽(yáng)性藥物利巴韋林購(gòu)于廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司，批號(hào)：L071015。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c雌性小鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2003-0002，粵監(jiān)證字2008A023。

1.3病毒株呼吸道合胞病毒（RSV）Long株，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。病毒于HEp-2細(xì)胞上培養(yǎng)擴(kuò)增后，于4℃條件下，8 000 r/min超濾濃縮40 min，濃縮后的病毒在細(xì)胞上測(cè)定其半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50）為10-7.5/mL。

1.4主要試劑與儀器二甲苯（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150313）；無(wú)水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150227）；40 g/L多聚甲醛溶液（中國(guó)GBCBIO公司，批號(hào)：1508GB04）；蘇木素—伊紅染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：715032）；Trizol Reagent（美國(guó) Invitrogen公司）；BT124S賽多利斯電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；EG1150H分體式石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）；RM2245電控進(jìn)樣的手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó) Leica公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；第一鏈合成試劑盒（PrimeScript Rt Master mix，日本TaKaRa公司，批號(hào)：AK3601）；熒光定量PCR試劑盒（Premix Ex Taq，日本TaKaRa公司，批號(hào)：AK2403）。

1.5連花清瘟體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒感染試驗(yàn)

1.5.1動(dòng)物分組將小鼠隨機(jī)分成5組，每組19只，分別為正常組，病毒對(duì)照組（病毒組），利巴韋林組（劑量為45 mg·kg-1·d-1），連花清瘟高劑量組（中藥高劑組，劑量為1 300 mg·kg-1·d-1）、低劑量組（中藥低劑組，劑量為650 mg·kg-1·d-1）。

1.5.2感染造模及給藥除正常對(duì)照組外，各組小鼠在乙醚輕度麻醉下，以擴(kuò)增后的RSV病毒液50 μL滴鼻感染小鼠，正常組采用同法滴入等量DMEM培養(yǎng)基。于感染前2 d開(kāi)始灌胃給藥，2次/d，每次0.2 mL，連續(xù)給藥5 d，正常組及病毒對(duì)照組灌服等量生理鹽水。

1.5.3小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子含量的測(cè)定感染后每天稱(chēng)體質(zhì)量，觀察小鼠反應(yīng)及體質(zhì)量變化情況并做記錄，共觀察10 d。感染后第3天，隨機(jī)選取5只小鼠麻醉后處死，每只小鼠取100 mg鼠肺樣本，放入預(yù)冷的勻漿器中加入液氮進(jìn)行快速研磨；然后將粉末裝入預(yù)冷的管中，每管加入Trizol 1 mL，按照Trizol reagent試劑說(shuō)明書(shū)操作方法提取組織RNA；RNA溶液置于-70℃保存或直接用于后續(xù)操作。核酸紫外分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)稀釋的RNA提取物的值和濃度，判斷RNA純度，計(jì)算濃度。定量1 000 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄程序。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃、15 min；85℃、5 s；4℃Forever。將所得的cDNA與下列物質(zhì)加入Ep管中混勻，進(jìn)行Real-Time PCR程序。Real-Time PCR體系（20 μL）：Mix 10 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、探針 0.2 μL、Rox II 0.2 μL、H2O 7.2 μL、cDNA模板 2 μL。Real-Time PCR擴(kuò)增條件：95℃、30 s→95℃、5 s→60℃、40 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用相對(duì)定量法分析結(jié)果。采用相對(duì)定量2-△△Ct法［9］計(jì)算各個(gè)樣本目的基因的表達(dá)變化。小鼠趨化因子（KC）、干擾素β（IFN-β）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）及內(nèi)參基因GAPDH引物探針序列見(jiàn)表1。

1.5.4小鼠肺指數(shù)，肺病毒滴度測(cè)定感染后第4天，隨機(jī)選取7只小鼠麻醉后處死，解剖觀察肺部病變，并稱(chēng)量肺質(zhì)量，測(cè)定其肺指數(shù)：p肺指數(shù)= mlung/mbody×100%。鼠肺稱(chēng)重后，取右肺于冰上勻漿制成肺勻漿液。于12 000 r/min，4℃離心5 min，收集上清液并于MDCK細(xì)胞上測(cè)定其病毒滴度。

1.5.5肺組織病理檢查上述小鼠稱(chēng)量肺質(zhì)量后，取左肺，肉眼觀察并記錄肺組織大體病變情況；在生理鹽水中漂洗后吸干，浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定24 h；常規(guī)病理組織脫水后，包埋切片并進(jìn)行蘇木素—伊紅（HE）染色，鏡下檢查肺病理變化情況。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析、t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　各基因qPCR引物探針序列Table 1　Primer sequence of various genes for qPCR

2　結(jié)果

2.1各組小鼠體質(zhì)量變化圖1結(jié)果顯示：病毒組于感染后第2天出現(xiàn)體質(zhì)量下降，最低下降幅度為原體質(zhì)量10%，并于第9天開(kāi)始體質(zhì)量回升；連花清瘟高、低劑量組于感染后2、3 d出現(xiàn)體質(zhì)量下降，并于第5天回升，利巴韋林組小鼠無(wú)明顯體質(zhì)量減輕。

圖1　各組小鼠每日體質(zhì)量變化Figure 1　Changes of daily body mass of mice in various groups?。ā纒，N=3）

2.2各組小鼠肺勻漿中病毒滴度的測(cè)定圖2結(jié)果顯示：感染后第4天，測(cè)定病毒組小鼠肺勻漿中病毒滴度均值為T(mén)CID50=10-4.7，與病毒組比較，連花清瘟高劑量組小鼠肺勻漿中病毒滴度顯著降低（P＜0.05），低劑量組病毒滴度無(wú)顯著降低（P＞0.05）。

圖2　各組小鼠肺病毒滴度Figure 2 Comparison of lung viral titer in mice of various groups?。ā纒，N=5）

2.3各組小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的測(cè)定圖3結(jié)果顯示，感染后第3天，與病毒組比較，中藥高劑量組IL－1β、IL－6表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.01），中藥低劑量組IL－6表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.01）。中藥各劑量組TNF-α、KC mRNA表達(dá)量與病毒組比較無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

圖3　各組小鼠肺組織細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量比較Figure 3　Comparison of cytokine mRNA expression in mouse lung tissues of various groups（±s，N=5）

2.4各組小鼠肺組織形態(tài)的改變圖 4結(jié)果顯示：正常組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形態(tài)完整，無(wú)炎性細(xì)胞。病毒組可見(jiàn)肺泡內(nèi)炎性滲出，肺間質(zhì)增寬，肺泡壁增厚，細(xì)支氣管及肺血管壁增厚。利巴韋林組可見(jiàn)肺泡內(nèi)炎性滲出物明顯減少，與正常組相近。中藥高劑量組肺泡壁有所增厚，肺泡浸潤(rùn)不明顯，較病毒組肺泡浸潤(rùn)面積明顯減少。中藥低劑量組肺部具有少量肺泡出現(xiàn)病變，較病毒組炎性病變明顯減少，部分區(qū)域可見(jiàn)浸潤(rùn)及炎性病變。

圖4　各組小鼠肺組織病理檢查結(jié)果（HE染色）Figure 4　Histopathological changes in lung tissue of mice in various groups（by HE staining）

3　討論

針對(duì)RSV的模型研究十分廣泛，目前已知可用于實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物模型包括猩猩、狒狒、雪貂、棉鼠、羊、豚鼠和小鼠等，各模型均有其優(yōu)勢(shì)和局限，RSV感染除在猩猩、狒狒等可觀察到臨床癥狀外，其他均表現(xiàn)為隱性感染。小鼠模型因其易獲得，遺傳背景清楚而均一，基因改造技術(shù)成熟，且已有多種商品化試劑，仍是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［10］。但小鼠不是RSV自然宿主。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BALB/c鼠感染RSV沒(méi)有穩(wěn)定的臨床癥狀，肺內(nèi)病毒復(fù)制水平相對(duì)低，病毒清除快，宿主炎癥反應(yīng)不明顯，限制了藥物治療效果的觀察。因此，增強(qiáng)小鼠RSV易感性才能獲得高水平病毒滴度的理想動(dòng)物模型。

一些研究嘗試感染RSV同時(shí)聯(lián)合使用免疫抑制劑，模擬免疫缺陷條件下的病毒感染，可以獲得有效的小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制［11］，但這種模型條件下，無(wú)法模擬病毒感染后的正常的宿主免疫調(diào)節(jié)，RSV感染所致的末梢氣管病變亦不明顯，故不適于模擬病毒感染所致的疾病發(fā)展過(guò)程。本研究通過(guò)使用濃縮后的高滴度RSV感染，誘發(fā)下呼吸道病毒感染。從病理結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，感染后第4天，病毒組可出現(xiàn)較明顯的炎性滲出，肺間質(zhì)增寬，細(xì)支氣管及肺血管壁增厚，與第4天較高的肺內(nèi)病毒復(fù)制相吻合，從而使炎癥RSV在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制并激發(fā)宿主炎癥反應(yīng)。

RSV感染后可以通過(guò)多種渠道引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，其機(jī)制仍不明確。目前公認(rèn)的機(jī)制是RSV感染與宿主固有免疫識(shí)別受體（PRRs）有關(guān)，這些識(shí)別受體能識(shí)別和啟動(dòng)病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的天然免疫應(yīng)答［12］。宿主通過(guò)Toll樣受體（TLRs）信號(hào)介導(dǎo)的抗病毒免疫機(jī)制清除感染的RSV，在這個(gè)過(guò)程中，從機(jī)體急性炎癥轉(zhuǎn)變成慢性炎癥并導(dǎo)致持續(xù)的組織損傷。RSV感染后，TLRs不僅可以識(shí)別病毒F蛋白，同時(shí)可以識(shí)別病毒其他部分，如dsRNA（TLR3）或ssRNA（TLR7/8）等，從而活化TLR表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)下游細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、KC的表達(dá)［13-14］。本研究中病毒感染第3天后，可見(jiàn)相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的表達(dá)明顯升高，而觀察連花清瘟組對(duì)RSV感染的治療效果可以發(fā)現(xiàn)，中藥高劑量組在有效抑制病毒復(fù)制的同時(shí)，也降低了肺內(nèi)促炎因子的表達(dá)。進(jìn)一步的肺組織病理檢查結(jié)果顯示：連花清瘟組肺組織病理炎癥性改變較病毒對(duì)照組有一定程度的減輕，肺泡浸潤(rùn)面積明顯減少，細(xì)支氣管及肺血管壁增厚減輕，表明連花清瘟藥物對(duì)RSV所致病毒性肺炎具有一定的抑制作用。本研究結(jié)果表明連花清瘟顆粒在小鼠體內(nèi)有一定的抗RSV藥效作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)擬在針對(duì)病毒感染所致的相關(guān)炎癥及信號(hào)通路及藥物干預(yù)病毒的具體靶點(diǎn)做更深入的研究，以期闡明連花清瘟抗RSV病毒的藥理機(jī)理及作用特點(diǎn)。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Pharmacological Action of Lianhua Qingwen Granules on BALB/c Mice Infected with Respiratory Syncytial Virus

DING Yuewen1，2，ZENG Lijuan1，2，LI Runfeng2，WANG Yutao2，CHEN Qiaoyan3，YANG Zifeng2，ZHANG Fengxue1
（1.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.Guangzhou Institute of Respiratory Disease，State Key Laboratory of Respiratory Diseases，the First Affiliated Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510230 Guangdong，China；3.Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120 Guangdong，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of Lianhua Qingwen Granules（LQG）on respiratory syncytial virus（RSV）infection in vivo.Methods BALB/c mouse model of RSV infection was established.The mouse body mass，lung viral titer，mRNA expression of inflammatory cytokines，and pulmonary histopathological changes were observed to study the pharmacological action of LQG.Results Lung viral titers in mice infected with RSV were decreased in high-dose LQG group（P＜0.05）.Interleukin（IL）-6 and IL-1β mRNA expression levels of mice infected with RSV were also decreased in high-and low-dose LQG groups（P＜0.01）.The pulmonary histopathological examination results showed that RSV-induced inflammation was relieved in high-and low-dose LQG groups.Conclusion LQG can suppress lung viral titers in mice infected with RSV，and relieve viral pneumonia in mice.

Lianhua Qingwen Granules/pharmacology；respiratory syncytial virus；lung/pathology；gene expression regulation；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0540-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.023

2016-03-08

丁月文（1990-），男，在讀碩士研究生；E-mail：dingyw2011@163.com

張奉學(xué)（1962-），男，博士研究生，研究員；E-mail：zhangfengxue@gzucm.edu.cn。楊子峰（1977-），男，博士研究生，副教授；E-mail：Jeffyah@163.com

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013B051000085）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201400000002、2014Y2-00031）