楊　洋，徐　燕，孟明理，汪　晨，王　敬，王曉靜，周永敏，沈繼龍

牙齦卟啉單胞菌對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞活性、炎性因子與骨代謝基因表達(dá)的影響研究

楊洋1，徐燕1，孟明理1，汪晨1，王敬1，王曉靜1，周永敏1，沈繼龍2

目的 探討牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）活菌感染牙周膜成纖維細(xì)胞（PDLF）后對(duì)細(xì)胞活性、炎性因子和骨代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法 P.gingivalis活菌分別以109、108、107、106、105CFU/ml濃度感染PDLF 6 h，檢測(cè)細(xì)胞活性和白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、RANKL、骨保護(hù)素（OPG）的基因表達(dá)。結(jié)果P. gingivalis攻擊PDLF 6 h后，細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，P.gingivalis濃度分別達(dá)到108CFU/ml和107CFU/ml時(shí)，IL-6和IL-8基因表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），P.gingivalis濃度達(dá)到109CFU/ml時(shí)，IL-1β、TNF-α基因表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組OPG基因表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），RANKL基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 P.gingivalis活菌感染PDLF后，可產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，參與牙周組織的破壞與改建。

牙齦卟啉單胞菌；牙周膜成纖維細(xì)胞；細(xì)胞因子；破骨細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.012.html

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是慢性牙周炎的主要致病菌，含有一系列的毒力因子。其中脂多糖、菌毛、牙齦素等是P.gingivalis表面最重要的致病因子。脂多糖可刺激巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，牙齦素可通過(guò)大量的蛋白水解活動(dòng)侵襲破壞宿主組織。P.gingivalis可侵入宿主細(xì)胞、抵抗宿主先天性免疫系統(tǒng)、分泌大量毒力因子、引發(fā)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致牙周組織的破壞［1］。牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLF）是牙周膜中最主要的細(xì)胞［2］，對(duì)于牙周炎的發(fā)生發(fā)展以及組織修復(fù)和改建具有重要作用。炎癥狀態(tài)下，PDLF可表達(dá)細(xì)胞因子并與破骨前體細(xì)胞表面的受體連接進(jìn)而刺激其向破骨細(xì)胞分化［3］。該研究旨在觀察P.gingivalis體外對(duì)PDLF的攻擊，探討P.gingivalis對(duì)PDLF活性、細(xì)胞因子和骨代謝的基因表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步研究P.gingivalis對(duì)PDLF的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料和試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；臺(tái)盼藍(lán)（美國(guó)Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；P.gingivalis（ATCC33277，本課題組平行實(shí)驗(yàn)贈(zèng)予）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-7504（上海欣茂儀器有限公司）；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）。

1.2PDLF的分離培養(yǎng)取 12～22歲因正畸減數(shù)拔除的健康前磨牙，運(yùn)用組織塊法用刀片刮取根中1/3部位的牙周膜，將組織塊置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)［2］。

1.3P.gingivalis活菌體外感染PDLF 取第3～4代PDLF，胰酶消化離散細(xì)胞，含10%FBS的DMEM重懸，以2×105/ml密度接種于6孔板（每孔2 ml），培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁，換不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合，分為6組（5組實(shí)驗(yàn)組，1組對(duì)照組）。將P.gingivalis用PBS重懸，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量濃度，調(diào)整至109CFU/ml，當(dāng)光密度（optical density，OD）值OD660=0.8時(shí)，細(xì)菌濃度為109CFU/ml［4］，1 000 r/min離心5 min后加入等量不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸。將含P.gingivalis的DMEM培養(yǎng)基稀釋制成不同濃度：109、108、107、106、105CFU/ml，分別加入PDLF中培養(yǎng)6 h，對(duì)照組PDLF以等量DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間［5］，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性 參考文獻(xiàn)［6］報(bào)道，采用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性。取第3～4代PDLF，胰酶消化，以1×105/ml接種于24孔板中，待細(xì)胞匯合，P.gingivalis活菌感染6 h后，PBS沖洗3次，胰酶消化，加等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。取10 μl細(xì)胞懸液與10 μl 0.2%臺(tái)盼藍(lán)染液混合，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活率。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè) 分別取P.gingivalis活菌體外感染6 h后的PDLF，加入TRIzol裂解細(xì)胞，Ex TaqTMⅡ反應(yīng)體系測(cè)定白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、RANKL和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的mRNA表達(dá)。95℃預(yù)變性10 min，95℃、30 s，58℃、1 min，72℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)［7］。實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1，引物由生工生物工程上海有限公司和寶生物工程（大連）有限公司合成，以β-actin為內(nèi)參，其他各基因產(chǎn)物分別與相應(yīng)β-actin產(chǎn)物作比較，所得比值為相關(guān)基因mRNA的相對(duì)水平。

表1　炎性因子和骨代謝基因表達(dá)的相關(guān)引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1P.gingivalis活菌感染PDLF后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 接種P.gingivalis活菌6 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形。當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到109CFU/ml時(shí)，肉眼觀察可見(jiàn)培養(yǎng)基渾濁，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞膜不完整，胞核不清晰。見(jiàn)圖1。

圖1　109CFU/ml P.gingivalis感染PDLF 6 h后于倒置相差顯微鏡下觀察 ×200

2.2臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性 與對(duì)照組比較，P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，細(xì)胞活率均下降，隨著細(xì)菌濃度的升高，細(xì)胞活率逐漸下降，109、108、107、106、105CFU/ml及對(duì)照組的細(xì)胞活率分別為（75.5±2.55）%、（76.2±9.98）%、（78.0± 7.77）%、（78.8±4.95）%、（79.9±4.61）%、（91.9 ±6.27）%，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 2.595，P＞0.05）。

2.3實(shí)時(shí)定量qRT-PCR法檢測(cè)P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后的mRNA表達(dá) 采用qRT-PCR法檢測(cè)P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后IL-6、IL-8、OPG、RANKL、IL-1β、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果顯示P.gingivalis活菌濃度從105CFU/ml升高至109CFU/ml，促炎細(xì)胞因子IL-6（圖2A）、IL-1β（圖2B）、TNF-α（圖2D）和RANKL（圖2E）的mRNA表達(dá)呈相對(duì)升高趨勢(shì)。P.gingivalis濃度達(dá)到108CFU/ml時(shí)，IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.960，P＜0.01），P.gingivalis濃度達(dá)到109CFU/ml時(shí)，IL-1β、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.021、6.537，P＜0.01）。P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后趨化因子IL-8（圖2C）的mRNA相對(duì)表達(dá)量相對(duì)升高，當(dāng)P.gingivalis活菌濃度達(dá)到107CFU/ml時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 128.297，P＜0.01）。此外，P.gingivalis活菌濃度從105CFU/ml升高至109CFU/ml，RANKL的mRNA表達(dá)亦呈升高趨勢(shì)，于108CFU/ml濃度下相對(duì)表達(dá)量最高，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 5.082，P＞0.05）。P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后所有實(shí)驗(yàn)組OPG（圖2F）的mRNA表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.839，P＜0.01），當(dāng)P.gingivalis活菌濃度為109CFU/ml時(shí)，OPG的mRNA相對(duì)表達(dá)量最低。

3　討論

近年來(lái)關(guān)于P.gingivalis活菌及其各毒力因子感染機(jī)體細(xì)胞的研究日益增多。作為牙周炎的主要致病菌之一，探討P.gingivalis活菌對(duì)牙周組織細(xì)胞的作用對(duì)于研究牙周炎的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，細(xì)胞活率雖然有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與P.gingivalis活菌不同，分別用脂多糖或者高溫滅活后的P.gingivalis感染牙齦上皮細(xì)胞，可誘發(fā)程序性細(xì)胞死亡，但是含有大量P.gingivalis的牙齦上皮細(xì)胞并未發(fā)生程序性細(xì)胞死亡或者壞死，其原因在于P.gingivalis活菌可通過(guò)內(nèi)源性信號(hào)通路抑制牙齦上皮細(xì)胞程序性死亡［8］。由此推測(cè)，P.gingivalis活菌侵入PDLF中，可抑制細(xì)胞程序性死亡，進(jìn)而逃避宿主免疫防御機(jī)制，從而使自身能在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存留，引發(fā)深層感染。

單純的牙周致病菌存在并不是導(dǎo)致牙周組織破壞的唯一原因［9］，宿主對(duì)菌斑生物膜的免疫炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致牙周軟硬組織破壞的主要原因［10］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和趨化因子IL-8的基因表達(dá)。當(dāng)P.gingivalis活菌濃度達(dá)到108CFU/ml和107CFU/ml時(shí)，IL-6和IL-8的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于P.gingivalis脂多糖和P.gingivalis產(chǎn)生的硫化氫氣體均可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)，同時(shí)二者還能協(xié)同促進(jìn)牙周膜細(xì)胞IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)［11］，故而推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中IL-6、IL-8基因表達(dá)的升高可能是P.gingivalis活菌表面的毒力因子（如脂多糖）以及其產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物（如硫化氫氣體）共同作用的結(jié)果。當(dāng)P.gingivalis活菌濃度達(dá)到109CFU/ml時(shí)，IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kato et al［12］發(fā)現(xiàn)P.gingivalis脂多糖可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-1β的產(chǎn)生。研究［13］表明利用P.gingivalis超聲提取物作用肝癌細(xì)胞系Hepa-1.6 6 h后，細(xì)胞的TNF-α的mRNA亦升高。P.gingivalis屬口腔正常菌群，達(dá)到一定的數(shù)量可成為致病優(yōu)勢(shì)菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示炎性因子相對(duì)表達(dá)量的多少可能與P.gingivalis活菌的濃度有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，RANKL的mRNA相對(duì)表達(dá)量雖有升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而所有實(shí)驗(yàn)組OPG的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Scheres et al［5］以108CFU/ml的P.gingivalis活菌攻擊PDLF 6 h后，RANKL的mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RANKL/OPG是一對(duì)與牙槽骨吸收和改建密切相關(guān)的細(xì)胞因子。RANKL是破骨生成的關(guān)鍵因子，可與核因子κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、活化和成熟。OPG可作為誘騙受體與RANKL結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)，抑制破骨細(xì)胞的分化和活化并促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，是破骨細(xì)胞生成的負(fù)相調(diào)節(jié)因子［14］。由此推測(cè)P.gingivalis感染6 h內(nèi)，PDLF可通過(guò)下調(diào)OPG的基因表達(dá)參與骨代謝的調(diào)控。

圖2　P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、RANKL、OPG的mRNA表達(dá)A：IL-6 mRNA；B：IL-1β mRNA；C：IL-8 mRNA；D：TNF-α mRNA；E：RANKL mRNA；F：OPG mRNA；與對(duì)照組比較：**P＜0.01

綜上所述，PDLF可在P.gingivalis感染后產(chǎn)生一系列不同的細(xì)胞因子，參與牙周組織的破壞與改建。PDLF在牙周炎的炎性與骨代謝相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生中具有重要的作用。但是PDLF產(chǎn)生這些細(xì)胞因子的具體機(jī)制，如何調(diào)控其基因表達(dá)使其產(chǎn)生更有利于牙周組織修復(fù)與改建的細(xì)胞因子尚需進(jìn)一步研究。

［1］ 張 宇，艾麗思，林 莉.牙齦卟啉單胞菌菌體表面毒力因子及其致病性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2015，8（1）：43-7.

［2］ 徐 燕，李 頌，程繼光，等.人牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和生物學(xué)特征［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2002，18（6）：375-7.

［3］ Sokos D，Everts V，de Vries T J.Role of periodontal ligament fibroblasts in osteoclastogenesis：a review［J］.J Periodontal Res，2014，50（2）：152-9.

［4］ Koizumi Y，Kurita-Ochiai T，Oguchi S，et al.Nasal immunization with Porphyromonas gingivalis outer membrane protein decreases P.gingivalis-induced atherosclerosis and inflammation in spontaneously hyperlipidemic mice［J］.Infect Immun，2008，76（7）：2958-65.

［5］ Scheres N，Laine M L，de Vries T J，et al.Gingival and periodontal ligament fibroblasts differ in their inflammatory response to viable Porphyromonas gingivalis［J］.J Periodontal Res，2010，45（2）：262-70.

［6］ Yee M，Kim A，Alpagot T，et al.Porphyromonas gingivalis stimulates IL-18 secretion in human monocytic THP-1 cells［J］.Microbes Infect，2012，14（9）：684-9.

［7］ 趙晶蕾，江凌勇，毛麗霞，等.人牙周膜干細(xì)胞成骨相誘導(dǎo)后相關(guān)基因的表達(dá)變化［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)，2014，23（4）：391 -6.

［8］ 潘亞萍，劉靜波.牙齦卟啉單胞菌研究進(jìn)展［J］.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，38（2）：125-7.

［9］ Yamamoto T，Kita M，Oseko F，et al.Cytokine production in human periodontal ligament cells stimulated with Porphyromonas gingivalis［J］.J Periodontal Res，2006，41（6）：554-9.

［10］Xu Y，Wei W.A comparative study of systemic subantimicrobial and topical treatment of minocycline in experimental periodontitis of rats［J］.Arch Oral Biol，2006，51（9）：794-803.

［11］Chi X P，Ouyang X Y，Wang Y X.Hydrogen sulfide synergistically upregulates Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide-induced expression of IL-6 and IL-8 via NF-κB signalling in periodontal fibroblasts［J］.Arch Oral Biol，2014，59（9）：954-61.

［12］Kato H，Taguchi Y，Tominaga K，et al.Porphyromonas gingivalis LPS inhibits osteoblastic differentiation and promotes pro-inflammatory cytokine production in human periodontal ligament stem cells［J］.Arch Oral Biol，2014，59（2）：167-75.

［13］Takano M，Sugano N，Mochizuki S，et al.Hepatocytes produce tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 in response to Porphyromonas gingivalis［J］.J Periodontal Res，2012，47（1）：89-94.

［14］李 鵬，夏 琳，扈英偉，等.免疫反應(yīng)在牙周病牙槽骨吸收中的作用［J］.北京口腔醫(yī)學(xué)，2013，21（5）：295-7.

Effects of viable Porphyromonas gingivalis on the viability and gene expression of inflammatory cytokines and bone metabolism of periodontal ligament fibroblasts

Yang Yang，Xu Yan，Meng Mingli，et al
（Stomatologic College of Anhui Medical University，The Affiliated Stomatologic Hospital of Anhui Medical University，Key Lab.of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To study the cell viability and gene expression of inflammatory cytokines and bone metabolism of periodontal ligament fibroblasts（PDLF）upon challenge by viable Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）. Methods Human PDLF was challenged in vitro by viable P.gingivalis for 6 hours and then the cell viability and gene expression of inflammatory cytokines such as IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α，RANKL，OPG were analyzed.Results No obvious change in cell viability was observed before and after challenged by viable P.gingivalis.The expressions of both IL-6 and IL-8 were strongly induced when the concentration of viable P.gingivalis was 108CFU/ ml and 107CFU/ml.The expression of IL-1β and TNF-α also increased significantly when the concentration of viable P.gingivalis was 109CFU/ml.The expression of OPG was suppressed significantly by P.gingivalisin in PDLF while the gene expression of RANKL remained unchanged.Conclusion When challenged by P.gingivalis，PDLF participates in the regeneration and remodeling of periodontal tissue by producing cytokines.

Porphyromonas gingivalis；periodontal ligament fibroblasts；cytokines；osteoclast

R 780.2

A

1000-1492（2016）06-0786-05

2016-04-01接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085MKL28）

1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230032

楊 洋，女，碩士研究生；徐 燕，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：173236344@qq.com