李成恩，郝　建，，李樹雯，馬宏昊，錢　鈞，李魯歡，賀慧博，黃　鑫

烏司他丁對爆炸致家兔急性肺損傷的作用及機制

李成恩1，郝建1，2，李樹雯2，馬宏昊3，錢鈞2，李魯歡2，賀慧博1，黃鑫1

目的 探討烏司他?。║TI）對爆炸致家兔急性肺損傷（ALI）的作用及其機制。方法 選擇家兔40只，隨機分為5組：正常組、ALI組和UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組，每組8只，建立家兔ALI動物模型后，UTI低、中、高劑量組分別注射2.5×104、5×104、10×104U/kg UTI溶液，正常組、ALI組注射等量生理鹽水。4 h采集血液，24 h采集支氣管肺泡灌洗液（BALF）、血液及肺組織標本，并測定肺濕干重比（W/D），ELISA法測定BALF及血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的含量，Western blot法和反轉錄PCR法測定肺組織核轉錄因子-κB（NF-κB）蛋白和mRNA的表達水平，光鏡下觀察肺HE切片病理學變化。結果 ALI組W/D、TNF-α、IL-6以及NF-κB表達量均較正常組升高（P＜0.05），UTI低、中、高劑量組的W/D、TNF-α、IL-6表達量均較ALI組降低（P＜0.05），UTI低、中、高劑量組IL-10表達量較ALI組明顯提高（P＜0.05），且三次比較中，均以UTI高劑量組作用最顯著（P＜0.05）；肺病理切片顯示UTI中、高劑量組肺水腫、炎癥反應等較ALI組減輕。結論 UTI可通過調控炎癥反應時細胞因子的產生和釋放，減輕爆炸致家兔ALI的肺部損傷程度，以高劑量作用最明顯，UTI可能成為一個潛在的治療ALI的藥物。

爆炸；急性肺損傷；烏司他??；核轉錄因子-κB

網絡出版時間：2016-5-9 15：43：10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.016.html

隨著我國工業(yè)化進程的加快，易燃易爆物品的需求越來越大，在其運輸、儲存及使用過程中，爆炸事件多有發(fā)生。2015年1～2月份國內發(fā)生各種安全事件約122起，其中爆炸事件占3.28%［1］，以及2015年的8·12天津爆炸事件，這些爆炸事件均給人民的生產、生活、生命安全造成了巨大損傷。在急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的臨床救治中，其死亡率一直居高不下，這已成為一個世界性醫(yī)學難題，如美國每年約有190 600例ALI患者，74 500例死亡［2］。ALI是指心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性、低氧性呼吸衰竭。炎癥細胞的激活、細胞因子的釋放、肺內失控性炎癥反應等是ALI的重要發(fā)病機制。肺為含氣-液交界面的臟器，爆炸產生的沖擊波、有害氣體、高溫等因素極易造成肺實質、間質的損傷，進而引起多種炎癥細胞的激活、炎性介質的釋放、血管通透性的增高等，進而造成ALI。研究［3］顯示蛋白酶抑制劑可有效減輕全氟異丁烯引起的ALI，而作為一種廣譜蛋白酶抑制劑，UTI可抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥介質的過度釋放、抑制凋亡等作用［4-6］。該研究以爆炸致家兔ALI模型為研究對象，觀察烏司他丁（Ulinastatin，UTI）對ALI的作用效果，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與主要器材 普通級家兔40只，雌雄各半，重（2.25±0.25）kg，購自安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司，動物實驗前適應性喂養(yǎng)1～2 d，自由飲食飲水。UTI購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；兔ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒（批號00145205）、熒光定量PCR儀（PIKOREAL96）購自美國Thermo公司；TRIzol試劑（批號14105）購自美國Invitrogen公司；核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）Western blot試劑盒（批號148G3026）購自美國Sigma公司；山羊抗兔IgG（批號109525）、山羊抗小鼠IgG（批號109145）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；引物合成由美國Invitrogen公司提供。

1.2ALI動物模型建立 家兔40只，隨機分為正常組、ALI組、UTI低劑量（2.5×104U/kg）組、UTI中劑量（5×104U/kg）組、UTI高劑量（10×104U/ kg）組［7］，每組8只，動物實驗前禁食12 h、禁水4 h，胸部脫毛以避免兔毛對沖擊波強度的影響，兔耳塞入脫脂棉球，雙耳部備皮，用于抽血、注射。家兔固定在自制鋼質保護箱中，保護箱在兔胸部處開一窗口，窗口大小與兔子胸部一致，且可調節(jié)。其余部位如頭部、腹部、四肢等均保護在箱體內，將家兔保護箱放置于空中爆炸容器內并固定。爆源采用工業(yè)炸藥，炸藥制成重為35 g的球形藥包，爆心距為35 cm，炸藥采用標準8號雷管引爆，同時保證家兔胸部中心、藥包中心與空中壓力傳感器位于同一水平線上。傳感器距離藥包35 cm，用于記錄測點處壓力時程曲線，爆炸實驗操作全部由專業(yè)人員實施［8］。爆炸后爆炸容器內立即進行排風換氣，迅速取出實驗樣本至通風環(huán)境下，并實施臨時簡單的搶救：動物致傷后，立刻檢查并縫合胸壁破口，吸引器清除呼吸道分泌物，保持呼吸道通暢，胸腔穿刺排氣，靜推平衡鹽溶液，動物改為側臥位，注意動物的保暖，并記錄呼吸、精神狀態(tài)、應激反應、死亡率等情況。造模完成后，UTI低、中、高劑量組注射相應劑量的UTI，正常組、ALI組注射等量生理鹽水。

1.3測定血清中TNF-α、IL-6、IL-10 水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉后，于4、24 h點取靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min（室溫）后，取上清液，于-80℃冰箱保存。按照ELISA說明書測定。

1.4測定肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中TNF-α、IL-6、IL-10含量 麻醉固定家兔，切開胸腔，分離、剔除肺外組織，游離氣管及雙側肺葉，結扎右肺，使用自制灌洗針插入左主支氣管，固定后，用37℃生理鹽水10 ml注入左肺，靜置30 s后，反復抽吸3次，回收BALF約6 ml，3 000 r/ min離心10 min（室溫），取上清液存于-80℃冰箱。按照ELISA說明書測定。

1.5肺濕干重比測定 取右肺中葉，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱濕重。將濕肺置于80℃烤箱內72 h，至組織完全脫水，稱干重。計算肺濕干重比（W/D），W/D=濕肺重（g）/干肺重（g）。

1.6Western blot法測定NF-κB p65 取肺組織，稱重，加入RIPA細胞裂解液1 ml進行裂解，12 000 r/min離心10 min（室溫）后，收集上清液，即含有目的蛋白。經過電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟后，得到蛋白條帶；實驗過程嚴格按照說明書進行。

1.7RT-PCR法測定NF-κB p65 采用TRIzol法提取各組組織總RNA，反轉錄成cRNA并進行熒光定量PCR。擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火與延伸30 s，40個循環(huán)。選定GAPDH為內參基因。根據(jù)擴增曲線確定Ct值，熒光定量采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達相對值。引物序列如下：NF-κB p65上游引物：5′-TGGTCAGCTCCCTTCTCTGT-3′，下游引物：5′-TACCTCCAGCCTGCTTCTGT-3′；GAPDH上游引物：5′-CACCCACTCCTCTACCTTCG-3′，下游引物：5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。

1.8肺組織病理檢查 取右肺下葉中部，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示。計量資料采用單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗。

2　結果

2.1肺W/D、BALF中TNF-α、IL-6、IL-10的含量比較 BALF中TNF-α、IL-6表達量，與正常組比較，其他4組指標的表達量均升高，且UTI低、中、高劑量組均較ALI組降低，其中高劑量組降低最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（F=554.87、108.74，P＜0.05）；W/D與TNF-α、IL-6表達趨勢相同（F=28.86，P＜0.05）；而IL-10的含量，UTI低、中、高劑量組高于ALI組，且UTI高劑量組較低、中劑量組變化更顯著（F=52.80，P＜0.05）。見表1。

2.24 h及24 h血清TNF-α、IL-6、IL-10的含量比較 4 h血清TNF-α、IL-6值，與正常組比較，其他4組指標的表達量均升高（F=337.66、87.10，P＜0.05），UTI治療后，UTI低、中、高劑量組均較ALI組明顯降低，且隨UTI量增加，高劑量組降低最顯著（P＜0.05）；24 h血清TNF-α、IL-6表達規(guī)律與4 h類似（F=265.90、58.94，P＜0.05）；而IL-10的含量，UTI低、中、高劑量組較ALI組增加，且高劑量組最明顯（F=20.65、26.97，P＜0.05）。見表2、3。

表1　各組家兔肺W/D、BALF中TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（n=8，±s）

表1　各組家兔肺W/D、BALF中TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（n=8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與ALI組比較：#P＜0.05；與低劑量組比較：△P＜0.05；與中劑量組比較：▽P＜0.05

組別W/DTNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）IL-10（ng/L）正常4.62±0.1748.90±4.7726.40±2.5831.82±2.60 ALI5.81±0.28*173.98±5.17*69.60±4.28*16.33±1.08*UTI低劑量5.53±0.18*#86.82±4.19*#48.96±3.02*#19.21±1.76*#UTI中劑量5.22±0.17*#△83.06±5.28*#44.39±3.69*#△21.96±1.72*#△UTI高劑量4.92±0.21*#△▽65.72±5.68*#△▽38.88±3.94*#△▽25.45±2.19*#△▽

表2　4 h血清TNF-α、IL-6、IL-10的含量比較（n=8，±s）

表2　4 h血清TNF-α、IL-6、IL-10的含量比較（n=8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與ALI組比較：#P＜0.05；與低劑量組比較：△P＜0.05；與中劑量組比較：▽P＜0.05

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表3　24 h血清TNF-α、IL-6、IL-10的含量比較（n=8，±s）

表3　24 h血清TNF-α、IL-6、IL-10的含量比較（n=8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與ALI組比較：#P＜0.05；與低劑量組比較：△P＜0.05；與中劑量組比較：▽P＜0.05

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2.3Western blot法測定各組NF-κB表達水平ALI組肺NF-κB蛋白表達表達最明顯，且隨UTI劑量增大，UTI低、中、高劑量組的蛋白表達逐漸降低。見圖1。

圖1　Western blot法測定各組NF-κB蛋白表達水平A：正常組；B：ALI組；C：UTI低劑量組；D：UTI中劑量組；E：UTI高劑量組

2.4RT-PCR法測定NF-κB mRNA的表達水平肺組織中NF-κB mRNA表達水平隨UTI量的增多，逐漸降低，而ALI組表達量最多（F=182.25，P＜0.01）。見表4。NF-κB p65擴增曲線與熔解曲線見圖2。

2.5病理切片檢查 肉眼觀察可見：正常組兔肺表面呈淡粉紅色，均勻，包膜彈性佳、光滑，肺組織表面未見破損病灶，切面呈均質，無液體溢出。ALI組肺組織呈暗紅色，可見廣泛出血灶，肺體積增大顯著，切面可見粉紅色泡沫狀液體。低劑量組與ALI組相似，中、高劑量組肺呈暗紅色，包膜下充血水腫相對輕，體積較ALI組縮小。鏡下觀：ALI組肺組織結構受損，肺泡大小不一，肺泡間隔增厚，可見肺不張及代償性肺氣腫，肺泡腔內出血，可見大量炎細胞浸潤，肺間質存有大量水腫液，偶有透明膜形成；低劑量組肺組織結構及功能損傷也較明顯，中、高劑量組損傷較ALI組減輕，以高劑量組最為明顯，肺間質水腫明顯吸收；正常組為正常肺組織，結構基本正常。見圖3。

表4　RT-PCR測定NF-κB mRNA表達水平（n=8，±s）

表4　RT-PCR測定NF-κB mRNA表達水平（n=8，±s）

與正常組比較：*P＜0.01；與ALI組比較：#P＜0.01；與低劑量組比較：△P＜0.01；與中劑量組比較：▽P＜0.01

組別GAPDHNF-κB p65 mRNA 相對表達量正常21.837±0.3401.007±0.143 ALI21.426±0.3402.324±0.134*UTI低劑量21.034±0.3691.807±0.134*#UTI中劑量21.743±0.3171.611±0.119*#△UTI高劑量20.684±0.2911.257±0.129*#△▽

圖2　RT-PCR時NF-κB p65 mRNA的擴增與熔解曲線A：擴增曲線，B：熔解曲線

3　討論

爆炸造模后，家兔口唇、耳部皮膚及黏膜出現(xiàn)發(fā)紺、呼吸急促、氣喘、部分動物口鼻腔出現(xiàn)泡沫狀分泌物，伴呼吸窘迫、煩躁不安等癥狀，肺部出現(xiàn)干濕性啰音，部分動物短暫性昏迷，提示動物出現(xiàn)呼吸功能不全；肺組織呈暗紅色，表面多發(fā)出血灶，雙肺腫脹，切面有粉紅色泡沫狀液體流出，光鏡下肺泡壁水腫、增厚、斷裂，出現(xiàn)肺不張、肺泡融合及代償性肺氣腫，肺內大量中性粒細胞等浸潤，偶見肺透明膜，肺泡和間質水腫明顯。而ALI時，肺內血管破損，多種炎性細胞激活、增殖，并釋放炎性細胞因子，引起失控性炎癥反應，而肺結構的破壞，可誘發(fā)肺不張和肺氣腫病變，同時可引起肺內組織液的生成和回流失衡，產生肺水腫，這些病變導致了肺通氣與血流比例失調，引起呼吸急促、呼吸窘迫等癥狀，實驗結果顯示，與正常組比較，ALI組的NF-κB、TNF-α、IL-6及W/D的值均明顯增高，提示肺水腫的產生及肺部炎癥的發(fā)生，家兔心臟解剖及病理未見異常，排除心源性疾病，肺病理變化符合ALI病理變化標準［9］，提示爆炸致家兔ALI造模成功。

圖3　各組家兔組織病理學變化 HE×400A：正常組；B：ALI組；C：UTI低劑量組；D：UTI中劑量組；E：UTI高劑量組

靜息狀態(tài)下，NF-κB多以p50和p65二聚體的形式與其抑制蛋白相結合，呈無活性狀態(tài)。TNF-α、IL-6等因素可使其激活，NF-κB活化后進入細胞核，在核內與靶基因的特異序列結合，進而調控TNF-α、IL-6等炎性因子的編碼基因，調節(jié)炎癥介質的產生與釋放，這些活化的細胞因子與NF-κB形成正反饋，進一步放大炎癥反應，引起ALI疾病的發(fā)生和發(fā)展。實驗結果顯示，UTI低、中、高劑量組比ALI組NF-κB水平顯著降低，以UTI高劑量組降低最明顯，提示UTI能抑制NF-κB信號通路的激活，且隨劑量增加，效果更明顯。

TNF-α是ALI連鎖反應中的重要炎癥因子。在反應早期，TNF-α能誘導多形核中性粒細胞（polymorphonuclear，PMN）向炎癥部位聚集，同時激活內皮細胞釋放各種黏附因子，釋放IL-6、IL-8等炎性介質，誘發(fā)ALI［10］。TNF-α可增強PMN的吞噬能力，促進PMN脫顆粒和釋放溶酶體，引起PMN呼吸爆發(fā)，在此過程中，TNF-α又能激活單核巨噬細胞及PMN自身再次釋放TNF-α、IL-1等炎性介質，形成正反饋，進一步釋放大量細胞因子，放大全身或局部炎性反應，最終導致炎癥失控。研究［11］表明，IL-6為炎性細胞分化的主要調節(jié)因子，促進巨噬細胞分化和浸潤，上調黏附分子和其他細胞因子的表達，從而加強炎癥反應；IL-10是一個以免疫抑制為主的多向免疫調節(jié)因子，可直接抑制炎癥細胞活化，Tabary et al［12］發(fā)現(xiàn)IL-10可抑制NF-κB的活性，且同時能抑制單核巨噬細胞、中性粒細胞表達IL-6、TNF-α等，抑制單核巨噬細胞產生趨化等。實驗顯示ALI組TNF-α及IL-6的表達量顯著高于正常組和UTI治療組，而ALI組的IL-10表達量明顯低于UTI治療組，表明UTI可降低TNF-α、IL-6的表達、增加IL-10的產生。光鏡下病理學：與ALI組相比，UTI中、高劑量組的炎性細胞等較少見，肺水腫顯著減輕，W/D是反應肺水腫程度的良好指標，結合W/D結果，提示UTI能通過降低炎性介質的釋放，增加抗炎因子的分泌，共同作用減輕ALI的炎癥反應及肺水腫程度。爆炸致傷后，考慮由于機體損傷過重，IL-10的產生或釋放受到抑制，短時間內不足以恢復，故測得IL-10值偏低。

綜上所述，在爆炸致家兔ALI模型中，UTI可通過抑制NF-κB的活性，減少TNF-α、IL-6等細胞因子的產生與釋放，以及增加IL-10的產生，共同作用減輕炎癥反應導致的肺部損傷，尤其是在大劑量使用時，對ALI的治療效果更明顯。

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Effect and mechanism of Ulinastatin on acute lung injury in rabbits induced by blast

Li Cheng′en1，Hao Jian1，2，Li Shuwen2，et al
（1Dept of Liberation Army Hangzhou Clinical College of Anhui Medical University，Hangzhou 310007；2Dept of Cardiopulmonary Rehabilitation，Hangzhou 128 Hospital，Hangzhou 310007）

Objective To research the effect and mechanism of Ulinastatin（UTI）on acute lung injury in rabbits induced by blast.Methods The model of acute lung injury in rabbits was induced by blast.According to the randomized table，all the rabbits were randomly divided into 5 groups，normal group，ALI group，low-dose UTI group，medial-dose UTI group and high-dose UTI group.When the models of acute lung injury were finished，the rabbits in UTI groups were intravenously injected with different doses of UTI（2.5×104，5×104，10×104U/kg），while the rabbits in normal group and ALI group were injected with normal saline of same doses.The blood was collected after 4 hours and the bronchial alveolar lavage fluid（BALF），blood and some lung tissues were saved after 24 hours.TNF-α，IL-6，IL-10 were determined by ELISA method.NF-κB was evaluated by Western blot and the reverse transcription polymerase chain reaction.The wet to dry weight ratios（W/D）were determined.The pathological changes of lung tissues were observed under the microscope.Results The levels of W/D，TNF-α，IL-6，NF-κB in ALI group were significantly higher than those in normal group（P＜0.05）.With the treatment of UTI，the values of W/D，TNF-α and IL-6 in UTI groups of different doses were lower than their measures in ALI group.On the contrary，the IL-10 in ALI group was lower than that in other groups（P＜0.05）.Between these comparisons，high-dose UTI group was the most significant group（P＜0.05）.Histopathology of lung tissue showed that pulmonary edema and inflammatory in medial-dose and high-dose UTI group were better than those in ALI group.Conclusion UTI could relive inflammation in the lungs of rabbits with ALI induced by blast through balancing excess release of cytokines and inflammatory mediators，UTI could be a potential drug of ALI.

blast injury；Ulinastatin；acute lung injury；NF-κB

R 563

A

1000-1492（2016）06-0795-05

2016-03-04接收

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（編號：MS143）

1安徽醫(yī)科大學解放軍杭州臨床學院，杭州 3100072杭州醫(yī)院心肺康復科，杭州 3100073中國科學技術大學近代力學系，合肥 230027

李成恩，男，碩士研究生；郝 建，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：jianhao105@163.com