管林聰，鄒國耀，唐志宏，宋恩鴻，魏　冰

骨保護(hù)素/脫蛋白骨對兔前交叉韌帶重建腱-骨早期愈合的影響

管林聰，鄒國耀，唐志宏，宋恩鴻，魏冰

目的 探討骨保護(hù)素（OPG）/脫蛋白骨（DPB）復(fù)合物對兔前交叉韌帶（ACL）重建腱-骨早期愈合的影響。方法制備OPG/DPB復(fù)合物。80只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為4組（n= 20），即OPG、DPB、OPG/DPB及對照組，均建立ACL重建模型。實(shí)驗(yàn)組腱-骨界面分別相應(yīng)植入OPG、DPB及OPG/ DPB，對照組不做處理。術(shù)后4、8、12周取材，行病理觀察及生物力學(xué)檢測。結(jié)果 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，OPG/DPB組腱-骨界面成熟度、Sharpey纖維數(shù)量及移植肌腱抗拉性能優(yōu)于其余3組。結(jié)論 OPG/DPB復(fù)合物可顯著促進(jìn)ACL重建術(shù)后腱-骨早期愈合。

骨保護(hù)素；脫蛋白骨；復(fù)合物；前交叉韌帶；重建

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.030.html

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)，一旦損傷常造成膝關(guān)節(jié)松動(dòng)進(jìn)而影響功能。治療方法首選ACL重建，但部分患者術(shù)后腱-骨愈合不良影響手術(shù)效果。能否解決腱-骨愈合不良問題成為評(píng)判ACL重建是否成功的重要指標(biāo)［1］。骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）有促進(jìn)骨愈合作用，可應(yīng)用于ACL重建術(shù)提高手術(shù)效果，但由于“滑液灌注效應(yīng)”等的影響，腱-骨界面中單純應(yīng)用OPG易流失。脫蛋白骨（deproteinized bone，DPB）為目前研究成熟的具有緩釋功能的載體材料，該實(shí)驗(yàn)將OPG復(fù)合于DPB后植入ACL重建動(dòng)物模型中，觀察其對腱-骨早期愈合的影響，旨在為臨床提供促進(jìn)腱-骨愈合理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1OPG/DPB復(fù)合物制作 根據(jù)丁真奇等［2］方法制備DPB，經(jīng)洗滌、搗碎、環(huán)氧乙烷消毒備用。將DPB與OPG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：EA-1016，0.5 mg，凍干粉劑）水溶液混合后真空條件下置于4℃低溫4～6 h，使OPG水溶液充分吸附于DPB，即制作成OPG/DPB復(fù)合物，置于4℃冰箱常壓保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2動(dòng)物分組 80只清潔級(jí)健康成年新西蘭大白兔（月齡6～8個(gè)月），雌雄不限，2.5～3.5 kg（由桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為4組（n =20）：OPG、DPB、OPG/DPB及對照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前飲食、活動(dòng)正常，雙膝抽屜試驗(yàn)及Lachman試驗(yàn)均陰性。選左側(cè)膝關(guān)節(jié)行ACL重建。

1.2手術(shù)方法及術(shù)后處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁飲食6 h，10%水合氯醛（3 ml/kg體重）耳緣靜脈全麻。參照本課題組鄒國耀等［3］前期研究方法行ACL重建。根據(jù)史沖等［4］研究結(jié)論：骨隧道內(nèi)移植肌腱長度在15～20 mm范圍時(shí)其抗拉力程度可達(dá)到最大效果。本實(shí)驗(yàn)造模時(shí)確保各組移植肌腱在骨隧道內(nèi)長度均≥17 mm。直徑為1.5 mm克氏針建立骨隧道后用直徑為2 mm絲攻器絲攻處理，使骨隧道內(nèi)壁螺紋化，生理鹽水沖洗骨碎片。OPG組每只動(dòng)物100 μg OPG，溶于水后分別于脛骨及股骨隧道內(nèi)注射，使其充分滲入松質(zhì)骨內(nèi)，移植肌腱固定后繼續(xù)于骨隧道內(nèi)外口腱-骨界面周圍注射。DPB組每只動(dòng)物1 g DPB，用克氏針鈍頭將DPB推送入骨隧道內(nèi)，向隧道內(nèi)壁各方向涂抹，使DPB充分散布于螺紋間隙內(nèi)，移植肌腱固定后繼續(xù)于骨隧道內(nèi)外口腱-骨界面周圍填入DPB。OPG/DPB組每只動(dòng)物同法植入100 μg OPG+1 g DPB復(fù)合物，對照組除ACL重建外不做任何處理。沖洗關(guān)節(jié)腔及手術(shù)切口，逐層縫合，術(shù)后分籠飼養(yǎng)自由活動(dòng)，連續(xù)3 d行20萬單位青霉素肌注預(yù)防感染，擇期換藥、拆線。

1.3觀測指標(biāo)

1.3.1一般情況及大體觀察 術(shù)后觀察動(dòng)物飲食、關(guān)節(jié)活動(dòng)及術(shù)口愈合情況，不同時(shí)點(diǎn)獲取完整膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，行大體觀察。

1.3.2生物力學(xué)檢測 術(shù)后4、8、12周各組隨機(jī)處死6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，于膝關(guān)節(jié)上下3 cm截取完整膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，緊貼骨隧道外口離斷移植肌腱及編織縫線，離斷膝關(guān)節(jié)間隙除移植肌腱外所有軟組織，將脛骨及股骨分別固定于CMT 4104微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)（深圳市世紀(jì)天源儀器有限公司）牽拉臺(tái)兩端，以5.0 mm/s的速度進(jìn)行牽拉試驗(yàn)直至移植肌腱撥出或斷裂，并記錄肌腱撥出或斷裂瞬間的最大加載負(fù)荷。

1.3.3組織學(xué)觀察 剔除標(biāo)本表面所有軟組織及骨膜，經(jīng)體積濃度為10%甲醛水溶液固定48 h，脫鈣72 h后（體積濃度45%的鹽酸45 ml、體積濃度55%的甲酸55 ml加蒸餾水450 ml構(gòu)成脫鈣液），常規(guī)沖水、脫水、浸漬、包埋、切片，HE染色，光鏡觀察腱-骨界面組織形態(tài)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1一般情況觀察 術(shù)后1～3 d實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神欠佳，飲食、活動(dòng)少，后逐漸恢復(fù)正常。術(shù)后6 d有3只動(dòng)物出現(xiàn)自咬切口現(xiàn)象，導(dǎo)致切口感染，經(jīng)清創(chuàng)縫合、抗生素預(yù)防感染、換藥后愈合良好，術(shù)后9 d有1只動(dòng)物因拒飲食死亡。

2.2大體觀察 術(shù)后4周時(shí)，各組骨隧道內(nèi)口由瘢痕組織填充；8周時(shí)，OPG、OPG/DPB組骨隧道內(nèi)口由軟骨組織填充，DPB、對照組骨化不明顯；12周時(shí)，OPG、OPG/DPB組由骨樣組織完全封閉，DPB、對照組骨化不如OPG、OPG/DPB組且各有2例標(biāo)本出現(xiàn)明顯骨隧道擴(kuò)大。見圖1。

圖1　大體觀察A：骨隧道內(nèi)口為瘢痕組織封閉；B：部分標(biāo)本出現(xiàn)明顯骨隧道擴(kuò)大；C：骨隧道內(nèi)口為軟骨組織封閉；D：骨隧道內(nèi)口為骨樣組織封閉

2.3生物力學(xué)檢測 術(shù)后4周，各組最大加載負(fù)荷組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；8周時(shí)，OPG/DPB組最大加載負(fù)荷高于OPG組，OPG組最大加載負(fù)荷高于DPB、對照組，OPG組與OPG/DPB組比較、OPG組與DPB組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DPB組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后12周，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.4組織學(xué)觀察

2.4.1低倍鏡觀察 術(shù)后4周，OPG組腱-骨界面組織排列疏松，有散在新生骨細(xì)胞；DPB組腱-骨結(jié)合欠緊密，有少許新生骨細(xì)胞；OPG/DPB組腱-骨界面膠原纖維排列緊密，新生骨細(xì)胞較OPG組多且成熟；對照組腱-骨界面組織疏松，成骨不明顯。見圖2。術(shù)后8周，OPG組可見與腱-骨界面成一定角度的Sharpey樣纖維，部分纖維長入肌腱，組織排列較緊密。DPB組有少許Sharpey樣纖維，但較OPG組少，腱-骨結(jié)合紋理紊亂。OPG/DPB組可見排列密集的垂直腱-骨界面的Sharpey樣纖維，纖維及新生骨長入肌腱，腱-骨連接較OPG組緊密；對照組偶見Sharpey樣纖維，新生骨細(xì)胞趨向肌腱生長，腱-骨結(jié)合疏松。見圖3。術(shù)后12周，OPG組腱-骨界面成骨明顯，形成不典型的直接愈合結(jié)構(gòu)。DPB組膠原纖維及新生骨細(xì)胞長入肌腱，形成連續(xù)性纖維軟骨連接。OPG/DPB組腱-骨界面幾乎全部由新生骨填充，新生骨細(xì)胞鈣化成熟，Sharpey樣纖維較8周時(shí)減少，形成帶模糊“潮線”結(jié)構(gòu)的腱-骨移行改變帶，但仍不如正常ACL止點(diǎn)。對照組腱-骨界面逐漸成熟，但纖維骨組織分化較OPG組差，腱-骨過渡組織狹窄。見圖4。

表1　各組不同時(shí)點(diǎn)生物力學(xué)檢測結(jié)果比較（n=6，±s）

表1　各組不同時(shí)點(diǎn)生物力學(xué)檢測結(jié)果比較（n=6，±s）

與OPG組比較：*P＜0.05

時(shí)間OPG組DPB組OPG/DPB組對照組F值P值81.490.25 8周71.33±9.7758.00±12.65*83.83±4.75*55.17±11.44*10.230.00 12周83.50±2.6680.17±8.0684.67±2.1681.17±8.1 4周35.00±2.5331.83±3.6634.67±2.8833.17±2.4 30.720.55

圖2　術(shù)后4周組織學(xué)觀察 HE×100A：OPG組；B：DPB組；C：OPG/DPB組；D：對照組

圖3　術(shù)后8周組織學(xué)觀察 HE×100A：OPG組；B：DPB組；C：OPG/DPB組；D：對照組

2.4.2高倍鏡觀察 術(shù)后4周，各組腱-骨界面高倍鏡下觀察皆為纖維結(jié)締組織；8周時(shí)可見數(shù)量不等的Sharpey樣纖維，OPG/DPB組多于OPG組，OPG組多于DPB組、對照組，OPG組與OPG/DPB組比較、OPG組與DPB組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DPB組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；12周時(shí)Sharpey樣纖維減少，取而代之為連續(xù)性纖維軟骨連接及帶“潮線”的近似直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖5。

3　討論

腱-骨是否愈合良好影響ACL重建效果。研究［5-6］表明腱-骨愈合可分為間接愈合和直接愈合，間接愈合即移植肌腱通過Sharpey樣纖維與骨隧道壁連接形成間接止點(diǎn)；直接愈合即移植肌腱通過礦化的膠原纖維與骨隧道壁連接形成直接止點(diǎn)，且形成嗜堿性染色的“潮線”結(jié)構(gòu)。如何促進(jìn)ACL重建術(shù)后腱-骨早期、可靠的愈合成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)［7］。王永健等［8］用自體腘繩肌腱移植重建兔ACL，認(rèn)為腱-骨界面的愈合轉(zhuǎn)歸為移植肌腱與骨隧道壁之間形成纖維連接、纖維骨化、骨組織長入肌腱進(jìn)而再塑形的過程，最終形成典型的直接止點(diǎn)結(jié)構(gòu)，即由間接愈合向直接愈合過渡。本研究顯示術(shù)后4周，各組腱-骨界面由紊亂的纖維結(jié)締組織填充。8周時(shí)均形成Sharpey樣纖維連接，以O(shè)PG/ DPB組最明顯。至12周時(shí)，OPG/DPB組腱-骨界面均較其余組成熟，且形成帶有“潮線”結(jié)構(gòu)的類似直接止點(diǎn)的腱-骨移行改變帶。表明OPG/DPB復(fù)合物可顯著促進(jìn)ACL重建術(shù)后腱-骨界面直接止點(diǎn)的形成。

表2　各組不同時(shí)間點(diǎn)Sharpey纖維數(shù)量統(tǒng)計(jì)（n=6，±s）

表2　各組不同時(shí)間點(diǎn)Sharpey纖維數(shù)量統(tǒng)計(jì)（n=6，±s）

與OPG組比較：*P＜0.05

時(shí)間OPG組DPB組OPG/DPB組對照組F值P值--8周16.67±1.379.67±1.63*20.33±2.50*11.67±1.21*45.710.00 12周7.33±2.166.67±1.758.17±2.146.00±1.411.4 4周0000 40.26

圖4 術(shù)后12周組織學(xué)觀察 HE×100A：OPG組；B：DPB組；C：OPG/DPB組；D：對照組

圖5　高倍鏡下組織學(xué)觀察HE×400A：術(shù)后4周；B：術(shù)后8周；C：術(shù)后12周

ACL重建使移植肌腱發(fā)揮原有韌帶功能，恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，但只有移植肌腱與骨隧道壁形成牢固的愈合才能達(dá)到有效的力學(xué)強(qiáng)度［9-10］。研究［11］表明常規(guī)ACL重建后腱-骨界面形成正常止點(diǎn)需24周甚至更長，這意味著術(shù)后早期行功能鍛煉時(shí)移植肌腱所承受的應(yīng)力負(fù)荷與腱-骨間接愈合相關(guān)，因此Sharpey樣纖維數(shù)量決定移植肌腱抗拉程度。本研究顯示：術(shù)后4周各組未見Sharpey樣纖維，生物力學(xué)檢測組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周時(shí)，各組可見數(shù)量不等的Sharpey樣纖維連接，以O(shè)PG/DPB組最多，生物力學(xué)檢測示OPG/DPB組最大加載負(fù)荷均高于其余組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至12周時(shí)，Sharpey樣纖維數(shù)量較8周時(shí)減少，腱-骨界面趨向直接止點(diǎn)成熟，各組生物力學(xué)檢測組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明OPG/DPB復(fù)合物可顯著提高ACL重建術(shù)后早期移植肌腱抗拉性能。

OPG可特異性抑制破骨細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)成骨，安明等［12］實(shí)驗(yàn)觀察OPG對兔ACL重建術(shù)后腱-骨愈合的影響，證實(shí)OPG能有效促進(jìn)腱-骨早期愈合。但OPG為可溶性糖蛋白，由于“滑液灌注效應(yīng)”等的影響，骨隧道中單純應(yīng)用OPG易流失。Gulotta et al［13］將粘合劑填入腱-骨界面內(nèi)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組腱-骨愈合更牢固，說明減少“滑液灌注效應(yīng)”可有效促進(jìn)腱-骨愈合。DPB為目前研究成熟的載體，有骨傳導(dǎo)活性又不引起排斥反應(yīng)，其疏松的多孔隙網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是理想的骨組織工程支架材料。翟文亮等［14］將富血小板血漿復(fù)合于DPB后植入ACL重建動(dòng)物模型中，結(jié)果證實(shí)PRP/DPB復(fù)合物可顯著促進(jìn)腱-骨愈合。本實(shí)驗(yàn)植入OPG/DPB復(fù)合物使腱-骨結(jié)合更緊密，有利于減少“鐘擺效應(yīng)”預(yù)防骨隧道擴(kuò)大，從而減少“滑液灌注效應(yīng)”所致的OPG流失，其緩慢釋放的OPG有利于長效誘導(dǎo)骨組織再生。本研究顯示術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，OPG/DPB組腱-骨界面成熟度、Sharpey纖維數(shù)量及移植肌腱抗拉性能均優(yōu)于其余組，說明提高骨組織長入肌腱可有效促進(jìn)腱-骨愈合。

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Effect of osteoprotegerin combined with deproteinized bone on early tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits

Guan Lincong，Zou Guoyao，Tang Zhihong，et al
（Dept of Spinal and Osteopathy Surgery，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

Objective To discuss the effect of osteoprotegerin（OPG）combined with deproteinized bone（DPB）on early tendon-bone healing after anterior cruciate ligament（ACL）reconstruction in rabbits.Methods The complex of OPG/DPB was prepared.80 experimental rabbits were randomly divided into 4 groups（n=20）：OPG，DPB，OPG/DPB and control，ACL was reconstructed.The bone tunnels were filled with substances correspondingly except control group.The specimens were obtained for biomechanics test 4，8 and 12 weeks after surgery，then used it for pathological observation.Results At different time points after surgery，group OPG/DPB was superior to rest of the three groups in tendon-bone interfaced maturity，quantity of Sharpey fiber and tensile properties of transplanted tendons.Conclusion The complex of OPG/DPB can promote early tendon-bone healing after ACL reconstruction.

osteoprotegerin；deproteinized bone；complex；anterior cruciate ligament；reconstruction

R 686.5

A

1000-1492（2016）06-0827-05

2016-01-18接收

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2014GXNSFAA118239）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，桂林 541001

管林聰，男，碩士研究生；鄒國耀，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhouguoyao2000@aliyun.com