簡偉明，劉小慧，梁慧佳，李潔儀，焦春偉

(廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663)

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破壁靈芝孢子粉甾醇類HPLC指紋圖譜的建立及其抗腫瘤活性“譜效”關系

簡偉明，劉小慧，梁慧佳，李潔儀，焦春偉

(廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663)

建立了破壁靈芝孢子粉甾醇類高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的分析方法，采集了10批不同產地破壁靈芝孢子粉HPLC圖譜，運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版”軟件建立破壁靈芝孢子粉標準圖譜。并利用生物細胞模型技術得到了10批破壁靈芝孢子粉樣品粗甾醇提取物的抗人惡性乳腺癌細胞(MT-1)抑制率曲線及半數有效劑量(IC50)，運用多元線性回歸統(tǒng)計方法，將抗腫瘤活性參數IC50與HPLC指紋圖譜共有峰的標準化峰面積比值關聯。結果表明：方法的穩(wěn)定性、精密度、重現性符合方法學要求；建立的甾醇類HPLC指紋圖譜共得到15個共有峰，各樣品圖譜與標準指紋圖譜的相似度均在0.9以上。經抗人惡性乳腺癌細胞活性參數IC50研究及統(tǒng)計分析表明，指紋圖譜中與抗人惡性乳腺癌細胞活性關系密切的峰為1、3、6、8、9、14號，即麥角甾醇等6個成分是其主要活性成分。

破壁靈芝孢子粉；甾醇；高效液相色譜(HPLC)；指紋圖譜；抗腫瘤活性；“譜效”關系

靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的極其細小的孢子，具有靈芝的全部遺傳活性物質，但由于靈芝孢子壁是一層既不溶于水，也不溶于酸的幾丁質，孢子進入腸胃后，有效成分無法被人體吸收利用，因此其深加工產品破壁靈芝孢子粉更為廣大消費者所接受。因此，有必要建立有效的檢測方法對破壁靈芝孢子粉產品質量進行控制。

研究表明，破壁靈芝孢子中富含人體必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物堿和三萜類等物質[1]，而其中粗多糖與總三萜是目前獲得業(yè)內公認的功效評價指標，一般檢測方法僅是分光光度法[2-3]，在特異性方面稍存局限，并且無法反映出破壁靈芝孢子粉的整體信息。而破壁靈芝孢子粉中甾醇類物質鮮有報道。

靈芝中甾醇類物質含量豐富，其中麥角甾醇含量可達0.3%[4]，已知從靈芝中分離提取到的甾醇有麥角甾醇、羊毛甾-7,9(11)，24-三烯-3β，21-二醇、麥角甾醇過氧化物等20多種[5]，然而除麥角甾醇標準品較易獲得外，其他標準物質均難以獲得。甾醇類化合物的提取分離多以乙醇為提取原料，然后用氯仿萃取，再用NaOH水溶液萃取氯仿溶液，除去酸性部分，得到中性部分，然后用硅膠層析分離甾醇類化合物[6]或將中性部分在60～90 ℃條件下皂化，再經萃取，濃縮得到粗甾醇[7]，本文參考上述甾醇提取方法對破壁靈芝孢子粉進行樣品制備，并以甾醇類物質為研究對象，系統(tǒng)地建立了破壁靈芝孢子粉的HPLC/DAD指紋圖譜，同時將HPLC色譜法和生物細胞模型技術相結合，運用多元線性回歸方法，考察破壁靈芝孢子粉粗甾醇提取物HPLC指紋圖譜與抗人惡性乳腺癌細胞(MT-1)活性的相關性，通過“譜效”[8-9]關系篩選出能表征破壁靈芝孢子粉功效性的特征指紋圖譜，以有效地控制破壁靈芝孢子粉質量。

1　材料與方法

1.1材料

靈芝孢子粉樣品來自全國5個省份的不同生產廠家，具體見表1。經低溫物理破壁后過80目篩制成破壁靈芝孢子粉。

表1　破壁靈芝孢子粉樣品來源

1.2主要儀器和試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(配備二極管陣列檢測器),由美國安捷倫公司生產；AgilentZOBAXEclipseXDB-C18(250mm×4.6mm,5μm)不銹鋼柱；AUY220型島津分析天平；法國MilliporeMilli-QA10超純水凈化系統(tǒng)。

麥角甾醇對照品購自Sigma公司；甲醇(色譜純)由美國fisher公司生產。RPMIMedium1640basic(1640培養(yǎng)基)、0.25%EDTA胰酶消化液，由美國gibco公司生產；PBS(1*)、青鏈霉素溶液(100*)由吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司生產；培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板由德國Greiner公司生產；HighPurePCRTemplatePreparationKit由Roche公司生產；Caspase-3/CPP32ActivityColorimetricAssayKit由美國BioVision公司生產。

1.3方法

1.3.1標準品和樣品溶液的制備精密稱取麥角甾醇10mg于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，備用。

取樣品100g，加入20倍體積的95%乙醇90 ℃回流提取2h，重復2次。提取液濃縮成浸膏，將浸膏懸浮于熱水中，用氯仿萃取3次。氯仿層加入2%NaOH溶液萃取，重復若干次。收集氯仿層的中性部分。中性部分加入1mol/LKOH乙醇液80 ℃下皂化1h，冷卻后以正己烷萃取，得總甾醇部分，備用。

1.3.2HPLC指紋圖譜的建立

1.3.2.1色譜條件色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流速1.0mL/min；檢測波長210nm，進樣體積20μL；柱溫30 ℃。流動相A：甲醇，流動相B：超純水。梯度洗脫程序：0min(40%A)→15min(90%A)→25min(100%A)→45min(100%A)。

1.3.2.2方法學考察穩(wěn)定性試驗：取1號樣品溶液于0、4、8、12、24h測定，考察方法的穩(wěn)定性。

精密度試驗：取1號樣品溶液，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖，考察方法的精密度。

重現性試驗：取1號樣品，按1.3.1的方法平行制備供試液5份，記錄5份樣品的色譜圖，考察方法的重現性。

1.3.2.3HPLC指紋圖譜的構建按照1.3.1的方法制備10批不同來源的破壁靈芝孢子粉供試液，記錄HPLC色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件，將10批破壁靈芝孢子粉樣品色譜圖以AIA格式導入，以1號為參照圖譜，設定時間窗寬度為0.1min，進行峰譜自動匹配。以平均數法作為標準圖譜的生成方法。

1.3.2.4指紋圖譜的評價以指紋圖譜中峰面積最大的峰為參照峰，以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算10批樣品共有指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件計算指紋圖譜的相似度。

1.3.2.5特征波長選擇及特征峰定性按1.3.2.1色譜條件，分別嘗試210、283、360nm的檢測波長，取麥角甾醇標準品溶液上HPLC分析。通過保留時間的比對，確定樣品色譜圖中麥角甾醇特征峰。

1.3.3“譜效”關系的研究

1.3.3.1抗腫瘤活性參數IC50的測定取對數生長期人惡性乳腺癌細胞(MT-1)，計數后細胞均勻鋪于96孔板中，細胞數為1×104個/孔。將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后，取經1.3.1方法制備的各樣品粗甾醇提取物分別以濃度80、100、120、140、160μg/mL給藥，5個平行。培養(yǎng)24h后，鏡檢發(fā)現，濃度間有明顯差異，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。每孔加入100μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD492nm處測量各孔的吸光值。繪制濃度-抑制率曲線得到IC50。

1.3.3.2“譜效”關系分析測定各樣品色譜峰峰面積，與同類峰面積最大值相除，得到標準化峰面積比值，作為自變量，以抗人惡性乳腺癌細胞活性IC50作為因變量，利用SPSS16.0軟件進行多元線性回歸分析。

2　結果與分析

2.1破壁靈芝孢子粉指紋圖譜建立

按1.3.1和1.3.2.1方法制備及測定樣品，對10批不同來源的破壁靈芝孢子粉粗甾醇提取物進行測定，記錄45min色譜圖，通過比較各色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件，對其進行自動校正，生成匹配譜圖(圖1)。

圖1　破壁靈芝孢子粉標準指紋圖譜

2.2方法學考察

在0、4、8、12、24h測定1號供試品溶液的色譜圖，各主要色譜峰相對保留時間RSD小于1.0%，相對峰面積的RSD為1.2%～2.0%。1號供試品溶液連續(xù)進樣5次，色譜圖的各主要色譜峰相對保留時間RSD為0.3%～0.8%，相對峰面積的RSD為0.8%～1.5%，平行制備1號樣品5份，其色譜圖相對保留時間RSD為0.4%～0.8%，相對峰面積的RSD為1.6%～3.0%。結果表明，該方法穩(wěn)定性、精密度、重現性良好。

2.3破壁靈芝孢子粉指紋圖譜評價

以指紋圖譜中峰面積較大的8號峰為參照物峰，以參照物峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算10批樣品共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，10批樣品共有指紋峰的相對保留時間RSD小于1.0%，而相對峰面積RSD較大。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件進行破壁靈芝孢子粉HPLC/DAD指紋圖譜相似度計算，結果見表2。10批破壁靈芝孢子粉樣品與對照圖譜的相似度均在0.9以上，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》[10]的要求，說明建立指紋圖譜研究對象可信。

表2　10批破壁靈芝孢子粉樣品相似度計算結果

2.4特征波長的選擇與特征峰定性

根據指紋峰最多的選定原則[11]，經波長210、283、360nm測定后發(fā)現，在波長210nm下得到的響應最多(圖2)。同時，麥角甾醇在210nm和283nm均有響應，經保留時間比對，確定出峰時間為29.749min的色譜峰(14號峰)為麥角甾醇峰。因此，選定210nm為指紋圖譜測定波長。

圖2　不同檢測波長下破壁靈芝孢子粉指紋圖譜

2.5各樣品抗腫瘤活性參數IC50分析

按1.3.3.1方法，以人惡性乳腺癌細胞(MT-1)為功效評價對象，測定各破壁靈芝孢子粉樣品粗甾醇提取物的抗腫瘤活性，結果見表3。IC50分別為：81.35、80.93、131.49、115.20、101.19、120.17、115.31、128.89、121.44、>160μg/mL。

表3　各樣品不同給藥濃度下抗人惡性乳腺癌細胞活性抑制率 %

2.6“譜效”關系分析

測定10批不同產地破壁靈芝孢子粉指紋圖譜中的色譜峰A1～A15的峰面積，與同類峰面積最大值相處，得到標準化峰面積比值，作為自變量，以抗人惡性乳腺癌細胞活性IC50作為因變量，利用SPSS16.0軟件進行多元線性回歸分析，結果有1號、3號、4號、6號、8號、9號、11號、13號、14號等9個色譜峰被引入回歸方程，得到回歸方程為：

Y=0.976X1+0.740X3-0.285X4+1.011X6+1.219X8+0.782X9-1.510X11-0.014X13+1.407X14

此方程顯示，X1、X3、X6、X8、X9、X14所代表的1號、3號、6號、8號、9號、14號色譜峰與抗人惡性乳腺癌細胞活性呈正相關，抗人惡性乳腺癌細胞活性能力隨指紋圖譜的1號、3號、6號、8號、9號、14號色譜峰強度增大而增大，其中14號峰為麥角甾醇，已被證實具有抗腫瘤作用[12-13]。其余色譜峰具體成分與結構尚待進一步研究證實。因此，本文確定1號、3號、6號、8號、9號、14號為特征性色譜峰。

3　小結與討論

本文按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》[8]的要求，建立破壁靈芝孢子粉甾醇類HPLC指紋圖譜的分析方法，得到15個共有峰，穩(wěn)定性、精密度、重現性良好，符合方法學要求；并對10批樣品的相似度進行了考察，生成破壁靈芝孢子粉標準指紋圖譜，各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度均在0.9以上。研究了各樣品中15個共有峰的峰面積含量，并得到了粗甾醇提取物對人惡性乳腺癌細胞濃度-抑制率曲線及其參數IC50，兩者經多元線性回歸，進行“譜效”關系研究，明確了破壁靈芝孢子粉指紋圖譜共有峰與抗人惡性乳腺癌細胞活性的相關性，證實了破壁靈芝孢子粉中麥角甾醇等6個色譜峰所代表化合物的含量高低可能影響其活性，將常規(guī)化學檢定與生物檢定相結合進行“譜效”關系研究，為破壁靈芝孢子粉的生產及質量控制提供了有效方法。

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(責任編輯:曾小軍)

ConstructionofHPLCFingerprintsofSterolsinBrokenGanoderma lucidumSporesandRelationshipsbetweenTheirFingerprintandAntitumorActivity

JIANWei-ming,LIUXiao-hui,LIANGHui-jia,LIJie-yi,JIAOChun-wei

(GuangdongYueweiEdibleFungiTechnologyCompanyLimited,Guangzhou510663,China)

AmethodfortheanalysisofHPLCfingerprintsofsterolsinbrokenGanoderma lucidumsporeswasconstructed.TheHPLCfingerprintsof10batchesofbrokenGanoderma lucidumsporesamplesfromdifferentproducingareaswerecollected,andastandardfingerprintofbrokenGanoderma lucidumsporeswasconstructedbyusingthesoftware“SimilarityevaluationsystemoftraditionalChinesemedicinechromatographicfingerprints(2004edition)”.Theinhibitionratecurveandhalfeffectivedose(IC50)ofcoarsesterolextractfrom10batchesofsamplesagainsthumanmalignantbreastcancercells(MT-1)wereacquiredbyusingbiologicalcellmodeltechnique.TherelationshipbetweentheantitumoractivityparameterIC50andthestandardizedpeakarearatioofcommonpeaksfromHPLCfingerprintswasanalyzedbyusingmultiplelinearregressionstatistics.Theresultsindicatedthat:thestability,accuracyandreproducibilityofthismethodconformedtothedemandsofmethodology;fifteencommonpeakswereobtainedfromtheconstructedHPLCfingerprintsofsterols;thesimilaritiesbetweenthefingerprintsofvarioussamplesandthestandardfingerprintwereallabove0.9.ThestatisticalanalysisofIC50revealedthatthepeakNo. 1,No. 3,No. 6,No. 8,No. 9andNo. 14infingerprintshadclosecorrelationswiththeantitumoractivity,namelyergosterolandother5constituentswerethemainactivecomponentsofsterolsinbrokenGanoderma lucidumspores.

BrokenGanoderma lucidumspores;Sterols;Highperformanceliquidchromatography(HPLC);Fingerprint;Antitumoractivity;Fingerprint-effectrelationship

2016-01-22

廣東省科技計劃項目(2012B020316008)。

簡偉明(1985─)，女，助理工程師，研究方向：食藥用菌的質量控制。

S567.31

A

1001-8581(2016)08-0061-05