左鵬舉,王春秀,高春生

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

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黃河鯉金屬硫蛋白基因的克隆及表達(dá)分析

左鵬舉,王春秀,高春生*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

采用RT-PCR方法克隆獲得黃河鯉(Cyprinus carpio)金屬硫蛋白基因的編碼區(qū)(CDS)序列,該序列長183bp,編碼60個氨基酸,不含芳香族氨基酸,其中20個半胱氨酸(Cys)集中分布在肽鏈的N端和C端,具有MT典型的Cys-X(1～3個)-Cys結(jié)構(gòu),預(yù)測分子量為6013D,理論等電點為8.38。經(jīng)多序列比對，黃河鯉與高身鯽(Carassius cuvieri)的同源性最高，達(dá)94%。采用RT-qPCR進(jìn)行黃河鯉MT的組織表達(dá)分析,結(jié)果表明:黃河鯉MT基因的表達(dá)存在組織性差異,其相對表達(dá)量表現(xiàn)為肝臟>腎臟>腮>腦>肌肉。

金屬硫蛋白基因;黃河鯉;實時熒光定量;表達(dá)分析

金屬硫蛋白(MetaIIothionein,MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸,能被金屬離子、氧化損傷以及免疫刺激等多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌型蛋白[1]。MT在生物進(jìn)化上較為保守[2],目前已知的分離出來的MT的分子大小和形狀基本一致。MT廣泛存在于動物體內(nèi),具有很強的金屬結(jié)合能力和氧化還原能力,除維持金屬動態(tài)平衡和重金屬解毒外,還可參與清除自由基、拮抗電離輻射和抗應(yīng)激等[3]。

黃河鯉(Cyprinus carpio)屬鯉形目、鯉科,是我國北方重要的經(jīng)濟(jì)魚類,其分布廣泛、生命力強,對水環(huán)境變化反應(yīng)靈敏[4]。我們以黃河鯉為研究對象,克隆了它的MT編碼區(qū)序列,并監(jiān)測了其MT基因的組織表達(dá)差異,以期明確其MT基因的功能及表達(dá)，為將MT作為黃河鯉養(yǎng)殖水環(huán)境污染監(jiān)測的生物標(biāo)志的研究提供理論基礎(chǔ)[5]。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗動物黃河鯉取自河南省水產(chǎn)研究所,體長(13.37±1.09)cm,尾均重(32.70±8.76)g。試驗前暫養(yǎng)7d,挑選健康活潑的個體進(jìn)行試驗[6]。飼養(yǎng)池水溫(19±1)℃,pH(7.1±1.0)。暫養(yǎng)和試驗用水均為曝氣48h的自來水。

1.1.2試劑Trizol、DEPC水、pMD19-TVector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、SYBRGreenⅡ均購自TAKARA公司;CuSO4·5H2O、氯仿、異丙醇、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑:宿主菌株為DH5a,購自天根生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄按照Trizol試劑盒說明書提取黃河鯉肝臟、腎臟等5個組織的總RNA；用紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；提取的總RNA于-80 ℃保存[7]。

1.2.2引物設(shè)計及反轉(zhuǎn)錄用DNAstar軟件通過比對NCBI上已登錄的青鱂(NC019864)、羅非魚(S75042)、鯽魚(S75039)、鯉魚(AF002162)等魚類的MT基因編碼區(qū)序列，獲得高度保守的序列,再用軟件Primer5.0設(shè)計1對特異性引物:上游5′-ATGGATCCGTGCGAATGC-3′;下游5′-TCACTGGCAGCAGCTGGTG-3′。取1000ng總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,反應(yīng)條件為37 ℃ 15min,85 ℃ 5s。

1.2.3MT基因的克隆及測序所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行純化回收；將純化產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichia coli)的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中,于37 ℃培養(yǎng)過夜；挑單菌落(藍(lán)白斑篩選)擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒送上海生工測序[8]。

1.2.4MT基因的序列分析通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在線比對,尋求高度同源的序列;用PortParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)計算蛋白分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等;用SignalP3.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)檢測其有無信號肽序列;用ProScale(http://web.expasy.org/protscale/)以默認(rèn)算法進(jìn)行疏水性分析;用MEGA5.0軟件以鄰位相連法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行分子進(jìn)化分析[9-10]。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測MT基因的組織表達(dá)提取黃河鯉腎臟、肝臟、肌肉、腦和腮組織的總RNA,采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)已克隆的MT編碼區(qū)序列,用軟件Primer5.0按照qPCR的引物設(shè)計原則設(shè)計兩對引物:目的基因MT上游5′-AGACTGGAACTTGCAACTGTG-3′,下游5′-CTTACACACGCAGCCAGAG-3′，產(chǎn)物128bp;內(nèi)參基因Actin-β上游5′-CAGACTACCTCATGAAGATCC-3′,下游5′-CGAAGTCAAGAGCCACATAGC-3′,產(chǎn)物114bp。

RT-qPCR反應(yīng)體系為20μL:SYBRGreenⅡ10μL、上下游引物各1μL、模板cDNA2μL、DEPCH2O6μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 10min、95 ℃ 15s、60 ℃ 1min,40個循環(huán)；60～95 ℃熔解曲線,15 ℃ 1min終止。

2　結(jié)果與分析

2.1黃河鯉MT基因及氨基酸序列分析

黃河鯉MT基因編碼區(qū)長183bp,編碼60個氨基酸(如圖1所示),其中半胱氨酸(Cys)含量最高,達(dá)33.3%,賴氨酸(Lys)和絲氨酸(Ser)均占11.7%,不含芳香族氨基酸。Portparam預(yù)測蛋白分子式為C220H374N72O82S21,分子量6013D,理論等電點8.38,半衰期30h,不穩(wěn)定系數(shù)34.46,脂溶指數(shù)9.83;經(jīng)信號肽檢測為非分泌性蛋白,無信號肽結(jié)構(gòu);ProScale預(yù)測MT中部偏右有較強的疏水區(qū),兩端為親水區(qū)。

該MT氨基酸序列富含典型的Cys-X(1～3個)-Cys結(jié)構(gòu)(X為半胱氨酸以外的其他氨基酸),其中含6個C-X-C結(jié)構(gòu),即CEC、CNC、CKC、CQC、CPC、CVC;3個C-XX-C結(jié)構(gòu),即CTNC、CKTC、CSKC;5個C-XXX-C結(jié)構(gòu),即CGASC、CKKSC、CPSGC、CASGC、CGTSC;3個CC結(jié)構(gòu),且具有與其他魚類相同的特征序列CSKCXXXCCXCX(CSKCASGCVCK)[11]。

圖1　黃河鯉MT基因CDS序列及其編碼的氨基酸序列

2.2同源性及分子進(jìn)化分析

經(jīng)NCBI上Blast在線比對,黃河鯉MT基因序列與其他魚類具有高度的同源性,其中與高身鯽(Carassius cuvieri)的同源性最高,達(dá)94%；與花斑裸鯉(Gymnocypris eckloni)的同源性為93%；與斑馬魚(Danio rerio)的為92%；與稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)的為90%；與北方條鰍(Nemacheilus barbatulus)的為88%；與條石鯛(Oplegnathus fasciatus)的為84%。經(jīng)氨基酸同源性比對, 黃河鯉與稀有鮈鯽、斑馬魚、大頭鮈(Gobio)、家鼠(Musculus)、人(Homo sapiens)的同源性分別為95%、93%、92%、67%、62%。

用MEGA5.0采用NJ法(Neighbor-joining)構(gòu)建黃河鯉MT的系統(tǒng)進(jìn)化樹,采用Bootstrap進(jìn)行檢驗[12],結(jié)果如圖2所示。由圖2可見：黃河鯉與高身鯽、花斑裸鯉的親緣關(guān)系最近；與金魚、斑馬魚的親緣關(guān)系較近；與暗紋東方鲀、棘蚌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與馬的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。黃河鯉MT的分子進(jìn)化地位與黃河鯉的生物分類地位基本一致。

2.3MT的組織表達(dá)量

經(jīng)優(yōu)化,參與RT-qPCR的兩對引物的擴(kuò)增效率均達(dá)90%～110%,擴(kuò)增曲線呈理想的“S”形,熔解曲線呈尖銳的單峰,表明建立了良好的黃河鯉MT基因的相對熒光定量監(jiān)測方法。采用2-△△Ct方法監(jiān)測到MT在黃河鯉的肝臟、腎臟、肌肉、腮和腦中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,其中在肝臟中的表達(dá)量最高，其次是在腎臟、腮、腦和肌肉中的(圖3)。

3　討論

MT的分類方法有多種,主要參照氨基酸序列中Cys的排列方式,將其分為MT-Ⅰ、MT-Ⅱ兩種類型;MT-Ⅰ類型根據(jù)Cys殘基的排列特征又分為1型和2型兩種亞型。1型MT中Cys的排列方式一般為C-X-C,而2型MT的Cys排列方式具有C-X-C、C-X-X-C、C-X-X-X-C的特征[13],所以黃河鯉MT應(yīng)該屬于MT-Ⅰ的2亞型。已有研究證明,魚類MTs基因在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的相似性。本研究利用基因組學(xué)方法，根據(jù)魚類MT保守區(qū)域設(shè)計引物，克隆了黃河鯉MT的編碼區(qū)序列；經(jīng)多序列比對,該基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性存在差異,可能是由比對動物基因全長不一致和空缺位導(dǎo)致的；同源性分析表明該MT在魚類中是高度保守的[14]；經(jīng)分析，黃河鯉MT編碼區(qū)共編碼60個氨基酸,為穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。

圖2　基于黃河鯉MT基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3　黃河鯉MT基因的組織表達(dá)量

關(guān)于MT在水生動物組織中的分布情況,不同研究者得出的結(jié)果有所差異[15]。在本研究中,MT表達(dá)量在肝臟中最高,其次是在腎臟、腮和腦中的,而在肌肉中的表達(dá)量最少。這與Chavez-Cooker[16]和周彥鋒等[17]的研究結(jié)果相似。這是因為肝臟和腎臟是機(jī)體主要的解毒和排毒器官,是MT合成的主要部位,所以在這兩個組織中MT表達(dá)量較高;而腮組織具有呼吸和過濾功能,較先接觸外界刺激,腦部含有中樞神經(jīng)系統(tǒng),所以MT含量也較高,可能是保護(hù)腦免受氧化應(yīng)激的影響[15]。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

CloningandExpressionAnalysisofMetallothioneinGeneinCyprinus carpio

ZUOPeng-ju,WANGChun-xiu,GAOChun-sheng*

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

TheCDSsequenceofmetallothionein(MT)geneinCyprinus carpiowasclonedbyusingRT-PCR.Thissequencewas183bpinfulllength,encoded60aminoacidresidues,anddidnotcontainanyaromaticaminoacids.Twentycysteine(Cys)wereconcentratedlydistributedattheNterminalandCterminalofthepeptidechainwiththetypicalstructureofCys-X(1～3individuals)-Cys.Itsmolecularweightwaspredictedtobe6013D,andtheoreticalisoelectricpointwas8.38.Inaddition,themultiplesequencealignmentshowedthattheMTgeneinCyprinus carpiosharedthehighestidentity(94%)withthatinCarassius cuvieri.ThetissueexpressionofMTgeneinCyprinus carpiowasanalyzedbyusingRT-qPCR,theresultsindicatedthattherelativeexpressionlevelofMTgeneinvarioustissueswasdifferent,andshowedthefollowingorder:liver>kidney>gill>brain>muscle.

Metallothioneingene; Cyprinus carpio;Real-timeqPCR;Expressionanalysis

2016-02-11

河南省科技攻關(guān)項目(30601204)。

左鵬舉(1990─),男,河南新鄭人,碩士研究生,主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究工作。*通訊作者:高春生。

S965.116

A

1001-8581(2016)08-0066-04