丁逸寧，韋朝海，吳海珍，林柱東

（1.華南理工大學環(huán)境與能源學院，廣東廣州510006；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

流化床與沸騰床內(nèi)部微生物群落演變與分析

丁逸寧1，韋朝海1，吳海珍2，林柱東1

（1.華南理工大學環(huán)境與能源學院，廣東廣州510006；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510006）

用流化床反應(yīng)器和沸騰床反應(yīng)器處理焦化廢水，對兩種反應(yīng)器運行效能及微生物群落變化進行對比研究。結(jié)果表明，提高污泥負荷后流化床COD去除率優(yōu)于沸騰床反應(yīng)器。提高進水污泥負荷對沸騰床內(nèi)微生物的沖擊更大，致使其種群豐富程度下降明顯。研究結(jié)果證明，流化床在宏觀去除率、維持菌種豐富度方面具有較大優(yōu)勢。

流化床；沸騰床；微生物群落

流化床是目前國內(nèi)外一致公認的高效有機廢水生物處理技術(shù)。生物流化床內(nèi)污泥在氣體的沖擊下處于良好的流化態(tài)，加速了有機污染物由廢水中向微生物內(nèi)的傳質(zhì)過程，使得污泥能夠保持高活性，因此可以承受較高的負荷〔1〕。相比于流化床，沸騰床反應(yīng)器內(nèi)部未設(shè)置導(dǎo)流筒，污泥呈沸騰狀。

反應(yīng)器的處理效率與其內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)和豐富程度有著密切的聯(lián)系〔2-3〕。微生物種群豐富意味著其內(nèi)部貯存著可以在不同環(huán)境下生長、具有不同特性的微生物，因此可以抵抗環(huán)境的劇烈變化。微生物種群豐富強化了其對特定功能的保持以及對沖擊負荷的快速恢復(fù)能力，同時豐富了能源利用途徑〔4〕。影響生物處理工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)的因素包括污泥齡〔5〕、毒性物質(zhì)〔6〕、溫度〔7〕、溶解氧〔8〕等。

筆者將自行研制的高效新型三相生物流化床組合工藝應(yīng)用于寶鋼集團廣東韶鋼焦化廠焦化廢水的工程處理，實現(xiàn)了較好的處理效果和良好的經(jīng)濟效益。該生物流化床反應(yīng)器是將流化態(tài)技術(shù)和活性污泥法相結(jié)合，COD有機負荷達到4.5 kg/（m3·d）以上，遠高于普通活性污泥法。目前針對流化床的研究主要集中在廢水處理效果、反應(yīng)器設(shè)計、宏觀傳質(zhì)性能方面以及利用計算流體力學（CFD）技術(shù)解析流體力學特性等，文獻中沒有發(fā)現(xiàn)針對流化床與微生物馴化和培養(yǎng)之間關(guān)系的研究報道。生物流化床內(nèi)良好的傳氧和傳質(zhì)條件有利于微生物的生長和代謝，微生物在流化床內(nèi)有序循環(huán)的污泥流態(tài)下得到馴化，而沸騰床內(nèi)部污泥作無序運動，兩種反應(yīng)器對微生物的培養(yǎng)和馴化會有所差異。筆者選取流化床和沸騰床反應(yīng)器作為研究對象。實驗以焦化廢水作為實際運行廢水，在相同運行條件下對比兩種反應(yīng)器的運行效果及其內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。探究此差異有利于深入理解流化床反應(yīng)器在微生物培養(yǎng)方面的特性。通過對兩種反應(yīng)器內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)的對比分析，從微生物層面展示流化床的優(yōu)越性能，初步探索反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)對微生物群落的影響，為將來通過反應(yīng)器的優(yōu)化設(shè)計實現(xiàn)微生物種群豐度的調(diào)控和微生物強化提供參考。

1　實驗部分

1.1實驗污泥和原水的采集

實驗所用的廢水與活性污泥均采自寶鋼集團廣東韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站，該廢水處理站的工程始建于2004年，處理水量為70～80m3/h。實驗廢水采自該處理站集水調(diào)節(jié)池，廢水pH=9.64、COD 2 360mg/L、氨氮61.7mg/L、氰化物16.1mg/L、硫氰化物544mg/L。從一級好氧池底部排泥口采集活性污泥，接種污泥SV 53.0%、SVI65mL/g、MLSS 8 203 mg/L、MLVSS 5 332mg/L、MLVSS/MLSS=0.65。污泥取回后先悶曝24 h。

1.2實驗裝置與運行方式

實驗裝置如圖1所示。

圖1　流化床與沸騰床運行裝置

流化床和沸騰床均為圓柱形，由有機玻璃加工而成，有效體積均為7.9 L，兩個反應(yīng)器外部尺寸相同。流化床為內(nèi)循環(huán)式，內(nèi)部設(shè)置導(dǎo)流筒，依靠空氣提升力實現(xiàn)三相的流態(tài)化。沸騰床內(nèi)部未設(shè)置導(dǎo)流筒。水流方向如箭頭所示，正常運行后流態(tài)穩(wěn)定。采用蠕動泵將實驗廢水從反應(yīng)器底部泵入，在頂部分離區(qū)實現(xiàn)泥水分離，出水從頂部自然排出。

反應(yīng)器在常溫下運行，溫度為（23±2.0）℃，DO控制在2～3mg/L，pH控制在6～8。同時啟動兩臺反應(yīng)器，首先采用序批式培養(yǎng)方法，將接種污泥投加入反應(yīng)器中，接種量為反應(yīng)器容積的20%，添加實驗廢水后悶曝23 h，靜置1 h，然后排出約占反應(yīng)器1/4體積的上清液，用實驗廢水補足，該過程持續(xù)7 d。然后采用動態(tài)培養(yǎng)方法馴化污泥，連續(xù)進水，并逐步增加廢水濃度，直至滿負荷運行，該過程持續(xù)7 d。兩臺反應(yīng)器均采用連續(xù)進水的方式，控制其水力停留時間為36 h，運行過程中MLSS為3 000～3 700mg/L，投加K2HPO4（0.2 g/L）作為磷源。反應(yīng)器正常運行分為兩個階段，第一階段進水采用按1∶1的比例稀釋焦化廢水獲得的實驗廢水，共運行45 d，該階段進水COD、氨氮、硫氰化物平均質(zhì)量濃度分別為1 050、25、263mg/L，污泥負荷（以COD/MLSS計，下同）為0.21～0.23 kg/（kg·d）。第二階段進水采用焦化廢水原水，共運行48 d，該階段進水COD、氨氮、硫氰化物平均質(zhì)量濃度分別為2 410、57、537mg/L，污泥負荷為0.54～0.58 kg/（kg·d）。

1.3測試方法

對進出水COD、氨氮、硫氰化物進行檢測，以此來考察反應(yīng)器宏觀運行效能。pH的測定采用電極法，COD的測定采用重鉻酸鉀法，氨氮的測定采用納氏試劑比色法，硫氰化物的測定采用鐵離子顯色分光光度法〔9〕，MLSS的測定采用重量法。

1.4微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.4.1基因組DNA的提取

使用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取樣品DNA。取100.0mg污泥樣品，通過Buffer SCL裂解，釋放基因組DNA，然后通過Buffer SP和氯仿去除蛋白質(zhì)的干擾。抽提獲得的DNA樣品貯存于-20℃冰箱，用于后續(xù)PCR擴增。DNA樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測。通過測定在260 nm/280 nm和260 nm/230 nm下的吸光度來確定樣品DNA濃度，由此保證PCR及變性梯度凝膠電泳（DGGE）中所添加DNA模板濃度一致。

1.4.2PCR擴增

總細菌的PCR擴增采用對大多數(shù)細菌和古細菌16SrDNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對F341-GC（5′-CGCCCGCCGCGCGCGCGGGCGGGGGCGGG GGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和R534（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）〔10〕。反應(yīng)采用50μL體系：2μLDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，25μLTaq PCRMasterMix，19μL無核酸雙蒸水。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.4.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）

采用Bio-rad公司Dcode突變檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行分離，凝膠質(zhì)量分數(shù)為8%，變性劑質(zhì)量分數(shù)為30%～60%，溫度60℃，在60 V的電壓下電泳12 h。結(jié)束后，將凝膠進行銀染，待條帶出現(xiàn)后拍照，在凝膠成像系統(tǒng)上成像檢測，獲得DGGE圖譜。隨后用75%酒精消毒后的手術(shù)刀切下DGGE凝膠條帶，回收保存于200μL薄壁管，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行克隆測序。將測序結(jié)果進行處理后提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，采用BLAST進行目標序列和基因庫中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列。

1.4.4DGGE圖譜條帶分析

利用Quantity One軟件對DGGE圖譜中條帶的位置以及強度進行模擬分析，得到各條帶的波峰面積。利用Shannon指數(shù)（H）來評價污泥樣品的微生物豐富程度〔11〕。

2　結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)器運行效能比較

反應(yīng)器出水效果如圖2、圖3所示。

圖2　反應(yīng)器出水COD變化

圖3　反應(yīng)器出水氨氮變化

第一階段流化床的COD、氨氮平均去除率為70%、71%，沸騰床的COD、氨氮平均去除率為69%、67%，兩種反應(yīng)器差別較小。第二階段污泥負荷提高為0.54～0.58 kg/（kg·d）時，兩種反應(yīng)器COD去除率均有所升高，但流化床COD平均去除率為81%，較之沸騰床的73%提高得更多些。第二階段COD去除率升高的主要原因為第一階段反應(yīng)器污泥負荷較低，有機物過少，活性污泥長時間處于貧營養(yǎng)狀態(tài)下，提高負荷后有機物充足，污染物得到高效降解。

第一階段和第二階段進水硫氰化物平均質(zhì)量濃度分別為263、537mg/L，兩個反應(yīng)器在整個運行過程中出水硫氰化物質(zhì)量濃度均降到了2mg/L以下。在運行初期，由于廢水中氰化物、硫氰化物被氧化為氨氮，同時有機氮發(fā)生形態(tài)改變〔12〕，因此出水的氨氮較高。此階段異養(yǎng)菌對碳源的競爭使得硝化細菌的生長受到抑制。在低負荷條件下硝化細菌繁殖迅速，在反應(yīng)器運行20 d后硝化作用明顯增強，氨氮質(zhì)量濃度降至5mg/L以下。在提高污泥負荷后，氨氮依舊呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，兩種反應(yīng)器的出水氨氮濃度差異不大，流化床略好于沸騰床。

2.2反應(yīng)器內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)變化

將PCR擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳分離，DGGE圖譜如圖4所示。圖中M代表Marker。

圖4　反應(yīng)器污泥樣品DGGE圖譜

根據(jù)DGGE技術(shù)原理，圖譜中分離出來的條帶都是不同種類的微生物16S rDNA基因V3區(qū)的DNA片段，每個條帶原理上可以代表一個微生物菌屬，條帶信號強度越大表示該細菌在污泥中的優(yōu)勢地位越大，因此可以認為該DGGE圖譜顯示了反應(yīng)器內(nèi)細菌種群的演變和更替〔13〕。

根據(jù)條帶的變化情況可以將主要條帶所代表的細菌種類大致分為五類。第一類為在整個運行過程中始終保持穩(wěn)定的、占優(yōu)勢地位的頂級優(yōu)勢菌屬，如Band L24、L25、F3、F5，其所代表的微生物對反應(yīng)器的運行環(huán)境有很強的適應(yīng)能力，即使在高污泥負荷的沖擊下依然保持優(yōu)勢地位，對于反應(yīng)器的穩(wěn)定運行、生物處理能力的提高起著至關(guān)重要的作用。第二類為整個運行過程中始終存在但不占優(yōu)勢的菌屬，如Band L1、L21、F2、F4。其所代表的微生物豐度雖然較低，但不受運行污泥負荷和有毒物質(zhì)濃度的影響，雖不占優(yōu)勢地位但對反應(yīng)器的穩(wěn)定運行同樣起到了重要作用。第三類為反應(yīng)器運行初期存在，后期逐漸消失的菌屬，如Band L4、L6、F12、F13。這類微生物的生長對反應(yīng)器進水水質(zhì)和運行條件等環(huán)境的變化較為敏感。它們在低污泥負荷下發(fā)揮著重要的作用，但隨著污泥負荷以及毒性物質(zhì)濃度的升高逐漸被淘汰。此類微生物在沸騰床反應(yīng)器中所占的比例較高，以至于沸騰床反應(yīng)器在運行后期微生物種類減少較為明顯。第四類為當進水濃度升高其豐度逐漸提高的菌屬，如Band L10、L14、L19。這類微生物在正常運行狀態(tài)下穩(wěn)定生長，較高的有機物刺激了這類微生物的生長，進而演變?yōu)檎純?yōu)勢的菌屬。第五類為異常行為的菌屬，例如Band L2、L3、F19、F23。圖5顯示了DGGE圖譜中各類菌屬條帶數(shù)所占比例，流化床與沸騰床在第三類和第四類菌屬上差異較大，表明沸騰床中在運行后期逐漸消失的菌屬所占的比例較高，而流化床在運行后期豐度逐漸提高的菌屬比例高于沸騰床，污泥負荷的提高對流化床內(nèi)部微生物生長的刺激作用更為明顯。

圖5　DGGE圖譜中各類菌屬條帶數(shù)所占比例

微生物群落Shannon指數(shù)如圖6所示。

兩個反應(yīng)器在第一階段運行過程中微生物種群豐富程度變化不大，但提高污泥負荷以后，多環(huán)芳烴和氰化物等毒性物質(zhì)的濃度相應(yīng)增加，部分微生物難以抵抗特征污染物濃度變化而逐漸消失，此現(xiàn)象在沸騰床反應(yīng)器中尤為明顯。因此，反應(yīng)器運行后期Shannon指數(shù)有所下降。在其他運行條件相同的情況下，兩種反應(yīng)器內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)的差異主要是由污泥的流態(tài)和混合程度造成的。再提高進水污泥負荷對沸騰床內(nèi)微生物種群的沖擊更大，致使其種群豐富程度下降較大，第52天時Shannon指數(shù)為1.38，提高進水負荷后，第62天Shannon指數(shù)降為1.17，這預(yù)示著其內(nèi)部微生物種群數(shù)目在減少。第二階段后期，總細菌Shannon指數(shù)均有所升高，表明微生物逐漸適應(yīng)高濃度廢水，微生物種群數(shù)目增多。

圖6　總細菌Shannon指數(shù)

運用quantityone軟件分析流化床反應(yīng)器和沸騰床反應(yīng)器DGGE圖譜各泳道的相似性，結(jié)果表明，隨著反應(yīng)器的運行，內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)在不斷發(fā)生變化，運行后期反應(yīng)器中的微生物群落結(jié)構(gòu)與接種污泥的相似性系數(shù)不斷降低。反應(yīng)器運行第二階段相似性降低尤為明顯。流化床反應(yīng)器第89天時污泥樣品的相似性為55.1%，而沸騰床反應(yīng)器第89天時污泥樣品的相似性僅為34.4%。由此可以看出，沸騰床內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)變化更大，初步推出該反應(yīng)器抗沖擊負荷的能力相對較弱，主要是由污泥的分配不均所造成的。沸騰床內(nèi)污泥受水流沖擊做無序運動，污泥多集中于反應(yīng)器下部和中部，反應(yīng)器頂部污泥濃度較低。污泥分配不均勻影響傳質(zhì)效率，從而影響微生物生長。

3　兩種反應(yīng)器內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)對比及種群鑒定

對反應(yīng)器第一階段末期和第二階段末期的污泥樣品進行DGGE圖譜分析，并將圖譜中條帶切膠處理后測序，所得結(jié)果提交到BLAST在NCBI基因庫中進行檢索，獲得條帶所對應(yīng)的菌種同源性信息，對比結(jié)果顯示：經(jīng)測序鑒定與Band 2同源性最高的是Uncultured Thiobacillus sp.clone PII12A，該菌種屬于硫化細菌，能將還原態(tài)硫化物氧化為硫酸鹽。第一階段污泥負荷較低，廢水中有機物較少。微生物由于碳源受限，少部分異養(yǎng)菌活性受到抑制不能夠進行正常的代謝及增殖，從而導(dǎo)致兩種反應(yīng)器內(nèi)種群數(shù)量減少。硫化細菌是專性化能自養(yǎng)菌，低負荷條件下更有利于其生長，而當進水濃度增加后逐漸消失，未出現(xiàn)在泳道D和E中。Band 4與Uncultured Methyloversatilis sp.clone NBA-11的同源性達到99%，該菌種是從農(nóng)藥廠廢水處理池的活性污泥中分離鑒定得到，以有機雜環(huán)類物質(zhì)為碳源生長的菌種〔14〕。焦化廢水中同樣含有雜環(huán)類物質(zhì)，因此該菌株在第二階段豐度略有提高。與Band 8和9同源性最高的Uncultured bacterium cloneWu-C105和Uncultured bacterium cloneWu-C62都是從石油化工廢水處理系統(tǒng)中鑒定得到。Band 24自始至終都存在于DGGE圖譜中，與其同源性最高的Uncultured bacterium clone B-vesi-9-g5-f是在石油污染的土壤中鑒定得到的。對比運行末期兩個反應(yīng)器微生物DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)，Band 9、19、21所代表的菌種在流化床內(nèi)豐度更高。其中，Band 19在基因數(shù)據(jù)庫中與Uncultured bacterium clone F1Q32TO04EDBNQ的同源性達到99%，該菌是在生物膜過濾系統(tǒng)中鑒定得到的?？芍?，沸騰床在運行后期某些功能性菌群的豐度相比于流化床更低，因此流化床反應(yīng)器更有利于降解優(yōu)勢菌群的繁殖。

4　結(jié)論

（1）流化床內(nèi)部污泥在氣流的帶動下有規(guī)律地循環(huán)流動，使得污泥分布更為均勻，創(chuàng)造了良好的傳質(zhì)條件。當提高污泥負荷后，流化床的出水效果優(yōu)于沸騰床，二者COD平均去除率分別為81%、73%。

（2）污泥負荷對反應(yīng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)有很大影響。兩種反應(yīng)器在提高污泥負荷后微生物群落均發(fā)生了較大變化，并在運行后期形成了不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。沸騰床中在運行后期逐漸消失的菌屬所占的比例較高，而流化床在運行后期豐度逐漸提高的菌屬比例高于沸騰床，污泥負荷的提高對微生物生長的刺激作用更為明顯。

（3）在其他運行條件相同的情況下，微生物群落結(jié)構(gòu)的差異主要是由污泥的流態(tài)和混合程度造成的。運行后期流化床中的微生物群落結(jié)構(gòu)與接種污泥的相似性系數(shù)高于沸騰床，二者分別為55.1%、34.4%。提高進水污泥負荷對沸騰床內(nèi)微生物種群的沖擊更大，致使其種群豐富度下降較快，Shannon指數(shù)由1.38降為1.17。沸騰床在運行后期某些功能性菌群的豐度相比于流化床更低，這與兩種反應(yīng)器運行效率差異和抗沖擊負荷能力有直接的聯(lián)系。流化床在宏觀去除率，維持菌種豐富度方面具有較大優(yōu)勢。

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Succession and analysis ofm icrobial flora of the fluidized bed reactorand the boiling bed reactor

Ding Yining1，WeiChaohai1，Wu Haizhen2，Lin Zhudong1
（1.College ofEnvironmentand Energy，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.CollegeofBioscienceand Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

The fluidized bed reactor and the boiling bed reactor have been used for treating cokingwastewater.The operation efficiency and microbial flora change of the two kinds of reactors are compared.The results indicate that the COD removing rate of the fluidized bed reactor ishigher than thatof the boiling bed reactor after sludge loading has been increased.Increasing the influent sludge loading has greater impact on themicroorganisms in the boiling bed reactor，resulting in obvious decrease of species abundance of boiling bed reactor.The results prove that the fluidized bed reactorhasgreater superiority inmacroscopic removing rate and keeping the abundance ofstrains.

fluidized bed reactor；boiling bed reactor；microbial flora

X703

A

1005-829X（2016）03-0030-05

國家自然科學基金項目（51278199，21037001）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費培育項目（2013ZP0017）

丁逸寧（1990—），碩士。電話：13826067645，E-mail：536587450@qq.com。

2016-01-15（修改稿）