聶慧瓊，王　平，，張小燕，侯秀麗，許　文，邵瓊琰

不同類型白癜風(fēng)基因譜表達(dá)差異的初步研究

聶慧瓊1，王平1，2，張小燕2，侯秀麗1，許文2，邵瓊琰3

目的 探討白癜風(fēng)臨床類型與基因表達(dá)差異的相關(guān)性。方法 分別選擇節(jié)段型白癜風(fēng)（SV）、非節(jié)段型白癜風(fēng)（NSV）和健康對(duì)照（HI）各4例，應(yīng)用Phalanx人全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞基因譜表達(dá)差異，并通過(guò)RTPCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 與HI相比，SV有239個(gè)上調(diào)基因和175個(gè)下調(diào)基因，主要涉及適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路，NSV有88個(gè)上調(diào)基因和560個(gè)下調(diào)基因，涉及先天性免疫、細(xì)胞自噬與凋亡、黑素細(xì)胞生物學(xué)、泛素介導(dǎo)的蛋白裂解與酪氨酸酶代謝。SV和NSV共同基因表達(dá)差異包括60個(gè)上調(diào)基因和60個(gè)下調(diào)基因；相對(duì)于SV，NSV表達(dá)223個(gè)上調(diào)基因和129個(gè)下調(diào)基因，主要包括嘌呤、嘧啶、鞘脂類代謝。結(jié)論 SV有不同于NSV的遺傳背景與發(fā)病機(jī)制。

白癜風(fēng)，節(jié)段型；白癜風(fēng)，非節(jié)段型；基因表達(dá)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.044.html

白癜風(fēng)是一種常見的皮膚黏膜色素脫失性疾病，其病因和確切發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，涉及遺傳、免疫炎癥、神經(jīng)體液、細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、功能性黑素細(xì)胞凋亡和（或）丟失及環(huán)境因素等假說(shuō)［1-2］。根據(jù)皮損分布特點(diǎn)，白癜風(fēng)分為兩種類型，節(jié)段型白癜風(fēng)（segmental vitiligo，SV）：白斑沿某一皮神經(jīng)節(jié)段支配的皮膚區(qū)域走向分布，通常皮損不超過(guò)中線；非節(jié)段型白癜風(fēng)（non-segmental vitiligo，NSV）：又稱尋常型白癜風(fēng)，為廣泛、局灶、或散在白斑。SV和NSV不僅在皮損分布上各具特點(diǎn)，對(duì)治療選擇與治療反應(yīng)也存在較大差異，兩者存在不同的病理機(jī)制［3-4］。該研究采用高通量的基因芯片技術(shù)，篩選SV和NSV患者外周血差異表達(dá)基因，探討不同類型白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)基因的差異，為進(jìn)一步揭示白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制和采用個(gè)體化治療方案提供新思路。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本收集 選取杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科SV和NSV各4例（表1），病例均有典型白斑分布特點(diǎn)，并通過(guò)Wood燈和激光共聚焦顯微鏡再次確診。患者均無(wú)伴發(fā)其他器質(zhì)性疾病、斑禿、橋本甲狀腺炎等自身免疫性疾病及感染性疾病。入選者均為初次診治，均未系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、光敏劑及紫外線治療。兩組的性別、年齡及病程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性。健康對(duì)照組均來(lái)自我院健康體檢者。本研究獲得杭州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選病例均簽署知情同意書。

表1　病例資料

1.2全基因表達(dá)芯片檢測(cè) 抽取淺靜脈抗凝血6 ml，常規(guī)分離外周血淋巴細(xì)胞，TRIzol抽提RNA后-20℃保存，送上海儀方生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Phalanx人全基因組表達(dá)譜芯片（人32 679個(gè)基因）檢測(cè)。每組重復(fù)檢測(cè)4次。基因芯片數(shù)據(jù)利用Rosetta Resolver軟件（USA）進(jìn)行處理，篩選全基因組表達(dá)譜芯片獲取的基因差異表達(dá)水平≥0.585，且經(jīng)T-test統(tǒng)計(jì)分析顯著差異表達(dá)的基因（P＜0.05）判定為差異表達(dá)基因。

1.3RT-PCR驗(yàn)證 選取6條基因產(chǎn)物進(jìn)行RTPCR驗(yàn)證，其引物序列見表2。操作步序按常規(guī)操作，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表2　RT-PCR引物設(shè)計(jì)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示，組間比較采用兩樣本 t檢驗(yàn)；系統(tǒng)聚類分析法將差異性表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，應(yīng)用Version3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果

2.1基因芯片檢測(cè)結(jié)果

2.1.1基因表達(dá)情況 相對(duì)于HI，SV中239個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，175個(gè)表達(dá)下調(diào)，差異性表達(dá)基因發(fā)生聚類（圖1A）。利用基因本體論（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)提供的3種本體論（生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類，生物學(xué)過(guò)程中（表3），主要涉及以下3個(gè)富集項(xiàng)目：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成過(guò)程及細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程；細(xì)胞組分中（表4），主要是25%的細(xì)胞質(zhì)，19%細(xì)胞核，12%細(xì)胞支架等；分子功能中（表5），差異性表達(dá)基因主要分為離子的結(jié)合、脫氧核糖核酸（DNA）的結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、酶的結(jié)合。這些差異性表達(dá)的基因主要作用的通路包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，腫瘤通路、趨化因子信號(hào)通路、MAPK通路（表6）。

2.1.2NSV基因表達(dá)情況 相對(duì)于HI，NSV表達(dá)688個(gè)上調(diào)基因和560個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)用聚類cluster軟件對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析的結(jié)果顯示分析（圖1B），左側(cè)探針聚類區(qū)主要分上調(diào)和下調(diào)基因，這些基因參與多種功能如免疫反應(yīng)，信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)GO分析，生物學(xué)過(guò)程中（表3），主要富集項(xiàng)目包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，固有免疫反應(yīng)，氧化還原過(guò)程；細(xì)胞組分中（表4），24%細(xì)胞膜，20%細(xì)胞核，19%細(xì)胞液等物質(zhì)參與此過(guò)程；分子功能中（表5），差異性基因包含脫氧核糖核酸（DNA）的結(jié)合，受體轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)移酶、GTP酶活性。通過(guò)KEGG通路分析，這些差異性表達(dá)基因主要涉及的通路如下：MAPK信號(hào)通路，Toll樣受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路，趨化因子通路、泛素水解蛋白及C-C受體反應(yīng)（表6）。

2.1.3SV和NSV基因表達(dá)差異比較 相對(duì)于HI，SV和NSV共同表達(dá)60個(gè)上調(diào)節(jié)基因和60個(gè)下調(diào)基因。相對(duì)于SV，NSV表達(dá)223個(gè)上調(diào)基因和129個(gè)下調(diào)基因。聚類分析差異性表達(dá)基因主要分為3種類型（圖1C）。通過(guò) GO分析，生物學(xué)過(guò)程中（表3），主要分為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成過(guò)程細(xì)胞分化和免疫系統(tǒng)過(guò)程；細(xì)胞組分中（表4），蛋白復(fù)合物，質(zhì)膜，細(xì)胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞液占75%以上；分子功能中（表5），包含19%信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白活性，16%酶的結(jié)合和10%氧化還原酶活性?；蛲贩治鲲@示，這些差異性表達(dá)基因參與的過(guò)程包括嘌呤、嘧啶、鞘脂類和色氨酸代謝，免疫適應(yīng)（表6）。

表3　主要生物學(xué)過(guò)程　GO分析結(jié)果

表5　主要分子功能　GO分析結(jié)果

表6　差異表達(dá)基因主要pathway通路分析結(jié)果

圖1　聚類分析A：SV和HI前5%差異性表達(dá)基因聚類分析；B：NSV和HI前5%差異性表達(dá)基因聚類分析；C：SV和NSV5%差異性表達(dá)基因聚類分析

2.2RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證 RT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證6條基因產(chǎn)物見表2?；蛐酒cRT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致（圖2）。相對(duì)于 HI，NSV中 EGR2、UBE2D1、KIR3DS1的mRNA表達(dá)上調(diào)；SV中，UBE2D1、MMP8表達(dá)上調(diào)，CCL3、KIR3DS1和MRC2表達(dá)下調(diào)；相對(duì)于SV，NSV中EGR2、CCL3和KIR3DS1的mRNA表達(dá)上調(diào)，MMP8表達(dá)下調(diào)。

圖2　RT-PCR驗(yàn)證對(duì)比基因芯片結(jié)果

3　討論

免疫反應(yīng)在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，既往研究［5］表明，白癜風(fēng)患者存在著體液免疫、細(xì)胞免疫、細(xì)胞因子及其受體功能的異常以及自身免疫耐受狀態(tài)的破壞。本研究結(jié)果表明，SV、NSV及HI均有涉及Toll樣受體信號(hào)通路，B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，淋巴細(xì)胞增殖，免疫反應(yīng)激活等免疫反應(yīng)。但是，SV主要是適應(yīng)性免疫反應(yīng)起著重要作用，而NSV則是固有免疫反應(yīng)及B細(xì)胞分化、活化占主導(dǎo)作用，提示兩種類型白癜風(fēng)的黑素細(xì)胞破壞過(guò)程可能由不同免疫過(guò)程參與。

Jeong et al［6］對(duì)225名NSV和439名健康對(duì)照組進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）研究，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因紫外線輻射抵抗相關(guān)基因（ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG）多態(tài)性和NSV密切相關(guān)，推測(cè) UVRAG可能和 NSV易感性相關(guān)。本研究則有類似結(jié)果，即NSV與自噬相關(guān)性較更高。相對(duì)于HI，NSV存在14個(gè)自噬相關(guān)的差異性表達(dá)基因，而只有一個(gè)自噬相關(guān)基因PAFAH1B2有差異性表達(dá)，提示自噬可能在NSV的病理機(jī)制中起著重要作用。

過(guò)量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物可通過(guò)對(duì)黑素細(xì)胞的直接毒性作用、干擾表皮細(xì)胞生物嘌呤代謝、抑制細(xì)胞黑素合成酶功能等多種途徑，損傷或破壞黑素細(xì)胞，影響黑素代謝，甚至導(dǎo)致黑素細(xì)胞的死亡［7］。在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者中，外周血單核細(xì)胞超氧化歧化酶活性增強(qiáng)，谷胱甘肽和維他命E水平減低［8］。本研究顯示兩組白癜風(fēng)均存在氧化酶活性相關(guān)基因如SOD1和SOD2表達(dá)上調(diào)，表明氧化應(yīng)激在SV和NSV發(fā)病中作用相當(dāng)。

功能性黑素細(xì)胞凋亡和（或）丟失，是白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)之一［9-10］。白癜風(fēng)患者受損皮膚中，可發(fā)現(xiàn)凋亡角質(zhì)形成細(xì)胞，且抗凋亡蛋白Bcl-2、FLIP低表達(dá)，而凋亡多肽抗原和P53則高表達(dá)［10］。本研究中，凋亡相關(guān)基因多高表達(dá)在NSV，而SV幾乎不表達(dá)，提示NSV與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。

黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑素受酪氨酸酶相關(guān)家族調(diào)控，包括酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白，其受小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控［11］。本研究表明，NSV有45個(gè)酪氨酸代謝和酪氨酸激酶啟動(dòng)子活性相關(guān)基因差異表達(dá)，而不見于SV，推測(cè)NSV存在酪氨酸代謝異常。另外，NSV還存在幾種參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解差異性表達(dá)基因。這些基因可能參與NSV中相關(guān)蛋白異常水解過(guò)程，從而影響其黑素細(xì)胞功能。

綜上所述，本研究顯示SV和NSV均存在免疫異常和高氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，而相對(duì)于SV，NSV特異性表達(dá)自噬、凋亡、蛋白水解和酪氨酸酶代謝相關(guān)基因，提示兩者有不同的遺傳背景和發(fā)病機(jī)制。本研究對(duì)可能與白癜風(fēng)相關(guān)的6個(gè)基因進(jìn)行了RTPCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯示與基因芯片結(jié)果相符，這也從另一方面說(shuō)明了基因芯片結(jié)果的可信度。期待今后多環(huán)境多樣本交叉研究資料，為SV和NSV靶基因篩選及靶向治療提供分子基礎(chǔ)。

［1］ Passeron T，Ortonne JP.Physiopathology and genetics of vitiligo［J］.JAutoimmun，2005，25：63-8.

［2］ Guerra L，Dellambra E，Brescia S，et al.Vitiligo：pathogenetic hypotheses and targets for current therapies［J］.Curr Drug Metab，2010，11（5）：451-67.

［3］ 王 平，洪為松，章莉，等.白癜風(fēng)表皮黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究［J］.中華皮膚科雜志，2010，43（7）：37-40.

［4］ 倪亞杰，王平，洪為松，等.小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控與白癜風(fēng)臨床類型的相關(guān)性研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42（3）：52-5.

［5］ Le Poole IC，Luiten R M.Autoimmune etiology of generalized vitiligo［J］.Curr Dir Autoimmun，2008，10：227-43.

［6］ Jeong T J，Shin M K，Uhm Y K，et al.Association of UVRAG polymorphismswith susceptibility to non-segmental vitiligo in a Korean sample［J］.Exp Dermatol，2010，19（8）：e323-5.

［7］ Glassman S J.Vitiligo，reactive oxygen species and T-cells［J］. Clin Sci（Lond），2011，120（3）：99-120.

［8］ Dell'Anna M L，Maresca V，Briganti S，etal.Mitochondrial impairment in peripheral blood mononuclear cells during the active phase of vitiligo［J］.J Invest Dermatol，2001，117（4）：908-13.

［9］ Moretti S，F(xiàn)abbri P，Baroni G，et，al.Keratinocyte dysfunction in vitiligo epidermis：cytokinemicroenvironment and correlation tokeratinocyte apoptosis［J］.HistolHistopathol，2009，24（7）：849-57.

［10］Lee A Y，Youm Y H，Kim N H.Keratinocytes in the depigmented epidermis of vitiligo aremore vulnerable to trauma（suction）than keratinocytes in the normally pigmented epidermis，resulting in their apoptosis［J］.Br JDermatol，2004，151（5）：995-1003.

［11］Murisier F，Beermann F.Genetics of pigment cells：lessons from the tyrosinase gene family［J］.Histol Histopathol，2006，21（5）：567-78.

Prelim inary study of differential gene expression profiling between segmental vitiligo and non-segmental vitiligo

Nie Huiqiong1，Wang Ping1，2，Zhang Xiaoyan2，et al
（1Clinical College of Hangzhou，Anhui Medical University，Hangzhou 310000；2Dermatological Dept of Hangzhou Third People's Hospital，Hangzhou 310000）

Objective To investigate the correlation between clinical pattern and differential gene expression in patientswith vitiligo.Methods Peripheral blood lymphocytes obtained from four cases of segmental vitiligo（SV），non-segmental vitiligo（NSV）and healthy individual（HI）respectively.Whole genome expression microarrays were used to assay the gene expression profiles between SV，NSV and HI.Quantitative PCR assay was used to validate the gene expression of array.Results Compared to HI，239 over-expressed and 175 down-expressed genes were detected in SV，which weremainly involved in the adaptive immune response，cytokine-cytokine receptor interaction and chemokine signaling.In NSV，88 over-expressed and 560 down-expressed geneswere found and were mainly involved in the innate immune，autophagy，apoptosis，melanocyte biology，ubiquitin mediated proteolysis and tyrosine metabolism，which were different from SV.Sixty over-expressed and sixty down-expressed genes shared similar tendency in SV and NSV.Compared to SV，223 over-regulated and 129 down-regulated geneswere found in NSV，which weremainly involved in themetabolism of purine，pyrimidine and sphingolipid.Conclusion Theremay exit different genetic background and pathogenesis between SV and NSV.

segmental vitiligo；non-segmental vitiligo；gene expression

R 75

A

1000-1492（2016）05-0707-05

2016-02-22接收

杭州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？茖２№?xiàng)目（編號(hào)：20140733Q19）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2014KYB200）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬杭州臨床學(xué)院皮膚科，杭州 310000

2杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科，杭州 310000

3浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科，杭州

310000

聶慧瓊，女，碩士研究生；

王 平，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：dermwang@aliyun.com