繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎,勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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代謝組學(xué)在發(fā)酵食品有毒代謝產(chǎn)物分析中的研究進展

繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎*,勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

食品發(fā)酵過程中可形成一些有毒代謝產(chǎn)物,對發(fā)酵食品產(chǎn)生了一定的安全隱患。代謝組學(xué)作為一門新興技術(shù),可對生物代謝過程中產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物實現(xiàn)實時分析與監(jiān)測。應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、離子色譜、反相高效液相色譜、高效液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-電噴霧電離飛行時間質(zhì)譜等代謝組學(xué)技術(shù)分析酒飲料、葡萄酒、奶酪、香腸、醬油等食品中的有毒代謝產(chǎn)物,可實時監(jiān)測食品發(fā)酵過程中的氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽的形成與變化狀況,為提高發(fā)酵食品的安全控制水平和推動代謝組學(xué)在發(fā)酵食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒與參考。

代謝組學(xué),發(fā)酵食品,有毒代謝物,分析

代謝組學(xué)(Metabolomics)在“組學(xué)”領(lǐng)域是一門新興學(xué)科,仿效基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究思想,對機體、組織、細胞等代謝過程形成的分子量低于1500 ku或1000 ku的小分子代謝產(chǎn)物進行同步檢測和定性分析[1-2]。代謝產(chǎn)物包括內(nèi)源性和外源性小分子物質(zhì),主要有肽類、氨基酸、核酸、簡單糖類、有機酸、維生素、多酚和生物堿等,這些產(chǎn)物更加直接地展現(xiàn)機體的代謝過程[3]。

代謝組學(xué)研究流程包括樣品制備、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析及解釋,通過現(xiàn)代各種高新技術(shù)對代謝物進行分離、檢測和定性定量分析,將收集的信息整合在一起。代謝輪廓分析(靶向代謝組學(xué))和代謝指紋分析(非靶向代謝組學(xué))是應(yīng)用于代謝組學(xué)的兩種互補分析方法,前者通常驗證事先提出的假設(shè),研究與特定代謝途徑相關(guān)的代謝物的變化,后者對樣品進行整體性定性分析,根據(jù)圖譜差異對代謝產(chǎn)物進行快速鑒別和分類[4-6]。

代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)[7]、植物生理學(xué)[8]、醫(yī)學(xué)[9]、藥物學(xué)[10]、動物學(xué)[11]等研究領(lǐng)域。在發(fā)酵食品領(lǐng)域,代謝組學(xué)主要對發(fā)酵過程的物質(zhì)變化進行監(jiān)控和對風(fēng)味物質(zhì)進行分析等。Kang等應(yīng)用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometer,UPLC-TOFMS)技術(shù),對韓國豆醬發(fā)酵過程進行監(jiān)控,通過偏最小二乘法-判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)獲得了豆醬發(fā)酵過程中與產(chǎn)品成熟相關(guān)的22種標志性代謝產(chǎn)物[12]。Lee等[13]通過核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)研究不同國家綠茶發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)變化情況,發(fā)現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)形成與環(huán)境因素息息相關(guān),為發(fā)酵茶的生產(chǎn)提供重要的參考信息。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品因特定微生物發(fā)酵而具有獨特的風(fēng)味、口感和較高的營養(yǎng)價值,深受各國人們的青睞。由于發(fā)酵基質(zhì)成分復(fù)雜,參與的微生物類群和代謝途徑多樣,發(fā)酵食品中富含各種各樣的代謝產(chǎn)物,這些產(chǎn)物中也可能是對人類有毒有害的代謝物質(zhì)。隨著發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,發(fā)酵食品安全問題的研究越來越受到人們的重視。目前,對發(fā)酵食品中有毒代謝產(chǎn)物只停留在對產(chǎn)品檢驗的階段,尚不能實現(xiàn)對發(fā)酵過程的實時監(jiān)控。代謝組學(xué)的引入必將對發(fā)酵食品的安全控制產(chǎn)生深遠的影響。

本文從代謝組學(xué)的角度出發(fā),對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中有毒代謝產(chǎn)物如氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽的分析檢測應(yīng)用研究進行綜述,為保障發(fā)酵食品安全提供借鑒與參考。

1　代謝組學(xué)研究方法及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用1.1　樣品的采集和制備

樣品的采集與制備是代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ),需經(jīng)過嚴格的實驗設(shè)計,以達到代謝組學(xué)所要求的分析精度。樣本采集要有足夠的數(shù)量且需具有代表性,有效減少樣品個體差異對結(jié)果的影響[14]。根據(jù)研究對象、目的和分析技術(shù)不同,樣品的制備過程明顯不同。對于非靶向代謝組學(xué)分析,需最大程度地獲取代謝產(chǎn)物的數(shù)量,要求樣品預(yù)處理方法具有普適性與無偏性。而對于靶向代謝組學(xué)分析,對代謝物提取效率和選擇性的要求會進一步提高[15]。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中各種微生物共棲生長,賦予食品復(fù)雜而完整的酶系,為避免酶活性殘留或氧化還原過程降解代謝產(chǎn)物或產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物,因此,樣品制備后通常對不同發(fā)酵時期的樣品進行淬滅處理,采用-80 ℃低溫、液氮等方式保存?zhèn)溆肹16]。針對提取效率低的問題,一般選擇不同比例的水和有機溶劑(如甲醇、己烷等)進行提取。Lee等采用異丙醇、乙腈和水(3∶2∶2)的混合物對冷凍干燥的發(fā)酵豆瓣醬樣品進行提取,分析發(fā)酵過程中的初級代謝產(chǎn)物變化,取得了較好的效果[17]。

1.2檢測技術(shù)

經(jīng)采集和制備的樣品,通過合適的方法分析其中的代謝產(chǎn)物。因代謝產(chǎn)物組成復(fù)雜、含量差異和樣品制備過程的偏差等問題,目前尚無一種能夠提取和檢測所有代謝產(chǎn)物的分析方法。核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)是代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用的主要分析技術(shù)之一[18]。

1.2.1核磁共振(NMR)NMR是代謝組學(xué)研究的主要分析技術(shù),其優(yōu)勢在于樣品不需要繁瑣的前處理,能夠?qū)悠穼崿F(xiàn)非破壞性、無偏向的檢測,具有良好的重現(xiàn)性和客觀性,還具有高通量和較低成本的優(yōu)勢[19-20]。核磁共振譜包括氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、氮譜(15N-NMR)和磷譜(31P-NMR),其中以1H-NMR 應(yīng)用最為廣泛。Papotti等以1H-NMR技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合多變量分析,在意大利香醋和傳統(tǒng)香醋的特征描述和質(zhì)量控制的研究中取得良好的效果[21]。Jeong等研究韓國泡菜在自然發(fā)酵過程中的細菌菌相和代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系,利用1H-NMR技術(shù)分析表明游離糖、丙三醇和乙醇可作為發(fā)酵時間和質(zhì)量控制的指示物[22]。

1.2.2質(zhì)譜分析法(MS)與NMR技術(shù)相比,MS具有較高的靈敏度和特異性,可實現(xiàn)對代謝物的定性和定量分析[23]。通常MS和氣相色譜(gas chromatogram,GC)或液相色譜(liquid chromatogram,LC)技術(shù)聯(lián)用分析各種小分子代謝產(chǎn)物[24]。針對非靶向代謝組學(xué)分析,樣品先通過GC和LC處理后,再進入MS進行分析[25]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)因具有較高的分離能力和良好的穩(wěn)定性應(yīng)用于代謝組學(xué)研究,一般用于分析氨基酸、游離脂肪酸和有機酸等初級代謝產(chǎn)物[26]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)適合分析大量的次級代謝產(chǎn)物,包括生物堿、黃酮類、皂苷類、酚酸類和多胺類等[27]。Park等[28]應(yīng)用GC-MS技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品的不同發(fā)酵階段進行靶向代謝組學(xué)分析,結(jié)果表明大多數(shù)氨基酸在早期發(fā)酵時期含量較低,到發(fā)酵后期有所升高,脂肪酸含量在整個發(fā)酵過程中保持升高的趨勢,除了酒石酸外,其他有機酸含量一直呈現(xiàn)降低趨勢。Fraser等[29]首次采用LC-MS和GC-MS聯(lián)合技術(shù)對奶酪發(fā)酵過程中的水溶性和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行非靶向代謝指紋分析,共鑒定出包括研究較少的維生素、尿酸、肌酸、L-肉堿等45種小分子代謝物。

1.2.3數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析包括原始數(shù)據(jù)預(yù)處理和統(tǒng)計分析方法。原始數(shù)據(jù)預(yù)處理需要對原始數(shù)據(jù)進行濾噪、歸一化、標度化、色譜峰對齊和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換等步驟,保留與組分相關(guān)的信息,消除多余干擾因素的影響,使其能夠進行后期的數(shù)據(jù)分析[30]。多元統(tǒng)計方法是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析的重要手段,主要分為非監(jiān)督和監(jiān)督方法,非監(jiān)督方法包括主成分分析(principal component analysis,PCA)、自組織圖(self-organizing map,SOM)和聚類分析(cluster analysis,CA)等。監(jiān)督法包括最小二乘法(partial least squares,PLS)、顯著性分析(discriminant analysis,DA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)等[31]。Piras等[32]采用主成分分析法(PCA)處理NMR分析意大利奶酪代謝組學(xué)的研究數(shù)據(jù),由成熟時間和發(fā)酵劑的類型對奶酪進行分類。

表1　代謝組學(xué)在發(fā)酵食品有毒代謝物分析中的應(yīng)用Table 1　Application of metabolomics on analysis of toxic metabolite in fermented food

注:NA表示文獻中未報道。

2　代謝組學(xué)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品有毒代謝產(chǎn)物的分析

總體看來,大多數(shù)以傳統(tǒng)的天然發(fā)酵工藝為主,發(fā)酵食品工業(yè)化程度不高,發(fā)酵工藝中微生物菌群復(fù)雜且發(fā)酵過程難以控制,導(dǎo)致發(fā)酵食品存在一定的安全性問題。如酒飲料發(fā)酵過程可能是形成氨基甲酸乙酯的主要來源,其次是谷物類和豆類發(fā)酵食品。發(fā)酵蔬菜在腌漬過程中易在微生物的作用下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。發(fā)酵肉制品易受微生物的污染形成生物胺[33]。

國內(nèi)外有關(guān)代謝組學(xué)在發(fā)酵食品安全中的應(yīng)用研究尚不多見。表1是近些年代謝組學(xué)在發(fā)酵食品中有毒代謝產(chǎn)物分析的研究概況,主要針對發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽分析檢測中樣品前處理、研究方法、數(shù)據(jù)處理等。

2.1氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)

EC屬于多位點致癌物,具有一定的神經(jīng)毒性、強烈的肺毒性和較強的致癌性,國際癌癥研究機構(gòu)正式將EC劃列為2A類致癌物(人類可能致癌物)[34]。在食品發(fā)酵過程中EC可由尿素、氰化物、瓜氨酸、氨甲酰磷酸鹽等前體物質(zhì)與乙醇反應(yīng)形成,主要存在于酸奶、奶酪、醬油及酒飲料等發(fā)酵食品中[35]。Wu等利用GC-MS技術(shù)對中國發(fā)酵食品和酒飲料中的EC含量進行檢測,發(fā)現(xiàn)酒飲料中EC含量在2.0～515.0 μg/kg范圍內(nèi),發(fā)酵紅腐乳中EC含量最高,達到182 μg/kg[36]。2002年,聯(lián)合國糧農(nóng)組織制定了EC的國際標準,規(guī)定食品中EC含量不得超過20 μg/L[37]。因此,檢測發(fā)酵食品中EC對食品安全以及人體健康具有重要意義。

EC在發(fā)酵食品中屬痕量物質(zhì),需要靈敏度較高的檢測儀器才能檢測,應(yīng)用較多的是GC-MS。Park等采用高效液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測定韓國釀造醬油中的EC,在0.1～20.0 μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。與GC-MS方法對比,HPLC-MS/MS 法具有更低的檢測限和更好的重復(fù)性[38]。Wu等利用GC-MS技術(shù)分析了浙江黃酒在發(fā)酵和貯藏過程中EC含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中EC含量增加緩慢,經(jīng)過煎酒后EC含量迅速增加,冷卻至室溫過程中快速冷卻比自然冷卻的EC含量要少,高溫和長期儲存能夠使EC含量增加。通過對煎酒條件如溫度、時間、冷卻過程等進行優(yōu)化,可能減低其EC含量[39]。

發(fā)酵食品營養(yǎng)豐富,基質(zhì)復(fù)雜多樣,很容易對檢測結(jié)果造成干擾。因此,在采用儀器分析方法檢測EC的含量之前,通常需要對發(fā)酵食品進行預(yù)處理。Lim等[40]優(yōu)化樣品前處理條件,應(yīng)用GC-MS代謝組學(xué)方法分析泡菜、發(fā)酵豆瓣醬、發(fā)酵魚制品、酸奶、面包、醋和奶酪中的EC含量,優(yōu)化后最低檢測濃度為10 ng/mL,回收率為76.9%～118.1%。Le?a J M等通過不同吸附材料的微萃取技術(shù)提取葡萄酒中的EC,結(jié)合GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)C8和二氯甲烷是提取葡萄酒中EC的最佳吸附劑和溶劑[41]。

2.2生物胺(Biogenic Amine,BA)

BA是一類堿性含氮化合物,主要來源于發(fā)酵過程中微生物的降解作用。微生物產(chǎn)生的蛋白酶可將原料中蛋白質(zhì)分解形成氨基酸,進一步脫羧后形成BA,其中乳酸菌的作用最為突出[42]。發(fā)酵食品中的BA與原料質(zhì)量、發(fā)酵過程控制以及釀造貯藏過程中受微生物污染的程度密切相關(guān)。BA的形成需要三個條件:(1)發(fā)酵基質(zhì)中游離氨基酸或蛋白質(zhì)的含量;(2)產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物;(3)發(fā)酵基質(zhì)促進微生物生長的條件[43]。BA雖是動植物和多數(shù)微生物體內(nèi)的正常代謝成分,若含量過高會產(chǎn)生毒性作用,危害生物體正常代謝[44]。

發(fā)酵食品中的BA包括芳香胺(酪胺、苯乙胺、多巴胺等)、脂肪胺(腐胺、精胺、亞精胺等)和雜環(huán)胺(組胺、色胺等)[45]。Gianotti等利用HPLC-MS/MS技術(shù)對奶酪中的BA進行測定,結(jié)果顯示在中期成熟階段酪胺和色胺濃度相對較高。由于成熟和貯藏過程防止了微生物的污染,腐胺、亞精胺、精胺濃度相對較低[46]。De等為評估干發(fā)酵香腸的安全性,對101種樣品進行檢測,利用基于反相高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)檢測干發(fā)酵香腸中的BA。通過主成分分析和聚類分析,僅在一種產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)腐胺和尸胺的含量達到了中毒的水平[47]。Arbulu等探討了釀造葡萄酒中代謝物的種類,以液相色譜-電噴霧電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(LC-ESI-TOFMS)為基礎(chǔ),利用非靶向代謝組學(xué)對葡萄酒中的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行鑒定,通過主成分分析共鑒定出411種不同的代謝產(chǎn)物,其中BA質(zhì)量分數(shù)為4.0%[48]。

BA含量也可作為評價葡萄酒品質(zhì)的指標之一,組胺、酪胺、尸胺是葡萄酒中最具代表性的胺類。Martuscelli等利用HPLC方法對葡萄酒中的BA進行監(jiān)測,確立了影響三種葡萄酒品質(zhì)的標記物對葡萄酒的品質(zhì)進行風(fēng)險評估,為葡萄酒釀造過程安全控制奠定了基礎(chǔ)[49]。

2.3硝酸鹽和亞硝酸鹽

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中亞硝酸鹽來源于原料中的硝酸鹽,特別是蔬菜中硝酸鹽含量較高,平均含量達1500 mg/kg。在發(fā)酵過程中,分泌硝酸鹽還原酶的微生物可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽可與仲胺類物質(zhì)生成強致癌的亞硝胺[50]。我國國標GB 2762-2012規(guī)定蔬菜及其制品、腌漬蔬菜中由環(huán)境污染帶入的、非有意加入的亞硝酸鹽允許的限量不得超過20 mg/kg[51]。

Iammarino等[52]采用離子色譜法(ion chromatography,IC)對180種奶酪中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量進行檢測,所有樣品中均未檢測出亞硝酸鹽,但在21種樣品中檢測出硝酸鹽,其中未成熟干酪中硝酸鹽含量最高,達到58.6 mg/kg。劉廣福等[53]采用離子色譜法(IC)對酸菜發(fā)酵過程中不同時間采集的樣品進行分析,比較接種發(fā)酵和自然發(fā)酵酸菜的亞硝酸鹽含量,發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵法生產(chǎn)的酸菜發(fā)酵初期亞硝酸鹽含量較高,峰值出現(xiàn)在第7 d,含量為20.84 mg/kg,并提出應(yīng)將生產(chǎn)周期控制在30 d以上。Akyüz等[54]分別用GC-MS和液相色譜-熒光檢測器(liquid chromatography-fluorescence detector,LC-FLD)技術(shù)檢測土耳其奶酪和發(fā)酵香腸中的硝酸鹽和亞硝酸鹽,發(fā)酵香腸中硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度分別達到647.0 mg/kg和17.8 mg/kg。

3　結(jié)論與展望

本文主要介紹了應(yīng)用代謝組學(xué)研究方法對一些發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽等有毒代謝物研究的最新進展。通過優(yōu)化發(fā)酵和釀造條件,可實現(xiàn)對發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的在線監(jiān)測,達到消除和控制有毒代謝物的目的。因此,可以看出代謝組學(xué)在食品發(fā)酵領(lǐng)域取得的研究優(yōu)勢。

代謝組學(xué)作為一門新興學(xué)科和實時監(jiān)控的技術(shù)手段,雖然在生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,但針對發(fā)酵食品中有毒代謝物研究處于起步階段。由于發(fā)酵食品中代謝產(chǎn)物的來源和形成的復(fù)雜性,因此,代謝組學(xué)在食品科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢一方面迫切需要代謝組學(xué)分析技術(shù)具有更高的靈敏度、精確度和時效性,另一方面是將代謝組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合,探究微生物與食品品質(zhì)和安全的內(nèi)在聯(lián)系。隨著前處理手段的不斷完善,分離和檢測技術(shù)水平的不斷提高,將為促進傳統(tǒng)食品發(fā)酵工業(yè)的全面技術(shù)改造,提高食品安全性起到較大的推動作用。代謝組學(xué)必將對提高食品發(fā)酵過程中的品質(zhì)形成和安全性控制等諸多技術(shù)問題產(chǎn)生革命性的影響。

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Progress of toxic metabolite analysis in fermented food by metabolomics

MIAO Lu-huan,DU Jing-fang,BAI Feng-ling*,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products;Jinzhou 121013,China)

Some toxic metabolites were produced during the process of food fermentation,which caused safety problems to fermented food. As a new technology,metabolomics can analyze and monitor small molecule metabolites of biological metabolism in real time. Technologies of gas chromatogram-mass spectrometry(GC-MS),ion chromatography(IC),reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC),HPLC-MS/MS and liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometer(LC-ESI-TOFMS)were used to analyze toxic metabolites in food such as alcoholic beverage,wine,cheese,sausage,soybean sauce. The formation and changes of ethyl carbamate,biogenic amine and nitrite were analyzed at different fermentation period. It can provide references for increasing the safety of fermented food and promoting application in the field of fermented food.

metabolomics;fermented food;toxic metabolites;analysis

2015-06-05

繆璐歡(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制，E-mail:maioluhuan2013@163.com。

白鳳翎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制和食品微生物學(xué)，E-mail:baifling@163.com。

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD29B06)；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團隊課題(LT2014024)。

TS201

A

1002-0306(2016)05-0388-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.071