齊　炎,夏彩芬,胡　帆,盧　垚,黃夢霞

(湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北孝感 432000)

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殼聚糖季銨鹽對小牛胸腺DNA的作用研究

齊炎,夏彩芬*,胡帆,盧垚,黃夢霞

(湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北孝感 432000)

本文采用均相法合成了水溶性殼聚糖季銨鹽(HTCC),利用傅里葉紅外(FTIR)光譜及核磁共振氫譜(1H NMR)對其結(jié)構(gòu)進行了表征,結(jié)果表明,HTCC為殼聚糖C2位氨基H被季銨鹽側(cè)鏈取代的產(chǎn)物。在pH7.4的生理條件下,以吖啶橙(AO)為熒光探針,采用熒光光譜法、圓二色譜法,并結(jié)合小牛胸腺DNA(ctDNA)熱變性測定等實驗手段,初步探討了HTCC與ctDNA的相互作用機理,熒光光譜的分析結(jié)果表明:HTCC對AO-ctDNA體系有猝滅作用,且符合靜態(tài)猝滅特征。圓二色譜、熱變性曲線分析結(jié)果表明:HTCC主要以嵌插的方式與ctDNA結(jié)合,使雙螺旋結(jié)構(gòu)更緊密。

殼聚糖季銨鹽,小牛胸腺DNA,光譜法,結(jié)合方式,猝滅機理

殼聚糖(CS)為天然堿性多糖,具有生物相容性、生物可降解性和低細胞毒性等優(yōu)點,是極具發(fā)展?jié)摿Φ姆遣《拘曰蜉d體材料,然而僅能溶解于稀酸溶液中的特點限制了其在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用[1-3]。CS經(jīng)季銨化后的殼聚糖季銨鹽(HTCC)在不加入稀酸的條件下也能溶解,且由于HTCC分子鏈上帶有永久性正電荷的季銨陽離子,其氨基未在酸性條件下質(zhì)子化也能夠通過季銨陽離子與DNA分子中的帶負電荷的磷酸骨架發(fā)生靜電結(jié)合作用[4-5]。

另有大量研究結(jié)果表明:外源物與DNA的作用為非共價鍵結(jié)合,作用方式分為嵌插作用、溝槽作用和靜電結(jié)合。為了進一步從分子水平上揭示HTCC與DNA相互作用方式及機理,本文通過化學(xué)改性制備HTCC,并采用紫外光譜法、熒光光譜法和圓二色譜法等研究HTCC和小牛胸腺DNA(ctDNA)的作用機理,這將為在生物大分子水平上尋求新的具有良好生理活性的藥物有著重要的意義,同時也為研究HTCC在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

殼聚糖(Mw=125680)上海滬試化工有限公司;2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨 分析純 上海笛柏化學(xué)品有限公司;ctDNA生物純 sigma試劑;吖啶橙 日本東京化成工業(yè)株式會社。

Chirascan圓二色譜儀英國應(yīng)用光物理公司;Nicolet-380型傅立葉紅外光譜儀美國熱電尼高力公司;Varian 600 MHz核磁共振儀美國Varian公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FLS920 熒光光譜儀英國愛丁堡儀器有限公司;JSM-7800F掃描電鏡日本電子株式會社。

1.2實驗方法

1.2.1HTCC的制備將殼聚糖溶解于200 mL 2%乙酸稀溶液中,用磁力攪拌器攪拌1 h,使其充分溶解,過濾,調(diào)節(jié)濾液pH至9,使殼聚糖析出,水洗至中性,然后將得到的殼聚糖置于三口燒瓶中,加入溶劑異丙醇,攪拌,升溫,加入縮水甘油三甲基氯化銨,80 ℃反應(yīng)10 h,經(jīng)洗滌、抽濾、透析及冷凍干燥得產(chǎn)物[6]。

1.2.2HTCC取代度的測定根據(jù)公式(1)采用摩爾法計算產(chǎn)品的取代度DS[7]:

式(1)

式中:c-AgNO3溶液濃度,mol/L；V-消耗AgNO3溶液的體積,mL；W-被滴定HTCC的質(zhì)量,g；162-殼聚糖單元的分子量,g/mol；314-接上了季銨鹽基團的殼聚糖單元的分子量,g/mol。

1.2.3紅外光譜分析采用壓片法,將待測樣與溴化鉀按照一定比例研磨混勻,在油壓機中壓制成片,分別測定CS和HTCC在4000～500cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜,并比較分析。

1.2.41H-NMR分析以氘代氯仿為溶劑,在室溫下采用VarianInova核磁共振波譜儀測定HTCC的H1-NMR。

1.2.5電鏡掃描將CS、HTCC進行表面噴金處理,置于掃描電子顯微鏡下,加速電壓10kV,放大1000倍,分別對CS和HTCC進行表面微觀結(jié)構(gòu)的觀察并比較。

1.3HTCC與ctDNA的相互作用

1.3.1紫外可見光譜法采用吖啶橙(AO)對ctDNA染色,測試波長為425～525nm范圍內(nèi),HTCC對AO-ctDNA體系紫外可見光譜的影響。

1.3.2熒光光譜法配制10g/L的HTCC溶液。以491nm為激發(fā)波長,先測試AO-ctDNA體系的熒光吸收光譜,再依次加入一定量的HTCC溶液,分別測試25、31、37 ℃時各體系的熒光吸收光譜,根據(jù)這些數(shù)據(jù)計算猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)。

1.3.3HTCC對ctDNA圓二色譜的影響測定pH=7.4下ctDNA和HTCC-ctDNA體系的圓二色譜,分析HTCC對ctDNA二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.4熱變性實驗分別測試ctDNA及HTCC-ctDNA的熔點。以PBS作緩沖劑,測定紫外可見吸收強度,將恒溫槽升溫至50 ℃(50～90 ℃間、每隔2.5 ℃的溫度,總共16組溫度),重復(fù)2次,測試溶液紫外可見吸收強度。

2　結(jié)果與討論

2.1HTCC的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1HTCC取代度的測定由公式(1)可得,HTCC平均取代度為114.8%,結(jié)果顯示本實驗合成了取代度比較高的殼聚糖季銨鹽。

2.1.2FTIR和1HNMR表征CS/HTCCFTIR分析:曲線a和b十分相似,不同的是a中位于1587cm-1處的伯胺N-H面內(nèi)彎曲振動強吸收峰在b中消失,b中出現(xiàn)了位于1476cm-l的-CH3的C-H彎曲振動強吸收峰,這說明在N上引入了羥丙基三甲基氯化銨的季銨鹽側(cè)鏈[8-9]。

圖1　CS(a)/HTCC(b)FTIR分析Fig.1　FTIR analysis of CS(a)and HTCC(b)

圖2　HTCC的氫譜分析Fig.2　1HNMR analysis of HTCC

2.1.3SEM結(jié)果從圖3中可以看出CS的顆粒粒度較大,表面極不均勻,而HTCC則呈現(xiàn)出較為均勻、規(guī)整的層狀外觀形貌,且粒度較小,二者在外貌和粒度形狀上有顯著的差異。

圖3　CS(a)/HACC(b)SEMFig.3　SEM of CS(a)and HTCC(b)

2.2HTCC與AO-ctDNA的相互作用

2.2.1HTCC對AO-ctDNA紫外可見吸收光譜的影響增色效應(yīng)和減色效應(yīng)是與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型密切相關(guān)的特有光譜性質(zhì),增色效應(yīng)是HTCC與DNA堿基作用,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果;而減色效應(yīng)是小分子與DNA的磷酸基團靜電作用,使DNA空間軸向收縮的結(jié)果[10-11]。

由圖4可知,HTCC幾乎沒有紫外吸收,隨著HTCC的加入,體系紫外可見吸收增強,有明顯的增色效應(yīng)。說明HTCC可能嵌入到DNA的堿基對中,從而引起DNA的堿基對與嵌入的HTCC產(chǎn)生較強的電子相互作用。

圖4　HTCC對AO-ctDNA紫外及可見吸收光譜的影響Fig.4　UV of HTCC-AO/ctDNA注：A:ctDNA;B:AO-ctDNA;C:HTCC-ctDNA-AO,cctDNA=0.04 g/L;cAO=9.66×10-4 g/L;cHTCC=0.5 g/L。

2.2.2HTCC對AO-ctDNA體系穩(wěn)態(tài)熒光的影響由圖5可知:隨著HTCC濃度的增大,體系的熒光強度不斷降低,說明HTCC對AO-DNA體系有明顯的猝滅作用。由此可推測HTCC、AO與ctDNA的結(jié)合中存在競爭反應(yīng),HTCC可將與ctDNA發(fā)生嵌插作用的AO部分擠出,被擠出的AO處于游離狀態(tài)而發(fā)生猝滅,進一步表明HTCC與ctDNA可能是嵌插結(jié)合。

圖5　HTCC對AO/ctDNA體系熒光強度的影響Fig.5　Fluorescence spectrum of HTCC-AO/ctDNA注：cctDNA=0.04 g/L;cAO=9.66×10-4 g/L；c HTCC(A～F)=0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。

2.2.3HTCC對AO-ctDNA體系變溫?zé)晒獾挠绊憺榱搜芯矿w系的猝滅機理,我們考察了不同溫度(25、31、37 ℃)條件下,HTCC對ctDNA/AO 的熒光猝滅情況:

由圖6可知,根據(jù)Stern-Volmer 方程計算得:HTCC對AO-DNA在25、31、37 ℃時的猝滅常數(shù)Ksv分別是0.305、0.295、0.176 L/g,隨著溫度的升高,HTCC-ctDNA/AO 體系的Ksv降低,這表明HTCC對 ctDNA/AO熒光的猝滅不屬于分子間的碰撞引起的動態(tài)猝滅,而可能是由于與ctDNA 結(jié)合形成了新的復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。據(jù)此,可推斷HTCC對 AO-ctDNA 體系熒光猝滅主要是靜態(tài)猝滅[12]。

圖6　不同溫度下HTCC對AO/ctDNA的Stern-Volmer關(guān)系圖Fig.6　Stern-Volmer plots of HTCC-AO/ctDNA at different temperatures

圖7　不同溫度下HTCC與ctDNA作用修正的Stern-Volmer關(guān)系圖Fig.7　Modified Stern-Volmer plots of HTCC-AO/ctDNA at different temperatures

對于靜態(tài)猝滅體系,其熒光猝滅數(shù)據(jù)可用修正的Stern-Volmer方程進行處理。Stern-Volmer方程:

式(2)

式中,F0為不存在猝滅劑時體系的熒光強度,ΔF為加入猝滅劑前后體系熒光強度的變化,[Q]為猝滅劑濃度,fa為猝滅分數(shù),Ka為結(jié)合常數(shù)。不同溫度下HTCC與ctDNA作用修正的Stern-Volmer關(guān)系如上圖7所示。

由修正的Stern-Volmer方程計算得:HTCC對AO-ctDNA在25、31、37 ℃時的結(jié)合常數(shù)Ka是0.1510、0.1174、0.1052L/g,隨著溫度的升高,結(jié)合常數(shù)明顯降低,與猝滅常數(shù)KSV的變化是一致的。因此,可以進一步確定HTCC與ctDNA形成了穩(wěn)定的復(fù)合物,猝滅機理為靜態(tài)猝滅[12-13]。由Van’tHoff方程[13]:

ΔG=-RTlnK

式(3)

式(4)

求得熱力學(xué)參數(shù)ΔG=5.414 KJ/moL、ΔH=-32.50 KJ/moL、ΔS=-93.34 J·mol-1·K-1,表明該作用過程是不可逆的、放熱、熵減少的,HTCC與ctDNA作用的主要驅(qū)動力為氫鍵和范德華力。

2.3圓二色譜分析

CD光譜對分子的非對稱性很敏感,對于 DNA而言,雖然堿基本身具有一個對稱平面,但是在 DNA的非對稱環(huán)境中會產(chǎn)生CD光譜,因此,CD光譜可以作為研究 DNA二級結(jié)構(gòu)變化的有力方法[13]。DNA的CD譜中的正峰是由堿基堆積引起的,負峰則是由于DNA螺旋結(jié)構(gòu)的B型構(gòu)象引起的[14]。由圖8可知,HTCC的加入使DNA的正峰升高且紅移、負峰降低,說明HTCC嵌入進ctDNA后加強了堿基的堆積,使雙螺旋更加緊密,構(gòu)象發(fā)生改變[10,14-15]。

圖8　HTCC對ctDNA圓二色譜的影響Fig.8　Cicular dichroism spectra of ctDNA and HTCC-ctDNA

2.4熱變性分析

DNA主要是通過靠互補堿基的氫鍵、堿基平面間的疏水性相互作用以及堿基堆積力來維持。在加熱時,這些弱相互作用被破壞,使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散,變成單鏈,在紫外區(qū)260 nm波長處的吸光值增加。紫外光吸收值(260 nm)達到最大值的50%(即DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半)時的溫度稱為DNA的熔點(Tm)。當(dāng)藥物分子與DNA作用時,通常會引起DNA的熔點變化,而且變化的大小幅度與它們的鍵合強度有關(guān)。因此,測定DNA的熔點變化,提供了一種簡便有效地研究小分子與DNA相互作用的方法[13,16-17]。

如圖9所示,隨著溫度逐漸升高,ctDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)由緊密變松散,在260 nm的吸光度就逐漸增加,分析可得其熔點為72.5 ℃。藥物與DNA相互作用方式有三種:嵌插作用、溝槽作用、靜電作用,當(dāng)小分子與DNA以插入模式相結(jié)合時,由于能夠和DNA堿基對之間發(fā)生π-π堆積作用,穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),從而使DNA的熔點Tm有明顯升高,而藥物與DNA之間僅僅通過簡單的溝槽結(jié)合、靜電或氫鍵等弱結(jié)合時,ΔTm變化則相對要小很多。由圖9可知,ctDNA的熔點為72.5 ℃,加入HTCC后,ctDNA的熔點顯著上升至77.5 ℃,說明HTCC與ctDNA主要以嵌插的方式結(jié)合,增強了ctDNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖9　ctDNA/HTCC-ctDNA熱變性曲線Fig.9　Thermal denaturation curve of ctDNA and HTCC-ctDNA

3　結(jié)論

本文采用均相法合成了水溶性HTCC,熒光實驗表明HTCC對AO-ctDNA體系的熒光產(chǎn)生了顯著的猝滅,猝滅機理符合靜態(tài)猝滅;且HTCC與ctDNA發(fā)生相互作用的主要驅(qū)動力為氫鍵和范德華力;圓二色譜和熱變性實驗表明了HTCC與ctDNA結(jié)合的方式主要為嵌插結(jié)合。

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Study on the interaction between quaternary ammonium salt of chitosan and calf thymus DNA

QI Yan,XIA Cai-fen*,HU Fan,LU Yao,HUANG Meng-xia

(College of Chemistry and Materials Science,Hubei Engineering University,Xiaogan,432000,China)

2-Hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan(HTCC)were synthesed in heterogeneous system and characterized by IR and NMR spectroscopy. HTCC was the product that the N-H of CS located at C2was replaced by quaternary ammonium salt. In the physiplogical environment(pH=7.4). The interaction of HTCC with calf thytus DNA(ctDNA)were performed by fluorescence spectra and circular dichroism spectra,using acridine orange(AO)as a molecular probe. The analysis of UV Vis and fluorescence spectra showed that there was strong interaction between HTCC and ctDNA,the addition of HTCC made the fluorescence quenched effectively,which fitted the characteristics of the static fluorescence quenching. The circular dichroism spectra and thermal denaturation experiment proved that they combined with each other through the intercalative binding mode.

quaternary ammonium salt of chitosan;calf thymus DNA;spectral method;combination mode;quenching mechanism

2015-10-14

齊炎(1994-)，男，本科，研究方向:生物光化學(xué)，生物熱化學(xué)，E-mail:775947711@qq.com。

夏彩芬(1979-),女，博士，研究方向：生物光化學(xué)，生物熱化學(xué)，E-mail:xintong7903@126.com。

國家自然科學(xué)基金項目(21503075);湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(B2015034)資助。

TS201.1

A

1002-0306(2016)11-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.003