黃艷娜,畢雪威,游春蘋,*

(1.光明乳業(yè)股份有限公司,乳業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

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膽鹽水解酶基因在植物乳桿菌ST-Ⅲ中的表達(dá)

黃艷娜1,畢雪威2,游春蘋1,*

(1.光明乳業(yè)股份有限公司,乳業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

膽鹽水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)是微生物生長、繁殖過程中產(chǎn)生的一種胞內(nèi)酶,因其與降低血膽固醇、預(yù)防心血管疾病有關(guān)而受到廣泛關(guān)注。本研究通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了4種膽鹽水解酶基因在LactobacillusplantarumST-Ⅲ的過表達(dá),并利用茚三酮顯色法測定了表達(dá)4種BSHs重組菌的酶活,結(jié)果顯示表達(dá)BSH1重組菌的酶活最高,其次是BSH3和BSH2的重組菌,而以BSH4重組菌酶活最低。本研究結(jié)果表明,BSH1可能在L.plantarumST-Ⅲ水解膽鹽方面起著更為重要的作用,其次為BSH3,而BSH2和BSH4在L.plantarumST-Ⅲ中對?；撬峤Y(jié)合膽鹽的水解能力較弱。

膽鹽水解酶,植物乳桿菌ST-Ⅲ,克隆表達(dá),酶活性

膽鹽水解酶(Bile salt hydrolase,BSH,EC 3.5.1.24)是微生物生長、繁殖過程中產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物。該酶是bsh基因編碼的一種胞內(nèi)酶,對氧氣不敏感,適宜在微酸性環(huán)境下生長,能水解胃腸道中的結(jié)合態(tài)膽鹽(?；悄懰猁}和甘氨膽酸鹽)為非結(jié)合態(tài)膽酸和游離氨基酸,從而使血清中膽固醇含量降低[1-2]。國內(nèi)外大量臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí),服用益生菌及其相關(guān)制品可減少人體血清膽固醇的含量,降低心血管疾病發(fā)病率。Smet等[3]研究表明:乳酸菌降血清膽固醇與該乳酸菌產(chǎn)生的BSH活力密切相關(guān)。所以研究膽鹽水解酶的特性對于揭示益生菌降膽固醇的作用機(jī)理具有重要意義。

植物乳桿菌ST-Ⅲ是本實(shí)驗(yàn)室從醬菜中分離得到的一株益生菌,具有降膽固醇的功能[4]。任婧等[5-6]在大腸桿菌中分別表達(dá)了4種L.plantarumST-Ⅲ膽鹽水解酶基因,結(jié)果顯示4種BSHs均具有活性。趙時(shí)瑋等[7]也對植物乳桿菌JPP2的膽鹽水解酶bsh3基因進(jìn)行了大腸桿菌中的表達(dá)。

表1　引物設(shè)計(jì)

黃茜等[8]對植物乳桿菌Yl的膽鹽水解酶基因進(jìn)行了克隆,研究表明表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。為改善BSHs異源表達(dá)包涵體的問題,楊士芹等[9]嘗試密碼子優(yōu)化和選擇大腸桿菌Rosetta為宿主的方法,克隆了嗜熱乳桿菌和嗜酸乳桿菌中的膽鹽水解酶基因(前者為bsh,后者為bshA和bshB),該研究僅通過LB平板中添加?；敲撗跄懰徕c有沉淀生成初步判斷重組菌具有水解膽鹽的活性。而在本研究中,我們通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)4種膽鹽水解酶基因在植物乳桿菌ST-Ⅲ自身的過表達(dá),一方面可以避免BSH在大腸桿菌中異源表達(dá)帶來的包涵體問題,另一方面還可以直觀的判斷不同的膽鹽水解酶基因?qū)λ拗魉饽扄}的作用程度。本實(shí)驗(yàn)通過BSH酶活性的測定和菌株對膽鹽的耐受性實(shí)驗(yàn),解析不同膽鹽水解酶在L.plantarumST-Ⅲ中的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株和質(zhì)粒植物乳桿菌L.plantarumST-Ⅲ[4]和大腸桿菌EscherichiacoliJM109為本實(shí)驗(yàn)室保存,其基因型為:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB+)/F′[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]。

質(zhì)粒pIB184由本實(shí)驗(yàn)室保存。pIB184質(zhì)粒為組成型表達(dá)質(zhì)粒,P23啟動(dòng)子,可以在菌體生長過程中過表達(dá)插入基因。

1.1.2試劑Taq DNA聚合酶,T4 DNA連接酶,dNTP Mixture、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I 均購于TaKaRa生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、基因組抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;茚三酮和紅霉素購自上海生工生物工程有限公司;?；悄懰徕c購自Sigma公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

引物設(shè)計(jì)與DNA測序分析由上海生工生物工程有限公司提供。

1.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(/L):胰蛋白胨(Oxid,Hampshire,England)10 g,酵母提取物(Oxid)5 g,NaCl 10 g,固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L。用于大腸桿菌的培養(yǎng),其中重組大腸桿菌的培養(yǎng)需添加終濃度為250 μg/mL紅霉素。MRS液體和固體培養(yǎng)基均購自O(shè)xid公司,用于植物乳桿菌的培養(yǎng),其中重組乳酸桿菌的培養(yǎng)需添加終濃度為10 μg/mL紅霉素。

1.1.4儀器Biophotometer Plus核酸蛋白測定儀,5424R臺式離心機(jī),Eporator/43900電穿孔儀美國Eppendorf公司;Nanodrop 2000C微量分光光度計(jì)美國賽默飛世爾科技公司;MIR-154恒溫培養(yǎng)箱日本三洋電器集團(tuán);MB-102恒溫震蕩金屬浴杭州博日科技有限公司;Proflex PCR儀美國ABI公司。

1.2引物設(shè)計(jì)與目的基因的克隆

根據(jù)Genbank中公布的L.plantarumST-Ⅲ的bsh1(ADO00098),bsh2(ADN97280),bsh3(ADN99975)和bsh4(YP_003063652)的基因序列,選擇pIB184為表達(dá)載體,引物設(shè)計(jì)如表1所示。

引入BamH I和EcoR I為酶切位點(diǎn),以提取的L.plantarumST-Ⅲ基因組為模板,PCR擴(kuò)增膽鹽水解酶的四個(gè)同工酶基因。反應(yīng)體系如下:PCR體系為50 μL:模板DNA 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,dNTPs(10 mmol/L)2 μL,10×PCR buffer 5 μL,0.5 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL),ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將質(zhì)粒pIB184與基因片段分別進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收DNA片段。按照質(zhì)粒與基因片段濃度比為1∶3的比例進(jìn)行16 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含終濃度為250 μg/mL紅霉素的LB平板,挑選陽性克隆并鑒定。

1.4植物乳桿菌感受態(tài)的制備和重組L.plantarumST-Ⅲ菌株的構(gòu)建

植物乳桿菌ST-Ⅲ感受態(tài)的制備。乳桿菌過夜培養(yǎng)后,按照1%的接種量接種至100 mL含有1%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5～0.7左右;將培養(yǎng)液于冰上預(yù)冷10 min,4 ℃,5000 r/min離心5 min。用預(yù)冷的電擊緩沖液(30%聚乙二醇)懸浮菌體,冰上放置10 min,4 ℃,5000 r/min離心5 min,菌體重新懸浮在1/100體積的電擊緩沖液,分裝,于-80 ℃冰箱中保存。

取3 μL重組質(zhì)粒與100 μL的感受態(tài)細(xì)胞混合,移入電擊杯中置冰上5 min,使用高壓脈沖電穿孔儀,在1.5 kV條件下電擊,電擊5 ms左右。電擊完畢后向電擊杯中加入復(fù)蘇培養(yǎng)基,混勻后移入離心管中,37 ℃靜置培養(yǎng)2 h。取100 μL涂布于含終濃度為10 μg/mL紅霉素的MRS平板,37 ℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑單菌落,37 ℃培養(yǎng)24 h,PCR驗(yàn)證是否為陽性克隆。

1.5膽鹽水解酶活性的測定

采用茚三酮顯色法繪制?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線[10]。準(zhǔn)確吸取200 μg/mL的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于25 mL比色管中,各加水補(bǔ)足至4.0 mL。然后加入茚三酮顯色液1.0 mL混合均勻,于沸水浴中加熱16 min,取出迅速冷卻至室溫,加入5 mL碘酸鈉稀釋液,并加水定容。靜置15 min后于570 nm波長處測其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)?；撬岷繛闄M坐標(biāo),繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

膽鹽水解酶活性的測定方法參照文獻(xiàn)所述[11-13],稍加改動(dòng)。采用細(xì)胞破碎后添加溶菌酶破壁的方法處理樣品,細(xì)胞超聲破碎條件為:工作時(shí)間3 s,間隔5 s,電壓300 W,超聲90次;樣品超聲處理后分別加入溶菌酶處理,以使細(xì)胞壁裂解完全。參照文獻(xiàn)所述方法測定膽鹽水解酶活性,即測定570 nm處吸光值。單位體積的粗酶液每分鐘從底物釋放1 nmol?；撬崴枰拿噶慷x為一個(gè)酶活單位(U)。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

酶活測定實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1膽鹽水解酶基因的PCR擴(kuò)增和測序

以植物乳桿菌L.plantarumST-Ⅲ的基因組為模板,PCR擴(kuò)增膽鹽水解酶基因,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。各基因均擴(kuò)增出特異條帶,大小與目的片段基本一致。將PCR產(chǎn)物送上海生工測序,結(jié)果顯示bsh 1～bsh 4基因大小分別為975、1017、987、954 bp,經(jīng)與NCBI中報(bào)道的L.plantarumST-Ⅲ中bsh1(ADO00098),bsh2(ADN97280),bsh3(ADN99975)和bsh4(YP_003063652)的基因序列比對分析,顯示基因序列的同源性均為100%。

圖1　膽鹽水解酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.1　The electrophoretogram of PCR product of the bile salt hydrolase genes.注:M:Marker;1:bsh1;2:bsh2;3:bsh3;4:bsh4。

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將BamH I和EcoR I雙酶切的四個(gè)DNA片段(bsh1～bsh4)和同樣雙酶切的質(zhì)粒pIB184分別16 ℃連接10 h左右,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109,復(fù)蘇后涂終濃度為250 μg/mL紅霉素的抗性LB平板。37 ℃過夜培養(yǎng)后挑選陽性克隆,培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒,并對質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和EcoR I的雙酶切驗(yàn)證。瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示。如圖所示,重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后均顯示有較特異的兩條帶,且大小與質(zhì)粒和目的片段基本一致。將四個(gè)重組質(zhì)粒送上海生工測序,測序比對結(jié)果顯示基因大小正確,表明所挑選單克隆為正確的重組子。

圖2　重組質(zhì)粒BamH I和EcoR I雙酶切驗(yàn)證電泳圖 Fig.2　The electrophoretogram of the recombinant plasmid digested by BamH I and EcoR I.注:1:pIB184bsh1;2:pIB184bsh2;3:pIB184bsh3;4:pIB184bsh4;M:Marker。

2.3表達(dá)膽鹽水解酶的重組植物乳桿菌的構(gòu)建

將表達(dá)膽鹽水解酶的四種重組質(zhì)粒(pIB184bsh 1～4)電擊轉(zhuǎn)化L.plantarumST-Ⅲ感受態(tài)細(xì)胞,復(fù)蘇3 h后,涂含有10 μg/mL紅霉素抗性MRS平板,37 ℃靜置培養(yǎng)36 h,挑選單克隆。

將挑選的單克隆接種于含有10 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后保種,其余菌體采用終濃度為10 μg/mL的溶菌酶處理后抽提質(zhì)粒。以抽提的質(zhì)粒為模板,以設(shè)計(jì)的pIB184質(zhì)粒的測序引物(IB-F:ATCAGACCTAAGACTGATGAC;IB-R:CGATTACATGGATTGGATTAG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示。從電泳圖中我們可以看出,各重組質(zhì)粒均擴(kuò)增出大小正確的特異條帶,送上海生工測序,與NCBI中報(bào)道的四個(gè)膽鹽水解酶同工酶(bsh1～bsh4)的基因序列同源性均為100%,證明所挑選的單克隆為陽性。將表達(dá)bsh1～bsh4基因的重組植物乳桿菌分別命名為ST-Ⅲ/bsh1、ST-Ⅲ/bsh2、ST-Ⅲ/bsh3和ST-Ⅲ/bsh4。

圖3　重組菌膽鹽水解酶基因PCR驗(yàn)證電泳圖 Fig.3　The PCR electrophoretogram of bsh gene in the recombinant strains注:M:Marker;1:bsh1;2:bsh2;3:bsh3;4:bsh4。

2.4膽鹽水解酶活性的測定

將L.plantarumST-Ⅲ及其重組菌分別接種于含有0.05%?；悄懰徕c的MRS液體培養(yǎng)基中,并添加相應(yīng)濃度的紅霉素,37 ℃培養(yǎng)12 h。采用Biophotometer Plus核酸蛋白測定儀測定細(xì)胞濃度(OD600),并按照1.5所述方法收集菌體,測定膽鹽水解酶酶活。以L.plantarumST-Ⅲ為對照,以超聲破碎后的滅活粗酶液作空白,測定不同重組菌的膽鹽水解酶的酶活性并比較其變化。?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.002x+0.113(R2=0.992)。

從表2中可看出,表達(dá)膽鹽水解酶的重組菌在含有0.05%?；悄懰徕c的培養(yǎng)基中細(xì)胞生長較宿主L.plantarumST-Ⅲ均有明顯的提高。其中宿主L.plantarumST-Ⅲ在發(fā)酵12 h時(shí)OD600為0.946,而重組菌中以ST-Ⅲ/bsh3細(xì)胞濃度最高,OD600為2.15,是對照菌體濃度的2.28倍;其他三株重組菌OD600無顯著差異(p>0.05),均略大于1.8,較對照提高了90%。L.plantarumST-Ⅲ在含有?；悄懰徕c的培養(yǎng)基中的菌落狀態(tài)如圖4所示,隨著MRS培養(yǎng)基中牛磺膽酸鈉濃度的增加,L.plantarumST-Ⅲ生長逐漸變緩,且菌落形態(tài)逐漸減小,因此我們推測L.plantarumST-Ⅲ在含有?；悄懰徕cMRS培養(yǎng)基中細(xì)胞生長速率的下降可能與其膽鹽耐受性較差有關(guān)。從不同菌株的細(xì)胞生長情況來看,膽鹽水解酶的表達(dá)可能在某種程度上增加了細(xì)胞耐受膽鹽的水平,從而使得重組菌生長較對照有所提高。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),重組菌在含不同濃度牛磺膽酸鈉MRS平板上膽鹽耐受性無顯著差異(結(jié)果未顯示),原因有待進(jìn)一步研究。

圖4　L. plantarum ST-Ⅲ在不同濃度?；悄懰徕c的MRS平板中的菌落生長Fig.4　The colonial morphology of L. plantarum ST-Ⅲ in MRS plate with sodium注:A:MRS;B:MRS+0.05%?；悄懰徕c;C:MRS+0.1%?；悄懰徕c。

膽鹽水解酶的酶活性測定如表2所示。由表2可見,表達(dá)膽鹽水解酶的重組菌酶活較對照L.plantarumST-Ⅲ酶活性均有一定的提高,其中以表達(dá)BSH1的重組菌膽鹽水解酶酶活最高,為76.59 U/mL,是對照的2.25倍;其次是表達(dá)BSH3和BSH2重組菌,酶活性分別是對照的1.97和1.45倍,而以表達(dá)BSH4重組菌的酶活性最低,較對照提高了17%。由于L.plantarumST-Ⅲ本身具有膽鹽水解酶,因此所測定的膽鹽水解酶的酶活在某種程度上可能是酶活性的加和作用或有可能存在同工酶間的協(xié)同作用。任婧等[5-6]在大腸桿菌中表達(dá)植物乳桿菌ST-Ⅲ的4種膽鹽水解酶基因(bsh1～bsh4),并對其酶活力進(jìn)行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種BSHs均具有水解膽鹽的活力,酶活分別為29.00、20.49、24.90、21.13 U/mL,同時(shí)BSH1比其他3種BSHs表現(xiàn)出更高的水解能力。而在本研究中我們通過膽鹽水解酶基因在自身中的過表達(dá)和酶活測定也得到了類似的結(jié)果,推測BSH1可能確實(shí)在水解結(jié)合型膽鹽為非結(jié)合型膽鹽過程中起著較其他BSHs更為重要的作用。Lambert等[14]在缺失BSH基因的乳酸乳球菌中表達(dá)L.plantarumWCSF1的4種BSHs基因,其中BSH1活性最高,BSH2未檢測到酶活,BSH3和BSH4活性較低,且BSH4在?；撬峤Y(jié)合型底物中無活性。這與本研究中BSH4較低的酶活結(jié)果相吻合(對照膽鹽和BSH4水解酶活性分別為34.06、39.86 U/mL),因此我們推測ST-Ⅲ/bsh4較低的酶活可能與測定底物有關(guān)。另外,任婧和Lambert等[5-6,14]的研究均顯示BSH3具有較其他膽鹽水解酶更高的蛋白表達(dá)量,推測ST-Ⅲ/bsh3較高的酶活可能與此有關(guān)。有些研究表明,細(xì)胞的膽鹽耐受性與膽鹽水解酶的活性沒有直接關(guān)系[15-16],這可能與酶活的測定方法不同所致,如實(shí)驗(yàn)條件和所選擇的底物(如甘氨酸結(jié)合膽鹽或牛磺酸結(jié)合膽鹽)等[16]。

表2　膽鹽水解酶活性的測定

3　結(jié)論

膽鹽水解酶是植物乳桿菌降膽固醇的主要機(jī)理之一,通過膽鹽水解酶的作用,同化或沉淀膽鹽,以起到降低膽固醇的目的。目前多種微生物中膽鹽水解酶已得到純化和分離,如乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、梭狀芽孢桿菌、類桿菌和鏈球菌等[17],也有越來越多的學(xué)者利用基因工程技術(shù),將有關(guān)編碼膽鹽水解酶的基因轉(zhuǎn)入到適當(dāng)?shù)乃拗骶羞M(jìn)行誘導(dǎo)和表達(dá),如大腸桿菌,以獲取高產(chǎn)量的酶蛋白質(zhì)產(chǎn)品。但由于大腸桿菌中重組蛋白BSH主要以包涵體的形式存在,因此影響了膽鹽水解酶機(jī)理的研究。本研究通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了4種膽鹽水解酶在L.plantarumST-Ⅲ的過表達(dá),與對照L.plantarumST-Ⅲ相比,重組菌在含有0.05%牛磺膽酸鈉的MRS培養(yǎng)基中細(xì)胞生長均有不同程度的提高,這可能與BSHs的表達(dá)提高了L.plantarumST-Ⅲ的膽鹽耐受性有關(guān)。通過茚三酮顯色法測定了表達(dá)4 種BSHs重組菌的酶活,結(jié)果顯示ST-Ⅲ/bsh1酶活最高,為76.59 U/mL,是對照的2.25倍;其次是重組菌ST-Ⅲ/bsh3和ST-Ⅲ/bsh2,酶活性分別是對照L.plantarumST-Ⅲ的1.97和1.45倍,而以ST-Ⅲ/bsh4重組菌的酶活性最低,較對照僅提高了17%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們推測BSH1可能具有較其他三種BSHs更高的水解膽鹽的能力,其次為BSH3,而BSH2和BSH4在L.plantarumST-Ⅲ中對?；撬峤Y(jié)合膽鹽的水解能力較弱。

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Gene expression of the bile salt hydrolase inLactobacillusplantarumST-Ⅲ

HUANG Yan-na1,BI Xue-wei2,YOU Chun-ping1,*

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Dairy Research Institute,Bright Dairy & Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Bile salt hydrolase(BSH),the enzyme deconjugating bile potentially plays an important role in reduction of blood cholesterol level,which has received a widespread attention. In this study,the recombinantLactobacillusplantarumST-Ⅲ were constructed by overexpressing four BSH genes and the BSH enzyme activities were determined. The result showed thatL.plantarumST-Ⅲ harboring BSH1 had a higher enzyme activity than the other three strains,then was the strains harboring BSH3 and BSH2,and the lowest activity was shown in ST-Ⅲ overexpressing BSH4,which indicated that the BSH1 might play a more important role in the hydrolysis of the conjuncted bile salts,then was BSH3,BSH2 and BSH4 successively.

Bile salt hydrolase;LactobacillusplantarumST-Ⅲ;gene clone and overexpression;enzyme activity

2015-12-02

黃艷娜(1980-)，女，博士，工程師，研究方向：益生菌代謝工程及代謝調(diào)控，E-mail:huangyanna@brightdairy.com。

游春蘋(1981-)，女，博士，高級工程師，研究方向：益生菌功能，E-mail:youchunping@brightdairy.com。

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2013BAD18B01, 2013BAD18B02)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.015