王　榕,宮　莉,姚　斌,薛鮮麗,羅會(huì)穎,張永杰,蘇小運(yùn),*

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081)

?

利用RNAi抑制cre1基因轉(zhuǎn)錄提高里氏木霉表達(dá)纖維素酶

王榕1,2,宮莉2,姚斌2,薛鮮麗2,羅會(huì)穎2,張永杰1,*,蘇小運(yùn)2,*

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081)

本研究采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)對(duì)里氏木霉主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子cre1基因的表達(dá)進(jìn)行抑制,以期提高里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力。通過PCR,從里氏木霉的基因組中擴(kuò)增得到cbh1啟動(dòng)子、反向的cre1基因片段(568～963 bp)、正向的cre1基因片段(655～961 bp)和cbh2終止子,利用DNA assembler方法將這些基因連接到pRS424質(zhì)粒上,構(gòu)建成pCre1-i質(zhì)粒。再將RNAi盒分作兩個(gè)片段擴(kuò)增,同時(shí)轉(zhuǎn)化里氏木霉并通過PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。搖瓶發(fā)酵顯示其中一株轉(zhuǎn)化子在纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4.5 d后,其纖維素酶的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活和CBHI酶活為0.67、3.70和0.46 U/mL,較出發(fā)菌株分別提高了1.3、1.8和5.6倍。通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化子中cre1基因的轉(zhuǎn)錄水平比出發(fā)菌株降低了43%。

cre1,RNAi,纖維素酶,DNA assembler

纖維素酶作為自然界中數(shù)量最大的可再生資源,在制酒、醬油釀造、飲料加工等食品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1]。目前,報(bào)道的主要產(chǎn)纖維素酶的菌株多為真菌[2]。其中,里氏木霉因其表達(dá)能力強(qiáng)(工業(yè)上,經(jīng)改造后的里氏木霉,其產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量可達(dá)到100 g/L以上[3])、易于培養(yǎng)和符合“一般公認(rèn)安全”等優(yōu)點(diǎn),在工業(yè)表達(dá)酶基因、尤其是纖維素酶上得到了極大的應(yīng)用。里氏木霉的纖維素酶系包括兩個(gè)外切纖維素酶、五個(gè)內(nèi)切纖維素酶、一個(gè)β-葡萄糖苷酶和六個(gè)裂解性多糖單加氧酶[4-5]。

cre1是里氏木霉的一個(gè)廣域的轉(zhuǎn)錄抑制因子,能調(diào)節(jié)大部分纖維素酶甚至半纖維素酶基因的表達(dá)[6]。在里氏木霉主要的纖維素酶和木聚糖酶基因上,都或多或少的存在著cre1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[7]。雖然cre1的主要作用是轉(zhuǎn)錄抑制因子,但完全敲除cre1基因,在以微晶纖維素做唯一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí),產(chǎn)酶水平低于野生型菌株的最大產(chǎn)酶水平,意味著cre1還具有一定的轉(zhuǎn)錄激活作用[8]。因此,對(duì)cre1基因的調(diào)控,不能簡(jiǎn)單的采取基因敲除的策略,而應(yīng)該采取抑制其表達(dá)的策略。RNA干擾(RNAi)技術(shù)提供了一種快速、有效抑制目的基因表達(dá)的方法[9]。受到RNAi的受體菌株,其被調(diào)控基因呈現(xiàn)從高到低的一系列表達(dá)水平,與基因敲除在性狀上呈現(xiàn)有或無(wú)不同,其具有連續(xù)性。

本研究采取RNAi技術(shù)對(duì)cre1基因進(jìn)行干擾調(diào)節(jié),期望能提高受體菌株產(chǎn)纖維素酶的水平,為利用RNAi技術(shù)對(duì)里氏木霉進(jìn)行遺傳改造構(gòu)建高效表達(dá)的菌株提供新的思路,同時(shí)為纖維素酶在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供可能性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

里氏木霉QM9414(ATCC 26921)和Tu6ΔtKU70(ATCC MYA-256,尿嘧啶缺陷菌株)[10]均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所董志揚(yáng)教授饋贈(zèng)。pEASY-T3質(zhì)粒購(gòu)于全式金;質(zhì)粒pRS424為本實(shí)驗(yàn)室保存,用作質(zhì)粒骨架構(gòu)建。pCre1-i重組質(zhì)粒(pRS424-armL-cbh1p-cre1f-cre1r-cbh1t-pyrG-armR,圖1)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

里氏木霉生長(zhǎng)培養(yǎng)基:(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO415.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,CaCl2·2H2O 0.6 g/L,CoCl2·6H2O 0.0037 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,ZnSO4·7H2O 0.0014 g/L,MnSO4·H2O 0.0016 g/L,葡萄糖20 g/L,自然pH。

里氏木霉纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基:(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO415.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,CaCl2·2H2O 0.6 g/L,CoCl2·6H2O 0.0037 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,ZnSO4·7H2O 0.0014 g/L,MnSO4·H2O 0.0016 g/L,微晶纖維素Avicel(購(gòu)自Sigma公司)20 g/L,自然pH。

色氨酸(Trp)缺陷型培養(yǎng)基:YNB 6.7 g/L,葡萄糖 20 g/L,Trp Do supplement(購(gòu)自Clontech)0.64 g/L,瓊脂粉 20 g/L。

T100TM普通PCR儀、CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和212PRO凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;CR22GШ立式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本HITACHI公司;移液槍購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;CT6E臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本HITACHI公司;SPECORD200PLUS紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器公司;H1MFDG酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek儀器有限公司;SPX-250生化培養(yǎng)箱購(gòu)自北京利康達(dá)圣科技術(shù)發(fā)展有限公司;ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pCre1-i質(zhì)粒的構(gòu)建以里氏木霉QM9414基因組為模板,利用引物ParmL(SR)F1/R1、PpyrG(SR)F1/R1、ParmR(SR)F1/R1(表1)擴(kuò)增獲得armL、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)和armR。armL和armR片段分別作為在里氏木霉里進(jìn)行同源重組的左臂和右臂,pyrG基因作為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選標(biāo)記基因。并同時(shí)引進(jìn)NotI和EcoR I酶切位點(diǎn)。利用引物Pcbh1P(SR)F1/R1、Pcre1(SR)F1/R1、Pcre1(SR)F2/R2、Pcbh2t(SR)F1/R1,擴(kuò)增獲得cbh1啟動(dòng)子、反向的cre1基因(cre1r)568～963 bp片段、正向的cre1基因(cre1f)655～961bp片段以及cbh2終止子并同時(shí)引入KpnI和EcoR I酶切位點(diǎn)。將pRS424質(zhì)粒用EcoR I酶切,電泳、回收線性化質(zhì)粒載體。將其與armL、pyrG、armR按1∶3∶3∶3的摩爾比用氯化鋰法共同轉(zhuǎn)化釀酒酵母AH109的感受態(tài)細(xì)胞,采用DNA assembler方法進(jìn)行拼接[11]。DNA assembler利用釀酒酵母的高效同源重組機(jī)制,能快速的將多個(gè)具有相同核苷酸末端(重疊區(qū)長(zhǎng)度需要大于30 bp)的DNA片段在體內(nèi)一次性和線性化的質(zhì)粒拼接起來。同樣的方法將EcoRI酶切的pRS424質(zhì)粒與cbh1啟動(dòng)子、反向的cre1基因、cbh2終止子DNA片段,共轉(zhuǎn)化釀酒酵母AH109的感受態(tài)細(xì)胞,涂布在色氨酸(Trp)缺陷型培養(yǎng)基上,30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。對(duì)酵母菌落做菌落PCR,以鑒定是否已經(jīng)成功構(gòu)建pRS424-armL-pyrG-armR和pRS424-cbh1p-cre1f-cbh2t重組質(zhì)粒。將PCR鑒定為陽(yáng)性的酵母菌落挑取并接種于3 mL YPD培養(yǎng)基上,30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1感受態(tài)細(xì)胞(全式金,北京),涂布于含100 μ g/mL氨芐的LB瓊脂平板上,37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。挑取單克隆菌落,接種于3 mL LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐)中,37 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒。

隨后,用KpnI和EcoRI雙酶切pRS424-cbh1p-cre1r-cbh2t,同時(shí)將用PCR擴(kuò)增所得到的正向的cre1基因用KpnI和EcoR I雙酶切,將回收質(zhì)粒和正向的cre1基因用T4連接酶(TaKaRa公司)連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1感受態(tài)細(xì)胞,篩選重組質(zhì)粒pRS424-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t(圖1)。利用引物Pcbh1P(SR)F3/Pcbh2t(SR)R3從重組質(zhì)粒pRS424-cbh1p-cre1反-cre1正-cbh2t上擴(kuò)增獲得cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t片段。

最后,將pRS424-armL-pyrG-armR重組質(zhì)粒用EcoR I酶切,與上一步獲得的cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t片段用DNA assembler法進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。經(jīng)驗(yàn)證正確后,最終將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒pCre1-i(圖1)。

表1　本研究所用引物

1.2.2里氏木霉的轉(zhuǎn)化用ParmLF2/PpyrGR2和Pcbh2tF2/ParmRR2(表1)引物對(duì)分別從重組質(zhì)粒pCre1-i上擴(kuò)增armL-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t-pyrG和cbh2t-pyrG-armR片段。在1%瓊脂糖膠上電泳,切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶,純化DNA備用。

將里氏木霉TU6ΔtKU70接種于土豆培養(yǎng)基(PDA)平板上,30 ℃靜置培養(yǎng)7 d待其產(chǎn)孢,將孢子刮下并接種于100 mL MM-glucose培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)過夜。在12層紗布上過濾收集萌發(fā)的菌絲,加入10 mg/mL的Lysing enzymes(購(gòu)自Sigma公司),在30 ℃消化1～2 h。收集原生質(zhì)體,將armL-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t-pyrG和cbh2t-pyrG-armR片段混合,以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將兩種DNA同時(shí)轉(zhuǎn)入里氏木霉TU6ΔtKU70菌株。每微克DNA可獲得約10個(gè)轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子中同時(shí)含有兩種DNA的轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化效率為80%。

1.2.3重組轉(zhuǎn)化子的篩選轉(zhuǎn)化子在含1 mol/L山梨醇的MM-glucose瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和選擇。7 d后,挑取單個(gè)克隆,接種于MM-glucose培養(yǎng)基上進(jìn)行再次生長(zhǎng)、選擇。挑取單克隆接種于PDA平板上,30 ℃培養(yǎng)5～6 d。取部分菌絲,用UniversAll-tissue extraction PCR kit(YEASTERN,Taipei,Taiwan)提取基因組DNA,通過PCR驗(yàn)證cre1基因是否轉(zhuǎn)入以及兩片段是否發(fā)生重組并成功整合到里氏木霉基因組。PCR所用引物為Pcbh1P(SR)F1/YZ-pyrGR(表1)。

1.2.4轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)培養(yǎng)將出發(fā)菌株TU6ΔtKU70的孢子和各轉(zhuǎn)化子的孢子,接種2.0 mL 1×107/mL的孢子于100 mL MM-glucose培養(yǎng)基中。30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)1 d。將菌絲用12層紗布過濾,收集菌絲并用大量無(wú)菌水沖洗,以去除殘余的葡萄糖。

稱取等量(900 mg)的菌絲,接種于100 mL MM-Avicel液體培養(yǎng)基中,出發(fā)菌株和每個(gè)轉(zhuǎn)化子均做3個(gè)平行。30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)7 d以誘導(dǎo)纖維素酶的生產(chǎn)。從第3 d開始,每12 h收集發(fā)酵液,儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

1.2.5纖維素酶活測(cè)定纖維素酶濾紙酶活的測(cè)定:纖維素酶的濾紙酶活(FPase activity)采用Whatman一號(hào)濾紙,參照IUPAC標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定。濾紙酶活的單位定義為:1 mL液體酶,在50 ℃、pH4.8的條件下,每小時(shí)水解濾紙底物,產(chǎn)生1 mg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

外切纖維素酶活的測(cè)定:用4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside(MUC,Sigma)作底物,稱取45 mg MUC,溶于3 mL DMSO(Sigma),再將其轉(zhuǎn)移到42 mL檸檬酸緩沖液(pH5.2,20 mmol/L)中。將25 μL適當(dāng)稀釋的酶液和250 μL MUC、25 μL葡萄糖(1 mol/L)混合,此為不加纖維二糖實(shí)驗(yàn)組。在混合溶液中,葡萄糖會(huì)抑制BG降解MUC,因此,測(cè)得的活性實(shí)際為CBH1和EG的活性。同時(shí)設(shè)加纖維二糖實(shí)驗(yàn)組:25 μL酶液和200 μL MUC、25μL(50 mmol/L)纖維二糖和葡萄糖于50 ℃反應(yīng)10 min。加入纖維二糖會(huì)抑制CBH的活性,因此測(cè)得的是EG的活性,于50 ℃反應(yīng)10 min。加入250μL Na2CO3(1 mmol/L),于370 nm測(cè)定吸光度。將不加纖維二糖實(shí)驗(yàn)組OD值減去加纖維二糖實(shí)驗(yàn)組,即為外切纖維素酶較為特異的活性。一單位的外切纖維素酶酶活定義為每秒催化1 nmol/L MUC水解所需要的酶量。

內(nèi)切纖維素酶酶活測(cè)定:采用1%羧甲基纖維素鈉(CMC)作為底物進(jìn)行測(cè)定。取酶液62.5 μL,加入到175 μL磷酸—檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L、pH4.8)配制的CMC中,加水定容到250 μL。50 ℃,反應(yīng)1 h,測(cè)定酶活力。CMC酶活的單位定義為:1 mL液體酶,在50 ℃、pH4.8的條件下,每小時(shí)水解羧甲基纖維素鈉,產(chǎn)生1 mg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

β-葡萄糖苷酶酶活的測(cè)定:用pNP-Glucose(pNPG)為底物,取0.24 g pNPG用蒸餾水定容到50 mL,得到16 mmol/L的pNPG為底物。使用前-20 ℃避光保存。取50 μL已稀釋的酶液,加入15.625 μL pNPG和125.5 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0)用水定容到250 μL,pNPG終濃度為1 mmol/L,振蕩混勻。50 ℃水浴保溫1 h,迅速冷卻向各試管中加入750 μL Na2CO3試劑,再向空白中補(bǔ)加50 μL酶液,混合均勻。以0號(hào)管為參比,測(cè)定540 nm的吸光度。β-葡萄糖苷酶酶活的單位定義為:1 mL液體酶,在50 ℃、pH5.0的條件下,每小時(shí)水解pNPG,產(chǎn)生1 mg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

對(duì)出發(fā)菌株TU6ΔtKU70和轉(zhuǎn)化子,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶活,發(fā)現(xiàn)在4.5 d時(shí)纖維素酶的酶活最高。因此,選取4.5 d的發(fā)酵液,分別測(cè)定總體纖維素酶酶活(濾紙酶酶活)及各分解酶酶活包括內(nèi)切纖維素酶酶活(CMC酶活)、外切纖維素酶CBHI的酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活(BG酶活)。

1.2.6cre1的轉(zhuǎn)錄豐度測(cè)定出發(fā)菌株與重組菌株先接種2.0 mL 1×107/mL的孢子于100 mL MM-glucose培養(yǎng)基中。30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)1 d。稱取等量濕重(900 mg)的菌絲,接種于100 mL MM-纖維素液體培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)2 d以誘導(dǎo)纖維素酶的生產(chǎn)。收集誘導(dǎo)后第2 d的菌絲,在濾紙上壓干菌絲,進(jìn)行研磨并提取總RNA。將所提取總RNA用ReverTra Ace-α-試劑盒(TOYOBO,日本)處理,將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物,以actin 基因作為內(nèi)參,q-cre1F/q-cre1R為引物(表1),1 μg cDNA為模板,按TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金.北京)試劑盒進(jìn)行操作,比較轉(zhuǎn)化子和對(duì)照株中cre1轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)豐度。

1.3數(shù)據(jù)處理方法

所有結(jié)果均釆用Excel和SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件中One-Way ANOVA過程進(jìn)行方差及其顯著性分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1pCre1-i質(zhì)粒構(gòu)建及重組子的鑒定

按1.2.1的方法,構(gòu)建了pCre1-i質(zhì)粒(圖1),并通過Not I酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功(圖3A)。通過ParmLF2/PpyrGR2和Pcbh2tF2/ParmR2(表1)引物對(duì)從重組質(zhì)粒pCre1-i擴(kuò)增獲armL-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t-pyrG和cbh1t-pyrG-armR片段,將兩個(gè)片段共轉(zhuǎn)化里氏木霉TU6ΔtKU70(圖2)。所采用的宿主菌為ku70基因敲除株,并且用于轉(zhuǎn)化的兩個(gè)片段間設(shè)計(jì)了1 kb的重疊片段,因此,預(yù)期兩個(gè)片段可以重組在一起,并在左、右重組臂(armL和armR)的介導(dǎo)下,整合到里氏木霉基因組的ku70座位上。cbh1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)含反、正cre1基因片段的轉(zhuǎn)錄,mRNA在細(xì)胞內(nèi)形成發(fā)夾狀RNA并在Dicer的作用下形成小分子RNA并最終使降解目的基因cre1的mRNA降解(圖2)。設(shè)計(jì)一對(duì)引物Pcbh1P(SR)F1和YZ-pyrGR(表1),PCR驗(yàn)證是否armL-cbh1p-cre1反-cre1正-cbh2t-pyrG和cbh2t-pyrG-armR片段已成功整合(圖3B)。從圖3B可以看出,六個(gè)轉(zhuǎn)化子均有3 kb左右的特異擴(kuò)增條帶,與預(yù)期條帶大小一致,而以出發(fā)菌株做模板則沒有此條帶,說明兩個(gè)DNA片段已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入里氏木霉TU6ΔtKU70并整合在一起。

圖1　pCre1-i質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1　The diagram for pCre1-i plasmid construction

圖2　通過RNAi抑制里氏木霉cre1的表達(dá)示意圖Fig.2　The schematic diagram of inhibiting cre1 expression by RNAi

圖3　PCR鑒定目的片段是否插入里氏木霉基因組Fig.3　Identification of positive Trichoderma reesei transformantswith the target fragment by PCR注:A:pCre1-i質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:未酶切pCre1-i質(zhì)粒;2:Not I酶切后的pCre1-i質(zhì)粒。B:PCR驗(yàn)證RNAi片段重組入里氏木霉基因組。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:出發(fā)菌株TU6ΔtKU70;2-7:各轉(zhuǎn)化子。

2.2纖維素酶活測(cè)定

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn),從6個(gè)轉(zhuǎn)化子中選擇一株酶活最高的2號(hào)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行詳細(xì)的纖維素酶酶活測(cè)定。分別以濾紙、CMC、MUC和pNPG為底物測(cè)定出發(fā)菌株和2號(hào)轉(zhuǎn)化子的總體纖維素酶酶活、內(nèi)切纖維素酶酶活、外切纖維素酶CBHI酶活以及β-葡萄糖苷酶的酶活。從圖4可看出,2號(hào)轉(zhuǎn)化子的總體纖維素酶活是TU6ΔtKU70的1.3倍,說明轉(zhuǎn)化子較出發(fā)菌株,其纖維素酶酶活有顯著提高。與出發(fā)菌株相比,該轉(zhuǎn)化子的內(nèi)切纖維素酶活性提高極為顯著,為出發(fā)菌株的1.8倍(圖4)。外切纖維素酶CBHI活性也有一定程度的提高,2號(hào)轉(zhuǎn)化子的CBHI酶活是出發(fā)菌株的5.6倍(圖4)。但對(duì)β-葡萄糖苷酶而言,轉(zhuǎn)化子的酶活與TU6ΔtKU70相比下降了65%(圖4)。

圖4　轉(zhuǎn)化子2與出發(fā)菌株TU6ΔtKU70酶活比較Fig.4　Comparison of enzyme activities of Transformant No. 2 with those of the parent strain TU6ΔtKU70

2.3cre1的表達(dá)差異研究

將出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)化子取等量濕重菌絲,用MM-纖維素培養(yǎng)基30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。提取48 h的RNA并反轉(zhuǎn)獲得cDNA,通過熒光定量PCR(q-PCR),以actin基因?yàn)閮?nèi)參,對(duì)cre1轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。熒光定量 PCR 結(jié)束后,通過 IQ5 軟件自動(dòng)分析得出目的基因和內(nèi)參基因的Ct值,采用2-ΔΔCT方法,比較轉(zhuǎn)化子和對(duì)照株中cre1基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度。結(jié)果顯示,與TU6ΔtKU70相比,轉(zhuǎn)化子cre1表達(dá)量下降了43%(圖5)。這說明正如預(yù)期的一樣,cre1的表達(dá)得到了一定程度的抑制,從而提高了里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力。

圖5　出發(fā)菌株TU6ΔtKU70與轉(zhuǎn)化子2中cre1的轉(zhuǎn)錄豐度比較Fig.5　Comparison of the transcript abundance of cre1 between the parent strain TU6ΔtKU70and Transformant No. 2注:A:cre1和看家基因actin的擴(kuò)增曲線。B:cre1的轉(zhuǎn)錄豐度比較。

3　結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道,目前已經(jīng)有30多種絲狀真菌中可以應(yīng)用RNA干擾技術(shù)[12],這種技術(shù)對(duì)于某些重要的管家基因的功能研究來講是一種很理想的工具,在里氏木霉里也曾經(jīng)得到過成功應(yīng)用。例如,將cbh1基因的表達(dá)進(jìn)行RNAi的抑制,可以提高外源基因黑曲霉脂酶在里氏木霉里的分泌表達(dá)[13]。通過RNAi,成功將cre1基因的表達(dá)進(jìn)行下調(diào),證明RNAi可用于對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。相應(yīng)的,與出發(fā)菌株相比,2號(hào)轉(zhuǎn)化子的總體纖維素、內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶的酶活均有明顯的提高,將有利于纖維素酶在食品工業(yè)更為廣泛和深入的應(yīng)用。其中,CBHI的活性提高了5.6倍。有意思的是,β-葡萄糖苷酶的活性下降了。里氏木霉的β-葡萄糖苷酶活性來自于bgl1基因,和cbh1啟動(dòng)子有4個(gè)功能性的cre1結(jié)合位點(diǎn)不同,雖然bgl1啟動(dòng)子上也有1個(gè)可能的cre1結(jié)合位點(diǎn),但看起來bgl1的表達(dá)并不受cre1基因的調(diào)節(jié)抑制,這也許可以解釋在2號(hào)轉(zhuǎn)化子中,β-葡萄糖苷酶的活性的原因。

在構(gòu)建RNAi載體時(shí),我們選用了DNA assembler的方法[11],在釀酒酵母AH109中,進(jìn)行體內(nèi)重組以將各目的片段拼接起來。與常規(guī)依賴于限制性酶切和連接酶連接不同,它是利用同源重組的方法使具有同源末端的片段連接起來,能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)片段的連接,大大提高了構(gòu)建復(fù)雜、含多個(gè)基因片段載體的效率。另外,我們?cè)跇?gòu)建好質(zhì)粒載體pCre1-i后,通過PCR將cre1基因的RNAi盒以及兩側(cè)的同源重組臂分作兩個(gè)片段PCR擴(kuò)增出來,并同時(shí)轉(zhuǎn)化里氏木霉,獲得了在里氏木霉細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)片段重組在一起的菌株。因此,這還為以后將多個(gè)基因片段(如合成生物學(xué)研究中的代謝途徑中的多個(gè)基因)轉(zhuǎn)化入里氏木霉里并在其中進(jìn)行同源重組打下了良好的基礎(chǔ)。

[1]趙國(guó)萍,李迎秋.纖維素酶的研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)的應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵,2015,(2):37-40.

[2]張加春,王權(quán)飛,余尊祥.里氏木霉的纖維素酶產(chǎn)生條件研究[J].食品與發(fā)醉工業(yè),2003,(03):21-23.

[3]Su X,Schmitz G,Zhang M,et al. Heterologous gene expression in filamentous fungi[J]. Advances in Applied Microbiology,2012,81(1):1-61.

[4]Martinez D,Berka RM,Henrissat B,et al. Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei(syn. Hypocrea jecorina)[J]. Nature Biotechnology,2008,26(5):553-560.

[5]Hakkinen M,Arvas M,Oja M,et al. Re-annotation of the CAZy genes of Trichoderma reesei and transcription in the presence of lignocellulosic substrates[J]. Microbial Cell Factories,2012,11:134.

[6]Strauss J,Mach RL,Zeilinger S,et al. The carbon catabolite repressor protein from Trichoderma reesei[J]. FEBS Letters,

1995,376(1-2):103-107.

[7]蘇小運(yùn).嵌合體轉(zhuǎn)錄激活因子增強(qiáng)里氏木霉的纖維素酶、半纖維素酶和其它基因轉(zhuǎn)錄的研究.[D]北京:中國(guó)科學(xué)院博士論文,2009.

[8]Portnoy T,Margeot A,Seidl-Seiboth V,et al. Differential regulation of the cellulase transcription factors XYR1,ACE2,and ACE1 in Trichoderma reesei strains producing high and low levels of cellulase[J].Eukaryotic Cell,2011,10(2):262-271.

[9]Su X,Qin L,and Dong Z. Chapter 15-RNAi-Mediated Gene Silencing in Trichoderma:Principles and Applications//Biotechnology and Biology of Trichoderma[M]. Waltham,USA:Elsevier,2014:215-226.

[10]Guangtao Z,Hartl L,Schuster A,et al. Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocrea jecorina[J]. Journal of Biotechnology,2009,139(2):146-151.

[11]Shao Z,Zhao H. DNA assembler,aninvivogenetic method for rapid construction of biochemical pathways[J]. Nucleic Acids Research,2009,37(2):e16.

[12]Kuck U,Hoff B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2010,86(1):51-62.

[13]Qin L,Cai F,Dong X,et al. Improved production of heterologous lipase in Trichoderma reesei by RNAi mediated gene silencing of an endogenic highly expressed gene[J]. Bioresource Technology,2012,109:116-122.

Improving cellulase expression ofTrichodermareeseiby RNAi-mediated repression ofcre1 transcription

WANG Rong1,2,GONG Li2,YAO Bin2,XUE Xian-li2,LUO Hui-ying2,ZHANG Yong-jie1,*,SU Xiao-yun2,*

(1.School of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 03006,China;2.Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture,Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

The RNA interference(RNAi)technique was used to repress the expression of the main transcriptional repressorcre1 in order to improve the cellulase production ofTrichodermareesei. Thecbh1 promoter,a reversedcre1 gene fragment(568～963 bp),an ordinarycre1 gene fragment(655～961 bp),andcbh2 terminator were all amplified from the genomic DNA ofT.reeseiby polymerase chain reaction(PCR). The DNA assembler method was used to assemble all these gene fragments in pRS424 to obtain the pCre1-i plasmid. Two fragments encompassing the RNAi cassette were amplified from the plasmid and transformed simultaneously intoT.reesei. PCR was used to verify the positive colonies. In the flask batch culture,one of the transformants displayed 0.67、3.70 and 0.46 U/mL for the filter paper cellulase,endoglucanase,and CBHI activity,which were 1.3,1.8,and 5.6 folds of the parent strain. By using RT-qPCR,the transcript level ofcre1 in this transformant was determined to be lowered to 43% of that of the parent strain.

cre1;RNAi;cellulase;DNA assembler

2015-12-02

王榕(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學(xué),E-mail:wangrong109@163.com。

蘇小運(yùn)(1979-),男,博士,研究員,研究方向:絲狀真菌基因工程,E-mail:suxiaoyun@caas.cn。

張永杰(1979-),男,博士,教授,研究方向:微生物進(jìn)化生物學(xué)與分子生態(tài)學(xué),E-mail:zhangyj2008@sxu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31400067);中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.031