王宗麗　沈艷玲　張?jiān)弧「督饾O立元

[摘要]目的 局灶性腦缺血后產(chǎn)生各種類型的嗜酸性神經(jīng)元（ENs）。為了探討大鼠局灶性腦缺血后大腦皮質(zhì)中心區(qū)和周邊區(qū)ENs的形態(tài)學(xué)特征，及細(xì)胞死亡相關(guān)因子在ENs中的表達(dá)。方法 夾閉蒙古沙鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈制作前腦缺血模型，于3h至2周在顯微鏡下行ENs形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果 光鏡：細(xì)胞核輕度異常的ENs缺血3h后出現(xiàn)于中心區(qū)，12h后出現(xiàn)于周邊區(qū)，calcium、μ-calpain、GRP78和ubiquitin在該型ENs中呈陽(yáng)性。中心區(qū)，核固縮和胞體不規(guī)則萎縮的ENs缺血12h后達(dá)峰值，calcium、μ-calpain表達(dá)進(jìn)一步增高；核固縮和胞體極度萎縮的ENs 4d后達(dá)峰值，calcium、TUNEL染色呈陽(yáng)性。周邊區(qū)，ENs的胞體輕度萎縮，于1周后相繼呈現(xiàn)核固縮、核碎裂、核溶解，同時(shí)calcium、TUNEL染色呈陽(yáng)性。活化型caspase 3在中心區(qū)與周邊區(qū)的各型ENs中均呈陰性。電鏡：中心區(qū)，ENs的染色質(zhì)凝集成不規(guī)則團(tuán)塊狀，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空胞，核膜及胞膜均破裂。周邊區(qū)，ENs的染色質(zhì)凝集、碎裂呈不規(guī)則團(tuán)塊，最終均質(zhì)化，核膜邊界模糊，胞膜仍保持完整。結(jié)論局灶性腦缺血后ENs呈現(xiàn)了兩種死亡途徑：缺血中心區(qū)核固縮伴胞體極度萎縮；周邊區(qū)核溶解伴胞體輕度萎縮。ENs不同形態(tài)學(xué)的改變與不同細(xì)胞死亡相關(guān)因子的活化相對(duì)應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]calpam；嗜酸性神經(jīng)元；前腦缺血；梗死；蒙古沙鼠

[中圖分類號(hào)]R364.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2095-0616（2016）11-25-06

局灶性腦缺血導(dǎo)致兩種類型的形態(tài)學(xué)損傷：選擇性神經(jīng)元死亡和梗死。臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明選擇性神經(jīng)元死亡位于梗死灶的周邊部。嗜酸性神經(jīng)元（eosinophilic neurons，ENs）是神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的一種形式，呈均勻一致的嗜酸性胞質(zhì)染色及細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解，常位于梗死的周邊區(qū)。我們的研究顯示：皮質(zhì)高密度ENs區(qū)域進(jìn)展為梗死，而低密度ENs區(qū)域進(jìn)展為選擇性神經(jīng)元死亡。不僅ENs的細(xì)胞核發(fā)生固縮、碎裂、溶解，細(xì)胞體也從萎縮進(jìn)展為腫脹。因此，腦缺血后出現(xiàn)各種形態(tài)的ENs，可能反映了不同的缺血程度、時(shí)間經(jīng)過(guò)或細(xì)胞死亡機(jī)制。

谷氨酸的異常大量釋放及其誘發(fā)的鈣內(nèi)流是神經(jīng)元缺血性損傷的上游通路，細(xì)胞壞死是缺血后細(xì)胞死亡的主要機(jī)制，而由caspase家族調(diào)控的細(xì)胞凋亡也被報(bào)道出現(xiàn)在腦缺血模型中。此外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)異常降解、依賴ATP的泛素一蛋白酶體功能障礙也可能參與了缺血后神經(jīng)元死亡。

我們使用梗死灶呈緩慢進(jìn)展的沙鼠局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，探討局灶性腦缺血后大腦皮質(zhì)ENs的形態(tài)學(xué)特征及細(xì)胞死亡相關(guān)因子在中心區(qū)與周邊區(qū)ENs中的表達(dá)。

1材料與方法

1.1一般材料

異氟醚（安耐吉化學(xué)）；二乙醚（上海麥克林生化科技有限公司）；多聚甲醛（北京索萊寶生物科技有限公司）；PBS緩沖液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；山羊血清（北京索萊寶生物科技有限公司）；茜素紅（AMR，Solon，Ohio，USA；1%）；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；鋨酸磷酸鹽緩沖液（廣州競(jìng)贏化工科技有限公司）；檸檬酸鉛（安耐吉化學(xué)）；乙酸雙氧鈾（成都麥卡希化工有限公司）；壞死相關(guān)蛋白酶抗體—mouseanti-μ-calpain（Chemicon；1：500稀釋）；細(xì)胞凋亡因子抗體—rabbit anti-actived caspase 3-p17（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA；1：500）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白抗體—mouse anti-GRP 78（Santa Cruz Bioteehnology；1：800）；蛋白質(zhì)降解標(biāo)志抗體—蛋白質(zhì)降解標(biāo)志物抗體—rabbit anti-ubiquitin（Dako Cytomation，Glostrup，DK；1：1000）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性蒙古沙鼠87只，16～20周齡，體重（66±6）g，購(gòu)自三共制藥（Sankyo，東京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)按照全國(guó)衛(wèi)生研究所制定的關(guān)愛(ài)和使用動(dòng)物用于研究的指導(dǎo)方針和學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型的制備 2%異氟醚麻醉，切開(kāi)左頸皮膚，分離左頸動(dòng)脈用小動(dòng)脈夾夾閉10min誘發(fā)腦缺血。在頸動(dòng)脈夾閉后進(jìn)行卒中指數(shù)（strokeindex，SI）評(píng)分（總分25分），見(jiàn)表1；SI≥10可進(jìn)展為腦梗死。為減少缺血性損傷的個(gè)體差異，我們選擇卒中指數(shù)14～17分（n=28）的動(dòng)物作為“缺血?jiǎng)游铩庇糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)，5h后以相同的處理方式再次使動(dòng)物缺血10min。兩次缺血處理比單次缺血處理動(dòng)物死亡率低。假手術(shù)組（n=4）以相同手術(shù)方式處理，但左側(cè)頸動(dòng)脈不夾閉。

1.3.2取材 在缺血后3、6、12、24h，4d，1、2周，動(dòng)物（每組4只）用二乙醚深度麻醉，4%緩沖多聚甲醛心內(nèi)灌注固定。腦組織切成3個(gè)序列冠狀切面：A面（前囟前0.5mm）、B面（前囟后1.5mm）、C面（前囟后3mm）。常規(guī)石蠟包埋切片（4μm），HE染色光鏡下觀察ENs的形態(tài)和分布。

1.3.3 ENs的定義 ENs是腦缺血后出現(xiàn)的胞質(zhì)嗜酸性及細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解的神經(jīng)元。缺血急性期部分ENs的細(xì)胞核異常伴胞漿嗜酸性，細(xì)胞體由腫脹至萎縮、由圓形至不規(guī)則。ENs根據(jù)形態(tài)學(xué)特征分為6種類型見(jiàn)表2：核輕度異常和胞體腫脹（圖1C、G、H，箭頭）；核固縮和胞體不規(guī)則萎縮（圖1D，箭頭）；核固縮和胞體極度萎縮（圖1E，箭頭）；核固縮和胞體輕度萎縮（圖1H、I，楔形箭頭）；核碎裂和胞體輕度萎縮（圖1I，空白箭頭）；核溶解和胞體輕度萎縮（圖1T、J，箭頭）。

1.3.4形態(tài)定量分析 為了探究ENs在皮層的縱向分布，在前囟前0.5ram，旁2.5、5.7mm的冠狀面上定義ROIs區(qū)（regions nf interest，ROIs）一與腦皮質(zhì)表面垂直，寬0.5ram的條形區(qū)域（圖1B）。與我們的前期研究一致，缺血灶中心的正常組織進(jìn)展為梗死（圖1F），而周邊的組織進(jìn)展為選擇性神經(jīng)元死亡（圖1J），且缺血后2周持續(xù)存在。光鏡（×200）下計(jì)數(shù)ROIs區(qū)的ENs。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色 HE染色的切片脫色后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分析各型ENs中的細(xì)胞死亡相關(guān)因子。脫蠟進(jìn)行HE染色的切片，在顯微照片（×400）中記錄ROIs區(qū)ENs的形態(tài)學(xué)特征。然后用1%鹽酸和80%酒精處理脫去HE染色，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3.5.1鈣染色 脫去HE染色的切片浸入茜素紅處理10min，使蓄積的鈣顯色。

1.3.5.2 TUNEL染色 用于檢測(cè)DNA斷裂。脫去HE染色的切片用細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TUNEL染色。切片在蛋白消化酶液中孵育5min，37℃，PBS沖洗，加TdT反應(yīng)液孵育10min，37℃，PBS沖洗。再滴加3%H₂O₂室溫5min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。然后加過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗體液，10min，37℃，PBS沖洗，再滴加DAB液室溫5min。

未進(jìn)行HE染色與脫去HE染色的切片作對(duì)照以控制HE染色及脫色對(duì)免疫組織化學(xué)染色的影響。部分切片不加TdT酶進(jìn)行溫箱孵育，作為陰性對(duì)照。

1.3.6免疫染色細(xì)胞陽(yáng)性率 通過(guò)比較相同ROIs區(qū)的HE染色與HE染色脫色后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的顯微照片得到各型ENs免疫染色陽(yáng)性的百分?jǐn)?shù)，將其分為四種級(jí)別：76%～100%為（+++）、51%～75%為（++）、26%～50%為（+）、≤25%為（-）。

1.3.7透射電鏡切片制備 假手術(shù)組和腦缺血組動(dòng)物（每組4只）用4%多聚甲醛加5%戊二醛的0.1mol/L的PBS灌注取腦，腦組織浸入灌注液中，作冠狀切，從ROIs區(qū)獲取腦組織樣本。用1%鋨酸磷酸鹽緩沖液固定3h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋。制成超薄切片（100nm），檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色，透射電子顯微鏡觀察ENs的超微結(jié)構(gòu)特征。

2結(jié)果

2.1 ENs的定量分析

假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)ENs。缺血中心的ROI區(qū)（圖1K），核輕度異常和胞體腫脹的ENs缺血3h后出現(xiàn)，6h達(dá)峰值，12、24h后減少。核固縮和胞體不規(guī)則萎縮的ENs缺血6h后出現(xiàn)，12h達(dá)峰值，4d后減少。核固縮和胞體極度萎縮的ENs缺血24h后出現(xiàn)，4d達(dá)峰值，1周后減少。該型ENs區(qū)域2周后進(jìn)展為梗死（圖1A、F）。缺血周邊的ROI區(qū)（圖1L），核輕度異常和胞體腫脹的ENs缺血12、24h后出現(xiàn)。之后，核固縮、核碎裂、核溶解的ENs缺血24h、4d后相繼出現(xiàn)。核固縮、核碎裂的ENs缺血1、2周后減少，而核溶解的ENs進(jìn)一步增多。

2.2細(xì)胞死亡相關(guān)因子的表達(dá)

首先行HE染色，拍照記錄各型ENs，然后脫去HE染色，檢測(cè)細(xì)胞死亡相關(guān)因子在各型ENs的表達(dá)（表3，圖2）。

缺血中心區(qū)，核輕度異常和胞體腫脹的ENs表達(dá)calcium（64.5±9.4）%、μ-calpain（46.5±8.3）%、GRP 78（78.8±14.4）%、ubiquitin（75.7±11.6）%等細(xì)胞死亡相關(guān)因子。胞體不規(guī)則萎縮的ENs中calcium（91.4±7.2）%、μ-calpain（88.9±10.7）%的表達(dá)增高。胞體極度萎縮的ENs中calcium、TUNEL染色的陽(yáng)性率分別為（73.8±10.2）%、（85.4±7.5）%，而胞體不規(guī)則萎縮與胞體極度萎縮的ENs中活化型caspase 3均呈陰性。

周邊區(qū)，核輕度異常和胞體腫脹的ENs中也表達(dá)calcium（60.5±10.7%、GRP78（75.8±12.6%、ubiquitin（70.7±12.7）%等細(xì)胞死亡相關(guān)因子，但μ-calpain（8.1±4.4）%呈陰性。核固縮、核碎裂的ENs中鈣染色的陽(yáng)性率分別為（64.6±13.1）%、（47.9±13.4）%；TUNEL染色在兩種ENs中的陽(yáng)性率分別為（69.4±8.5）%、（71.6±9.4）%；而caspase 3（2.6±1.8）%、（4.5±3.5）%和μ-calpain（4.5±3.5）%、（3.6±3.3）%在兩種ENs中始終呈陰性。

2.3超微結(jié)構(gòu)特征

假手術(shù)組神經(jīng)元的細(xì)胞核、線粒體、糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及多聚核糖體的結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)均正常（圖3A）。

缺血中心區(qū)，核固縮和胞體極度萎縮的ENs缺血24h后出現(xiàn)，4d達(dá)峰值。缺血1d后可見(jiàn)大量不規(guī)則團(tuán)塊狀的染色質(zhì)凝集，胞質(zhì)出現(xiàn)大量難以識(shí)別的空胞。缺血4d后核膜（圖3B，箭頭）及胞膜（圖3B，楔形箭頭）均破裂。

周邊區(qū)，核碎裂和胞體輕度萎縮的ENs中可見(jiàn)碎裂、不規(guī)則的染色質(zhì)團(tuán)（圖3C，箭頭），胞質(zhì)密度增高，空胞結(jié)構(gòu)不清，核膜邊界模糊，而細(xì)胞質(zhì)保持完整。核溶解和胞體輕度萎縮的ENs染色質(zhì)均質(zhì)化，胞質(zhì)完整，內(nèi)有大量空胞（圖3D，箭頭），部分細(xì)胞器殘存（圖3D，楔形箭頭）。

3討論

研究表明，缺血中心區(qū)及周邊區(qū)神經(jīng)元的死亡機(jī)制呈多樣性，這與缺血后神經(jīng)元不同的形態(tài)學(xué)改變相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)ENs有兩種死亡途徑：缺血中心區(qū)核固縮伴胞體極度萎縮；周邊區(qū)核溶解伴胞體嗜酸性、輕度萎縮。還發(fā)現(xiàn)ENs不同的形態(tài)學(xué)改變與不同細(xì)胞死亡相關(guān)因子的活化相對(duì)應(yīng)。缺血后神經(jīng)元不可逆性損傷在光鏡下的特征為細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解伴胞漿紅染或失去對(duì)蘇木素的親和力。細(xì)胞壞死的兩種形態(tài)學(xué)改變?yōu)椋汉四ぜ鞍て屏?；核溶解而胞膜完整。缺血急性期ENs胞體萎縮、嗜酸性伴核固縮，晚期細(xì)胞核失去對(duì)蘇木素的親和力伴胞漿輕度紅染（鬼影細(xì)胞）。這些發(fā)現(xiàn)與我們觀察到的ENs核固縮伴胞體萎縮僅見(jiàn)于缺血中心區(qū)相一致。核輕度異常和胞體腫脹的ENs是中心區(qū)或周邊區(qū)最早出現(xiàn)的ENs。“腫脹細(xì)胞”具有類似的形態(tài)學(xué)改變：胞體腫脹、核正常而染色質(zhì)呈不規(guī)則團(tuán)塊狀，過(guò)去的研究稱之為“尼氏體溶解”。這些改變多見(jiàn)于急性期，如大鼠腦缺氧缺血后3～4h。

各型ENs出現(xiàn)的時(shí)序性顯示細(xì)胞從一種形態(tài)進(jìn)展到另一種形態(tài)。中心區(qū)核固縮和胞體不規(guī)則萎縮的ENs遲于核輕度異常和胞體腫脹的ENs出現(xiàn)，且calcium、μ-calpain表達(dá)進(jìn)一步增高，之后出現(xiàn)的核固縮和胞體極度萎縮的ENs呈TUNEL染色陽(yáng)性，這可能是損傷組織進(jìn)展為梗死前的最終變化。周邊區(qū)ENs在GRP78、ubiquitin染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)異常降解、依賴ATP的泛素-蛋白酶體功能障礙可能參與了缺血后周邊區(qū)ENs死亡。

在周邊區(qū)，許多研究依據(jù)活化型caspase 3、TUNEL染色陽(yáng)性推測(cè)缺血神經(jīng)元死亡的主要機(jī)制為細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果顯示大部分ENs在活化型caspase 3染色呈陰性（表3，圖2E、E），而我們使用的抗體檢測(cè)caspase 3的p17亞基，可區(qū)分細(xì)胞凋亡與非細(xì)胞凋亡。我們的結(jié)果表明caspase 3依賴的細(xì)胞凋亡途徑可能不是周邊區(qū)ENs死亡的主要機(jī)制。近期研究表明活化型caspase 3在成熟缺血腦組織中呈陰性，在未成熟大腦中呈陽(yáng)性。此外，在缺血中心區(qū)與周邊區(qū)多型ENs呈現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性，由于細(xì)胞壞死的最后階段發(fā)生DNA斷裂，TUNEL染色也可能陽(yáng)性，所以呈TUNEL染色陽(yáng)性的ENs不能證明一定發(fā)生細(xì)胞凋亡。

神經(jīng)元壞死有兩種超微形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞核腫脹、溶解，細(xì)胞膜破裂內(nèi)容物流出；細(xì)胞器腫脹，細(xì)胞萎縮。我們的研究顯示，在缺血中心區(qū)，神經(jīng)元變性的最后階段是核固縮和胞體極度萎縮的ENs，兼具兩種壞死的特點(diǎn)：染色質(zhì)凝集、碎裂伴細(xì)胞膜破裂。在周邊區(qū)，核固縮、核碎裂伴胞體輕度萎縮的ENs在HE染色凋亡樣改變，且TUNEL染色也呈陽(yáng)性，電鏡下進(jìn)一步可見(jiàn)凝集、不規(guī)則的染色質(zhì)團(tuán)。但定量分析表明核溶解和胞體輕度萎縮的ENs是周邊區(qū)神經(jīng)元死亡的最后階段。有早期研究提出，細(xì)胞死亡可能存在一個(gè)從凋亡（早期損傷）到壞死（晚期損傷）的過(guò)程。本研究結(jié)果提示，缺血周邊區(qū)ENs的死亡途徑是從凋亡到壞死。

總之，本研究表明，局灶性腦缺血后ENs有兩種死亡途徑：缺血中心區(qū)核固縮伴胞體極度萎縮；周邊區(qū)核溶解伴胞體輕度萎縮。ENs不同形態(tài)學(xué)的改變與不同細(xì)胞死亡相關(guān)因子的活化相對(duì)應(yīng)。