朱奎成，徐存拴，陳瑩瑩，王純耀，章金濤

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)　453007；2.鄭州大學(xué)實(shí)驗動物中心，鄭州　450052)

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Hr基因敲除小鼠模型的構(gòu)建和表型分析

朱奎成1,2，徐存拴1，陳瑩瑩2，王純耀2，章金濤2

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007；2.鄭州大學(xué)實(shí)驗動物中心，鄭州450052)

目的建立基因敲除小鼠以深入研究無毛基因(hairless,Hr)的功能。方法利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 技術(shù)，制備Hr基因敲除小鼠，觀察基因敲除小鼠毛發(fā)生長發(fā)育規(guī)律，并取部分皮膚組織石蠟切片，顯微鏡下分析結(jié)果。結(jié)果獲得一個在Hr基因編碼區(qū)86～87位有2個堿基缺失的首建鼠，產(chǎn)生了TGA終止密碼子。通過與野生型鼠雜交獲得陽性子代，進(jìn)行同窩交配，傳至第2代小鼠14 d開始脫發(fā)，30 d左右毛發(fā)脫凈，并終身保持無毛。皮膚組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)真皮內(nèi)形成大小不等的包囊。研究結(jié)果表明成功建立的Hr基因敲除小鼠表現(xiàn)出毛發(fā)生長異常。結(jié)論證明了無毛基因與毛發(fā)生長發(fā)育的密切關(guān)系，為研究Hr基因的精確功能提供了良好的動物模型。

無毛基因；基因敲除；小鼠；表型

脫發(fā)或稱禿發(fā)是一種常見的人類疾病。毛發(fā)生長和脫落的調(diào)節(jié)是一個高度復(fù)雜的過程，受到許多基因的調(diào)控[1]。尋找影響毛發(fā)生長和脫落的重量級因子，將為闡明毛發(fā)生長周期的調(diào)控機(jī)制，研發(fā)有效治療脫發(fā)性疾病的藥物提供新的思路和治療手段。無毛小鼠(hairless mice)是一種皮膚和被毛結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的小鼠，該種小鼠出生后第一次毛發(fā)生長正常，大約在14 d開始從頭部向尾部脫毛，正常情況下1周內(nèi)被毛全部脫凈，并終生保持無毛狀態(tài)，其表型類似于人的丘疹性無毛癥(papular atrichia)[2]，是皮膚病及毛發(fā)生長研究的良好實(shí)驗動物模型，由于無毛小鼠的無毛表型是因為一個被定位于14號染色體上的功能基因突變所致[3]，因此，該基因被命名為“無毛基因”(hairless gene，Hr)。近十年來，有關(guān)小鼠Hr基因等位自發(fā)突變動物的報道達(dá)16個之多，這些研究結(jié)果揭示了Hr基因突變與多樣化表型之間的復(fù)雜關(guān)系[4-5]，成為研究毛發(fā)生長脫落機(jī)制的重要實(shí)驗材料，但進(jìn)展緩慢。作者認(rèn)為，建立遺傳突變動物，進(jìn)一步分析無毛基因的精確功能和毛囊周期的調(diào)控途徑有助于探明Hr基因致脫發(fā)的發(fā)病機(jī)制，并為人的脫發(fā)、斑禿等毛發(fā)疾病研究提供重要的新線索。本研究利用 TALENs 技術(shù)建立了Hr基因敲除的小鼠模型提供基礎(chǔ)資料。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗動物

C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司 ( SCXK( 粵) 2013-0032)。飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實(shí)驗動物中心SPF級動物房，許可證號：SYXK(豫)2016-0002。飼料購自鄭州大學(xué)實(shí)驗動物中心，經(jīng)60Co輻照滅菌。

1.2TALENs 載體的構(gòu)建和體外轉(zhuǎn)錄

根據(jù)NCBI 上Hr基因序列，利用TALEN 在線設(shè)計工具( http://zifit.partners.org/ZiFiT//ChoiceMenu.aspx) 設(shè)計基因敲除位點(diǎn)。左右靶點(diǎn)的識別模塊經(jīng)golden gate 方法組裝完成后，克隆到載體上構(gòu)建成pRP[TALEN]-Hygro-CMV>22nt_TGTGAACGGCATTGT GGGACAG真核表達(dá)載體。線性化后，在T7 啟動子的作用下體外轉(zhuǎn)錄為mRNA注射到C57BL/6J的受精卵中，挑選注射后狀態(tài)良好的受精卵，移植到假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，待其自然生下F0代小鼠。

剪取經(jīng)原核注射產(chǎn)生的1周齡首建鼠的鼠尾組織，提取基因組DNA，利用引物擴(kuò)增目的片段，PCR 上游引物為：5′- CTCATGCTTTGTCCTTACCCTCC AG-3′，下游引物為：5′-CACCAGTGAGAGTGTGTCC TTGGG-3′，對擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，與C57BL/6J小鼠基因目的序列比對，分析靶點(diǎn)序列缺失情況。

1.3基因敲除小鼠繁殖及表型分析

顯微注射獲得F0代小鼠分別與野生型的C57BL/6J交配，對交配獲得的F1代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，分別建系。將來自同一只F0的陽性F1代小鼠同胞交配，可獲得F2代小鼠，對F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定。理論上F2代小鼠中25%的幾率為Hr-/-純合子小鼠。

出生后每天觀察小鼠被毛及皮膚形態(tài)的變化，詳細(xì)記錄。皮膚組織學(xué)觀察：動物頸椎脫臼法處死，取背部中央皮膚, 體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，脫水, 石蠟包埋, 切片，HE染色, 顯微鏡下觀察, 拍照。

2　結(jié)果

2.1Hr敲除小鼠的構(gòu)建及PCR 鑒定

根據(jù)小鼠Hr核酸序列信息，針對外顯子設(shè)計兩處相鄰的靶序列進(jìn)行TAL識別模塊構(gòu)建，將這兩個相鄰靶點(diǎn)識別模塊融合克隆到FokI 的N-末端，形成真核表達(dá)載體,原核注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，移植到假孕鼠子宮內(nèi)，共出生13只幼仔，剪取7日齡的鼠尾組織，提取基因組DNA，PCR 擴(kuò)增，測序與C57BL/6J小鼠基因序列比較，其中10#小鼠在Hr編碼區(qū)86～87位共2個堿基的缺失，產(chǎn)生了TGA終止密碼子(圖1)。

2.2基因敲除小鼠繁殖及表型初步分析2.2.1形態(tài)觀察：基因敲除小鼠出生后被毛生長正常，與有毛小鼠無法區(qū)分。大約2周左右，基因敲除純合子小鼠開始從背部開始脫毛(圖2 A)，然后延伸至頭頸部及尾部。1月齡時毛發(fā)基本脫落殆盡，僅保留極少分散毛發(fā)，皮膚為肉色偏紅, 皮膚薄，頭、頸部有較細(xì)的皮膚皺紋(圖2 B)，并隨年齡增長，皮膚變厚，顏色加深，更加松弛并終身保持無毛狀態(tài)。2.2.2組織學(xué)：14日齡敲除小鼠皮膚可見毛囊上部的毛管部寬大形成橢圓囊，毛囊解體，毛球部和毛乳頭滯留于真皮內(nèi)(圖3 A)。1月齡敲除小鼠皮膚小囊內(nèi)含一些角化碎屑樣物質(zhì)，真皮層中見幾排大小不等的包囊(圖3 B)。14日齡(圖3 C)和1月齡(圖3 D)對照小鼠真皮中見多量發(fā)育正常的毛囊。

A: -示堿基缺失部分；B: 上圖為正常C57BL /6J小鼠，下圖為基因敲除小鼠；箭頭示堿基缺失位點(diǎn)。圖1　測序結(jié)果序列比對圖(A)和測序圖(B)A: The short dotted lines represent the knockout bases. B: Sequence comparison and sequence map of different mice. The wild-type sequence is shown at the top. The arrow shows deletion sites.Fig.1　Sequence comparison and sequence map

A: 14日齡敲除小鼠全身毛發(fā)稀疏；B: 1月齡敲除小鼠毛發(fā)基本脫凈。圖2　轉(zhuǎn)基因小鼠脫毛規(guī)律及皮膚表型的變化A: Note the sparse hair at 14 days of age. B: Hair is almost completely missing at one month of age.Fig.2　Hair loss in the hr knockout mice and changes of the skin phrnotype

A: 14日齡敲除小鼠毛囊上部的毛管部寬大形成橢圓囊。B: 1月齡敲除小鼠真皮深層及皮下組織有幾排大小不等的包囊。C:14日齡C57BL /6J小鼠毛囊。D:1月齡C57BL /6J小鼠毛囊。圖3　基因敲除和C57BL /6J小鼠皮膚組織學(xué)觀察(HE，標(biāo)尺=100 μm)A: The widened hair canals of upper follicle form multiple utricles in a 14-day-old Hr knockout mice. B: Note the several rows of dermal cysts in a 1-month-old Hr knockout mouse. C: Normal hair follicles in a 14-day old control mouse. D: Hair follicles in a wild-type mouse developed normally at day 30.Fig.3　Histologic appearance of skin in the Hr knockout mice(HE，Bar=100 μm)

3　討論

無毛基因是一個多效基因，位點(diǎn)的突變，不僅造成完全和持久的無毛，而且還導(dǎo)致免疫與繁殖的異常(Ignatieva et al,1988)、淋巴瘤易感性的增高(Meier et al,1969)、二口惡英毒性敏感性的增加等[6]。到目前為止，無毛基因已發(fā)現(xiàn)了16個等位基因，如hairless(hrhr)突變、rhino(hrrh)突變、Hrrh-J突變、Hrrh-R突變等。不同等位基因間即具有共同特征，如程序化的脫毛方式，皮膚皺褶，育仔困難，免疫受損，真皮包囊出現(xiàn)等[7]。目前，通過建立轉(zhuǎn)基因動物模型來研究基因的生物學(xué)功能，已越來越普遍地被研究者所接受[8]?；蚯贸亲C明基因功能不可缺少的邏輯環(huán)節(jié)，是研究基因功能最直接有效的方法之一。TALEN 作為一種高效的基因編輯工具, 當(dāng)其在基因組上產(chǎn)生雙鏈斷裂后,可以通過NHEJ修復(fù)方式產(chǎn)生基因敲除[9]。

課題組采用用TALENs 技術(shù)構(gòu)建了Hr基因敲除小鼠，測序發(fā)現(xiàn)hr編碼區(qū)86～87位共2個堿基的缺失，產(chǎn)生了TGA終止密碼子。基因敲除小鼠生長發(fā)育觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠出生后14 d開始從頭頸部、背部、尾部開始脫毛，表現(xiàn)為稀毛特征，最后全身脫凈，并終生保持無毛狀態(tài)。皮膚組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)毛發(fā)生長缺陷，皮膚內(nèi)毛囊瓦解，并形成許多橢圓囊及真皮包囊,與無毛基因自發(fā)突變研究結(jié)果一致[10]。本研究敲除小鼠的獲得說明Hr基因影響了毛囊的正常生長發(fā)育，機(jī)理可能在于基因缺失致其基因產(chǎn)物-無毛蛋白的喪失，無毛蛋白是一個H3K9去甲基化酶，可通過直接控制其靶基因，調(diào)節(jié)表皮的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11]。利用本試驗建立的基因敲除小鼠模型，對深入了解Hr基因在毛發(fā)生長發(fā)育中表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，鑒別控制毛發(fā)生長的關(guān)鍵基因并研究它的作用機(jī)制，可能為最終揭開人類脫發(fā)的奧秘，發(fā)展有效治療藥物，解決毛發(fā)再生難題提供了有價值的材料。

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Construction of a Hr mutant knockout mouse model and phenotypic analysis

ZHU Kui-cheng1,2,，XU Cun-shuan1，WANG Chun-yao2，CHEN Ying-ying2，ZHANG Jing-tao2

(1. College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China;2. Laboratory Animal Center of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052)

ObjectiveTo establish aHrmutant knockout mouse model to study the function ofHrgene. Methods Transcription activator-like effector nucleases ( TALENs) technique was used to disrupt the mouseHrlocus，creating heritable mutations that eliminateHrfunction to explore the effects ofHron hair development and provide a good model to study the function of Hrgene．The phenotype of Hr-/-mice was observed after birth and skin histology of the transgenic mice was studied by light microscopy. ResultsIt was shown that a F0 mouse with the 2-bp deletion inHrgene ranging from 86 to 87 base pairs was obtained. The male mice with clear deletion of theHrfragment and with obvious frame shifting were mated with wild-type female mice, and F1mice were achieved．The heterozygous males mated with females to generate the F2homozygous mice. The first hair coat ofHr-/-mice developed normally. Beginning from 14 days after birth, however, there was a rapid hair loss. The mices were completely hairless except for a few vibrissae at 30 days. Histologically, two characteristic structures appeared, the utriculus and dermal cyst. ConclusionsThe results suggest thatHr-/-mice are successfully created using TALENs, and Hr is important for regulating hair development, which could explain at least in part the hair loss and be applied to study the mechanism of hair growth and development disorder.

Hr；Knockout；mouse；Phenotype

國家自然科學(xué)基金(編號：31372270)。

朱奎成(1975-)，男，在讀博士，副教授。研究方向：動物學(xué)。Email：kuicheng123@126.com。

1.徐存拴(1958-)，男，博士，教授，研究方向：細(xì)胞分化調(diào)控；2.章金濤(1968-)，男，博士，教授，研究方向：遺傳學(xué)。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0075-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.012

2016-04-04