鮑月寧　曹傳宇寧夏回族自治區(qū)固原市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏固原　756000

天麻素改善氯化鈷誘導(dǎo)大鼠缺氧性腦神經(jīng)元損傷的效果

鮑月寧曹傳宇
寧夏回族自治區(qū)固原市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏固原756000

目的 研究天麻素對氯化鈷誘導(dǎo)大鼠缺氧性腦神經(jīng)元損傷的修復(fù)作用，為缺血缺氧性腦損傷的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 取SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，原代培養(yǎng)7 d后按照培養(yǎng)皿編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、天麻素組及天麻素對照組，并實(shí)施相應(yīng)處理。觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)、神經(jīng)元相對活力、乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、EphA4表達(dá)的差異。結(jié)果 空白對照組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力顯著高于其他各組，模型組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力顯著低于天麻素組、天麻素對照組，天麻素組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力顯著低于天麻素對照組（P＜0.01）。模型組神經(jīng)元細(xì)胞LDH活性顯著高于其他各組，天麻素組、天麻素對照組神經(jīng)元細(xì)胞LDH活性顯著高于空白對照組（P＜0.01）。模型組神經(jīng)元平均累積吸光度（IOD）值顯著高于其他各組，空白對照組神經(jīng)元平均IOD值顯著低于其他各組（P＜0.01）。結(jié)論 天麻素能夠顯著降低大鼠缺氧損傷神經(jīng)元EphA4表達(dá)水平，抑制神經(jīng)元細(xì)胞LDH活性，增強(qiáng)細(xì)胞相對活力，對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)具有積極作用，值得進(jìn)一步研究。

天麻素；氯化鈷；皮質(zhì)神經(jīng)元損傷；神經(jīng)保護(hù)；缺血缺氧性腦損傷

［Abstract］Objective To study the repair effect of gastrodin on hypoxic brain neurons damage induced by cobalt chloride in rats，and provide an experimental reference for clinical treatment of ischemic and hypoxic brain damage. Methods Cerebral cortex nerve cells of SD rats were selected for study.The original generation after 7 d，they were numbered according to the culture dish.Primary cells were divided into blank control group，model group，gastrodin group and gastrodin control group by using random number table method，and corresponding treatment was implemented.Cell morphology，neurons relative vigor，lactate dehydrogenase（LDH）release quantity，EphA4 expression difference among four groups were observed.Results The relative activity of neurons in blank control group was significantly higher than that in other groups，the relative activity of neurons in model group was significantly lower than that in gastrodin group and gastrodin control group，the relative activity of neurons in gastrodin group was significantly lower than that in gastrodin control group（P＜0.01）.The neurons LDH activity of model group was significantly higher than that of other groups，the neurons LDH activity of gastrodin group and gastrodin control group were significantly higher than those of blank control group（P＜0.01）.The average neurons IOD of model group was higher than that of other groups，the average neurons IOD of blank control group was lower than that of other groups（P＜0.01）.Conclusion Gastrodin can reduce the expression level of EphA4 in the injured neuron，inhibit the activity of LDH in neuronal cells，and enhance the cell relative viability，has a positive effect on the protection of rat cortical neuronal injury，is worthy of further study.

［Key words］Gastrodin；Cobalt chloride；Cortical neuron injury；Nerve protection；Hypoxic ischemic brain damage

缺血缺氧性腦損傷的病理過程包括能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸分泌過多及一氧化氮蓄積等，上述病理反應(yīng)引發(fā)的級聯(lián)細(xì)胞毒作用是誘發(fā)神經(jīng)元損傷的主要原因［1］。目前已有大量西藥相繼應(yīng)用于神經(jīng)元損傷的預(yù)防及治療，其臨床效果得到了一定認(rèn)可，但伴隨而來的明顯副作用大大限制了其應(yīng)用前景［2］。天麻素的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、心血管功能改善、抗炎及抗自由基作用已被廣泛證實(shí)，研究表明，天麻素還具有增強(qiáng)血管順應(yīng)性作用，有望改善臟器缺血缺氧狀態(tài)、發(fā)揮腦保護(hù)作用［3］。本研究就天麻素對神經(jīng)元損傷的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生24 h內(nèi)健康新生SPF級SD大鼠，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號：120000KXWQR08001。

主要藥品：天麻素（昆明制藥集團(tuán)藥物研究所生產(chǎn)，100 g/瓶，批號：20130115，分析純），純度99.5%，分子量286.27，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1　天麻素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

主要試劑：Neurobasal培養(yǎng)基（美國Gibco公司生產(chǎn)）、B27試劑（斯百匯生物科技有限公司，規(guī)格：10 mL）、胎牛血清（美國Gibco公司生產(chǎn)，規(guī)格：500 mL）、胰蛋白酶（蘇州亞科科技股份有限公司，型號：9002-07-7）、多聚賴氨酸（上海寶曼生物科技公司，濃縮液，25 mg/瓶）、氯化鈷（CoCl2，山東淄博潤興化工廠生產(chǎn)，分析純）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2、5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（美國 Sigma公司，分析純）、乳酸脫氫酶（LDH）定量檢測試劑盒（美國羅氏公司）、抗鼠人肝癌細(xì)胞系A(chǔ)4（EphA4）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、CY3熒光試劑盒（武漢博士得生物制品公司），其他試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2處理方法

1.2.1大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)使用75%乙醇消毒實(shí)驗(yàn)大鼠，在嚴(yán)格無菌條件下，行神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)［4］，持續(xù)7 d。

1.2.2細(xì)胞分組及處理將原代培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞按照培養(yǎng)皿編號，使用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、天麻素組及天麻素對照組，以125 μmol/L CoCl2溶液處理模型組及天麻素組細(xì)胞4 h，然后以25 mg/L天麻素處理天麻素組、天麻素對照組細(xì)胞24 h［5］。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1神經(jīng)元形態(tài)觀察于倒置顯微鏡下，對各組細(xì)胞神經(jīng)元形態(tài)變化進(jìn)行拍照、觀察，并比較。

1.3.2細(xì)胞相對活力檢測采用MTT法，對各組細(xì)胞相對活力進(jìn)行檢測［6］，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，檢測其570 nm波長處吸光度（OD）值。

1.3.3LDH活性檢測LDH活性檢測采用速率法［7］，檢測其440 nm波長處OD值。

1.3.4EphA4表達(dá)量檢測采用細(xì)胞熒光化學(xué)法，對各組細(xì)胞EphA4表達(dá)量進(jìn)行檢測［8］，紅色熒光即為免疫陽性細(xì)胞。使用Image-Pro Plus 6.0軟件，對各實(shí)驗(yàn)組的熒光圖片單個(gè)細(xì)胞的累積吸光度（IOD）值和平均IOD值進(jìn)行分析并比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)元形態(tài)

倒置顯微鏡觀察結(jié)果示，空白對照組神經(jīng)元形態(tài)均勻一致，大小相仿，胞體飽滿，呈光滑的橢圓形或錐形，神經(jīng)元的突起廣泛分枝，相互交叉，折光性強(qiáng)；模型組神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞折光性下降，胞體萎縮，出現(xiàn)顆粒，軸突變細(xì)變短，形狀僵硬，分枝減少；天麻素組神經(jīng)元形態(tài)較模型組有所改善，胞體萎縮減輕，軸突保留較多，但仍有少數(shù)細(xì)胞壞死；天麻素對照組形態(tài)較對照組稍差。見圖2。

圖2　各組神經(jīng)元細(xì)胞倒置顯微鏡照片（200×）

2.2細(xì)胞相對活力

空白對照組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力顯著高于其他各組，模型組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力顯著低于天麻素組、天麻素對照組，天麻素組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力顯著低于天麻素對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。見圖3。

圖3　各組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力比較

2.3LDH活性

模型組神經(jīng)元細(xì)胞LDH活性顯著高于其他各組，天麻素組、天麻素對照組神經(jīng)元細(xì)胞LDH活性顯著高于空白對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。見圖4。

圖4　各組神經(jīng)元細(xì)胞LDH活性比較

2.4EphA4表達(dá)

熒光顯微鏡觀察結(jié)果示，各組神經(jīng)元胞體、突起均可見紅色熒光顯示，但各組熒光強(qiáng)度存在一定差異。模型組神經(jīng)元平均IOD值顯著高于其他各組，空白對照組神經(jīng)元平均IOD值顯著低于其他各組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5和圖6。

圖5　各組神經(jīng)元細(xì)胞EphA4表達(dá)的熒光染色圖（CY熒光染色，100×）

圖6　各組神經(jīng)元細(xì)胞EphA4表達(dá)水平比較

3　討論

缺血缺氧性腦病存活患者病殘率高達(dá)75%，這與腦組織缺血缺氧引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞死亡，繼而導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損具有密切關(guān)聯(lián)［9-10］。因此，臨床亟需一種能夠有效保護(hù)神經(jīng)元功能、避免神經(jīng)元損傷的藥物。

天麻素是我國傳統(tǒng)中藥材天麻中的主要有效成分，已有大量研究證實(shí)，天麻素具有恢復(fù)大腦皮質(zhì)興奮與抑制過程間平衡失調(diào)等作用［11］。研究表明，天麻素還可通過抑制興奮性氨基酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，在清除自由基、對抗自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮積極效果［12］。本研究結(jié)果示，經(jīng)CoCl2處理后，模型組、天麻素組神經(jīng)元細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的形態(tài)學(xué)變化，以胞體萎縮、細(xì)胞壞死為主，說明天麻素具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

在天麻素神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)元細(xì)胞相對活力最低，但其LDH活性最高，說明模型組神經(jīng)元細(xì)胞存在明顯損傷，而天麻素在一定程度上使CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)性損傷得到抑制，考慮與天麻素在對抗興奮毒性、雙向調(diào)節(jié)一氧化氮和一氧化氮合酶、促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生營養(yǎng)因子、穩(wěn)定胞膜、抗細(xì)胞氧化等方面發(fā)揮的積極作用有關(guān)［13］。大量LDH的漏出表明，神經(jīng)細(xì)胞膜完整性受損，且Cai等［14］研究證實(shí)，LDH活性與神經(jīng)細(xì)胞損傷程度呈正比，故本研究結(jié)果示，天麻素處理后神經(jīng)細(xì)胞LDH漏出量顯著降低，提示天麻素對細(xì)胞膜完整性的維持亦具有一定作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CoCl2處理后，模型組細(xì)胞EphA4表達(dá)水平顯著升高，而天麻素可使細(xì)胞EphA4表達(dá)水平得到明顯控制，與何保麗等［15］研究結(jié)論一致。作為一種具有影響突觸可塑性的基因，EphA4廣泛分布于大腦各個(gè)區(qū)域，并集中于海馬錐體細(xì)胞樹突棘部位，研究表明，配體Ephrin-A3可激活EphA4，誘發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)瀑布，導(dǎo)致樹突棘瓦解，使成熟大腦突出的重構(gòu)能力得以保存［16-18］，因此，EphA4在缺血缺氧損傷后神經(jīng)元的損傷中扮演了重要角色。本研究天麻素組細(xì)胞EphA4表達(dá)得到有效抑制，說明經(jīng)天麻素處理后，EphA4參與的CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷過程得到了有效控制，細(xì)胞自我保護(hù)現(xiàn)象有所降低，神經(jīng)元重構(gòu)能力得以保存，從而有效延緩了神經(jīng)元損傷過程［19-20］。

綜上所述，天麻素能夠有效抑制CoCl2誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，其保護(hù)作用可能與EphA4表達(dá)抑制有關(guān)，為缺血缺氧性腦損傷的臨床治療開拓了新的研究方向，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入觀察。

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Improvement effect of gastrodin on hypoxic brain neurons damage induced by cobalt chloride in rats

BAO YueningCAO Chuanyu
Department of Neurology，People′s Hospital of Guyuan City，Ningxia Hui Autonomous Region，Guyuan756000，China

R332

A

1673-7210（2016）05（b）-0017-04

鮑月寧（1980.4-），女，漢族；研究方向：腦損傷相關(guān)疾病的臨床診治。

曹傳宇（1970.2-），男，漢族，副主任醫(yī)師；研究方向：腦損傷相關(guān)疾病的臨床診治。

2016-01-09本文編輯：李亞聰）