楊桂燕　趙玉琳　郭宇聰　趙　震　高彩球

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，核桃研究中心，陜西 楊凌 712100)

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檉柳液泡膜微囊蛋白的分離

楊桂燕1，2趙玉琳1郭宇聰1趙震1高彩球1

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，核桃研究中心，陜西 楊凌 712100)

采用差速離心和不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法分離和純化檉柳液泡膜微囊，通過western雜交對(duì)獲得的微囊蛋白進(jìn)行檢測(cè)，獲得ThVHAc1蛋白目的條帶，表明分離的液泡膜微囊中含有有效的V-ATPase成分，進(jìn)一步測(cè)定液泡膜微囊對(duì)NaNO3、Na3VO3、NaN3的敏感性及V-ATPase的水解活性和翻轉(zhuǎn)比例。結(jié)果表明：液泡膜微囊主要分布在0～25%蔗糖梯度界面上，且研磨法提取液泡膜微囊具有較高的水解活性和較大的原位比例，表明液氮研磨結(jié)合差速離心及不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法能有效提取檉柳液泡膜微囊。

剛毛檉柳；液泡膜；V-ATPase；翻轉(zhuǎn)比例

植物H+-ATPase對(duì)植物離子運(yùn)輸起重要作用，主要包括分布于細(xì)胞質(zhì)膜上的P-ATPase、分布于葉綠體內(nèi)類囊體膜和線粒體內(nèi)膜上F-ATPase及分布于液泡膜上的V-ATPase[1]。其中，F(xiàn)-ATPase在其發(fā)揮作用過程中主要利用跨膜質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)實(shí)現(xiàn)，而P-ATPase和V-ATPase主要利用ATPase水解產(chǎn)生的能量來驅(qū)動(dòng)跨膜質(zhì)子運(yùn)動(dòng)[2]。

V-ATPase是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和多亞基的復(fù)合蛋白，最基本的功能是維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酸堿性內(nèi)平衡狀態(tài)(pH內(nèi)穩(wěn)態(tài))和建立跨膜電化學(xué)梯度,為相關(guān)的代謝提供能量[3-4]。當(dāng)植物處于脅迫條件時(shí)，V-ATPase在調(diào)控過程中的作用具有復(fù)雜性和多樣性，這不僅體現(xiàn)在V-ATPase本身的結(jié)構(gòu)，也體現(xiàn)在其各個(gè)亞基的變化和調(diào)控上[5-6]。Yamaguchi等[7]認(rèn)為,鹽脅迫下液泡對(duì)Na+的運(yùn)輸是通過液泡中的次級(jí)Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+antiporter，NHX)進(jìn)行的，而Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)的能量由液泡V-ATPase驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子動(dòng)力提供。進(jìn)而，Dietz等[8]認(rèn)為，植物耐鹽的首要條件和特征是V-ATPase基因響應(yīng)鹽脅迫而進(jìn)行的表達(dá)能力，在鹽脅迫下V-ATPase通過改變自身結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及在植物體內(nèi)的數(shù)量來適應(yīng)環(huán)境的改變，從而抵抗鹽脅迫傷害。因此,對(duì)V-ATPase在逆境應(yīng)答調(diào)控中的作用研究，將有助于深入了解植株的抗逆機(jī)理。

V-ATPase在植物液泡膜廣泛分布，是一類對(duì)硝酸鹽敏感，而對(duì)釩酸鹽、疊氮鈉不敏感的酶，因此能通過相應(yīng)的抑制劑來測(cè)定V-ATPase的活性[9]。而對(duì)V-ATPase進(jìn)行研究的首要條件是分離獲得含有V-ATPase的液泡膜微囊蛋白。早年於丙軍等[10]用不連續(xù)蔗糖和葡聚糖分別分離大麥(Hordeumvulgare)幼根的細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜微囊，結(jié)果使用蔗糖梯度離心獲得的液泡膜微囊的翻轉(zhuǎn)比例稍高于葡聚糖。后來Ma等[11]和劉群錄等[11-12]將葡萄糖梯度設(shè)置在0～25%和25%～50%進(jìn)行梯度離心分離胡楊(Populuseuphratica)液泡膜微囊，表明液泡膜微囊主要分布在0～25%蔗糖梯度層面上，且分析表明搗碎法較研磨和超聲波破碎細(xì)胞獲得的液泡膜微囊正向比例較高、封閉性好。因此后續(xù)大多分離液泡膜微囊的方法都在此基礎(chǔ)上進(jìn)行修改和應(yīng)用。

檉柳(Tamarixchinensis)是廣泛分布于干旱、半干旱地區(qū)的一種抗旱耐鹽堿植物，是進(jìn)行抗逆機(jī)制研究的理想材料[13]。為了研究檉柳液泡膜V-ATPase在其抗逆調(diào)控過程中的作用機(jī)理，本研究根據(jù)上述方法進(jìn)行液泡膜微囊分離，以期確定檉柳液泡膜微囊分離的方法，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1植物材料處理

剛毛檉柳(Tamarixhispida)：培植于東北林業(yè)大學(xué)校林場(chǎng)，8年生；2013年4月取其枝條扦插，培養(yǎng)于溫度24 ℃、相對(duì)濕度65%～75%，光照為天然光照周期的塑料大棚中。5個(gè)月后取扦插苗的根和葉用于試驗(yàn)。

1.2液泡膜微囊分離

使用液氮研磨法破碎檉柳根和葉細(xì)胞，利用Beckman 32Ti 80 000、100 000、160 000 g梯度離心和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0～25%、25%～50%蔗糖梯度離心法進(jìn)行液泡膜分離[12]。

1.3Western雜交檢測(cè)提取蛋白

Alyn正在經(jīng)營(yíng)攝影講習(xí)班，為想要拍攝星星的攝影愛好者服務(wù)，他還應(yīng)邀撰寫一本書。同時(shí)，他出售自己制作的Lightroom預(yù)設(shè)，這些預(yù)設(shè)設(shè)計(jì)可以為需要編輯和增強(qiáng)天文攝影效果的攝影師提供結(jié)構(gòu)化的工作流程。這些預(yù)設(shè)（售價(jià)約合人民幣180元，網(wǎng)址www. alynwallacephotography.com）提供了獨(dú)到的降噪算法，使星星從黑暗的夜空中凸顯出來，還有銳化、增強(qiáng)色彩層次等更多功能。他下一步嘗試為星空攝影師開發(fā)濾鏡并投入市場(chǎng)（參見12頁(yè)），他的攝影包里有制造商提供的多個(gè)版本，目前正在試用階段。

使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)膜蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。取40 μg膜蛋白，20 μL loading buffer，加水至40 μL，98 ℃ 5 min，14 000 r/min離心5 min；在濃度為15%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳80 V 1 h，120 V 1 h[11， 14-15]和western blotting驗(yàn)證[11，16]。轉(zhuǎn)膜前，膜于甲醇中浸泡30 s至1 min，再在轉(zhuǎn)膜緩沖液中泡2 min。一抗為ThVHAc1蛋白抗體，是根據(jù)V-ATPase c 亞基蛋白序列在上海艾比馬特公司合成(Abmart Inc，Shanghai)。二抗為AHA3(bs-2 247r)，購(gòu)自北京博奧森生物有限公司(Bioss，Beijing)。

1.4水解活性和翻轉(zhuǎn)比例測(cè)定

根據(jù)Ma、劉群錄等的方法，通過測(cè)定在ATPase水解活性測(cè)定溶液中加或不加體積分?jǐn)?shù)為0.012 5的TrionX-100的水解活性計(jì)算翻轉(zhuǎn)比例[11-12，17]。

1.5數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用SPSS軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1Western 雜交分析獲得的膜微囊蛋白

ThVHAc1為檉柳V-ATPase的重要亞基基因，為了鑒定是否成功分離獲得液泡膜微囊蛋白，制備ThVHAc1蛋白抗體，利用western blotting測(cè)定分離獲得的檉柳地上部分和根部的膜微囊蛋白，結(jié)果見圖1。

圖1結(jié)果顯示：2種膜微囊蛋白與抗體雜交后均具有明顯條帶(GAPDH為內(nèi)參蛋白)。表明分離的檉柳液泡膜微囊蛋白中含有較高成分的V-ATPase，可以用于后續(xù)的酶活性相關(guān)測(cè)定。

2.2抑制劑的選擇及水解活性

液泡膜V-ATPase水解活性通過釋放的無機(jī)磷含量表示。通過向不同蔗糖界面分離的蛋白中加入不同的抑制劑后，測(cè)定水解活性可以獲得V-ATPase的分布。加TritonX-100的水解活性測(cè)定結(jié)果見表1，設(shè)置不加抑制劑時(shí)的水解活性為100。

表1　不同抑制劑處理下的ATPase水解活性

注：V-ATPase、P-ATPase、F-ATPase的抑制劑分別為NaNO3、Na3VO3、NaN3。

表1結(jié)果顯示，加入3種抑制劑后，無論葉還是根中，ATPase水解活性均有明顯變化。在根中，加入抑制劑NaNO3時(shí)，0～25%梯度蔗糖界面被抑制后的ATPase水解活性為22.3%～29.5%，顯著低于25%～50%蔗糖梯度界面的活性61.5%～65.4%，表明V-ATPase主要存在于0～25%蔗糖層；而加NaN3抑制劑時(shí)，在2層蔗糖界面的變化并不大，表明2層中F-ATPase含量可能較少；加Na3VO3時(shí)，25%～50%層蔗糖梯度ATPase被抑制后的活性為22.3%～32.3%，顯著低于0～25%層蔗糖的44.1%～53.3%，表明P-ATPase主要存在于25%～50%層蔗糖梯度界。

在葉中加入3種抑制劑后，各種ATPase活性的變化趨勢(shì)與根中相似。即加入NaNO3后，25%～50%的ATPase活性(63.7%～68.2%)顯著高于0～25%層(22.3%～29.5%)，V-ATPase活性被顯著抑制；NaN3抑制效果在兩層差別不大；加Na3VO3時(shí)0～25%層活性為46.5%～55.5%，顯著高于25%～50%的33.7%～44.8%，P-ATPase被顯著抑制。同時(shí)，葉中3種酶活性均略高于對(duì)應(yīng)根中的ATPase活性，但差異性不顯著。表明液氮研磨法及梯度離心法適合提取檉柳葉和根的液泡膜微囊蛋白。

增加2種抑制劑時(shí)可以比較準(zhǔn)確測(cè)定未被抑制的ATPase水解活性。由表1可知，3種ATPase水解活性隨著各抑制劑濃度的增加，水解活性被抑制效果增強(qiáng)。但加入75 mmol/L NaNO3時(shí)ATPase水解活性(22.3%)與加入50 mmol/L時(shí)(23.7%)無明顯差異，但NaN3和Na3VO3在0.6 mmol時(shí)的效果要明顯高于較低濃度，因此測(cè)定V-ATPase、P-ATPase、F-ATPase水解活性選擇的抑制劑濃度分別為NaN3(0.6 mmol/L)+Na3VO3(0.6 mmol/L)、NaNO3(50 mmol/L)+NaN3(0.6 mmol/L)、NaNO3(50 mmol/L)+Na3VO3(0.6 mmol/L)。結(jié)果顯示，根0～25%蔗糖層的V-ATPase、P-ATPase、F-ATPase水解活性分別為59.7%、18.3%、16.2%，25%～50%層的V-ATPase、P-ATPase、F-ATPase水解活性分別為17.3%、56.8%、15.3%，對(duì)應(yīng)的葉中活性0～25%層為63.2%、20.7%，18.2%，25%～50%層為18.5%、67.9%、16.8%(表1)，表明V-ATPase確實(shí)主要存在于0～25%蔗糖層，而P-ATPase主要存在于25%～50%層，F(xiàn)-ATPase含量較少，推測(cè)其主要分布在這2層蔗糖離心層的離心管底部分被去除。

2.3膜微囊翻轉(zhuǎn)比例

為了解研磨法和蔗糖梯度離心對(duì)檉柳根和葉膜微囊翻轉(zhuǎn)情況的影響，對(duì)相同抑制條件下提取的膜微囊蛋白通過測(cè)定加和不加TritonX-100 后的ATPase水解活性，分析獲得根和葉中的V-ATPase和P-ATPase的翻轉(zhuǎn)比例，見表2。

表2　不同處理下膜微囊的翻轉(zhuǎn)比例

結(jié)果顯示，在加和不加TritonX-100時(shí)V-ATPase的翻轉(zhuǎn)比例在根和葉中分別為15.25%、18.35%，而P-ATPase翻轉(zhuǎn)比例在根和葉中分別為33.02%、32.36%，顯著高于V-ATPase。即研磨和蔗糖梯度離心法能使V-ATPase達(dá)到81.65%～84.75%的原位比例，顯著高于P-ATPase的66.98%～67.64%。表明檉柳液泡膜微囊分離使用研磨和蔗糖梯度離心法較質(zhì)膜分離合適。同時(shí)葉中V-ATPase的翻轉(zhuǎn)比例稍高于根，而葉中P-ATPase的翻轉(zhuǎn)比例稍低于根，但差異均不顯著。一定程度說明檉柳根中的液泡膜分離比葉更適合使用液氮研磨法。

3　結(jié)論與討論

本研究使用液氮研磨的方式破碎檉柳葉和根部細(xì)胞來提取液泡膜微囊，Western blotting雜交表明，所提取的液泡膜微囊在蔗糖梯度0～25%界面上的蛋白中含有大量V-ATPase。不同濃度抑制劑下的ATPase水解活性測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)于檉柳液泡膜微囊V-ATPase、P-ATPase和F-ATPase相關(guān)活性測(cè)定的適宜抑制劑濃度分別為NaN3(0.6 mmol/L)+Na3VO3(0.6 mmol/L)、NaNO3(50 mmol/L)+NaN3(0.6 mmol/L)、NaNO3(50 mmol/L)+Na3VO3(0.6 mmol/L)。劉群錄等人分離胡楊液泡膜微囊測(cè)定其水解活性時(shí)使用的抑制劑濃度是75 mmol NaNO3，0.4 mmol Na3VO3，0.6 mmol NaN3[12]；趙昕等人測(cè)定鹽芥質(zhì)膜ATPase活性時(shí)使用的是0.4 mmol KNO3作為抑制劑[18]，表明不同物種ATPase活性的抑制劑要求的種類和濃度可能不同。

本研究結(jié)果還表明在葉和根中可以使用同一種方法進(jìn)行液泡膜微囊分離。而以往大多數(shù)的液泡膜微囊相關(guān)活性的分析和研究主要是在根中進(jìn)行的。如黃瓜(Cucumissativus)在重金屬脅迫下的液泡膜質(zhì)子泵活性測(cè)定[19]，鎘和銅脅迫下的黃瓜根中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性測(cè)定[20]等;而王歡等人則將發(fā)芽3～4 d大豆(Glycinemax)的中間下胚軸用于液泡膜的分離，發(fā)現(xiàn)液泡膜微囊主要分布在8%～25%蔗糖界面[21]。檉柳中測(cè)定結(jié)果表明,0～25%蔗糖梯度分離即可達(dá)到較高的純度。

分離植物液泡膜的一個(gè)關(guān)鍵影響因素是細(xì)胞的破碎。前期報(bào)道表明在分離液泡膜時(shí)主要利用研磨、搗碎、超聲波破碎3種方法。劉群錄等人研究表明,超聲波法獲得的胡楊膜微囊蛋白產(chǎn)率最高，且隨著超聲波能量的提高產(chǎn)率增大，而研磨法得到的胡楊蛋白得率最低[12]。而馬挺軍等人在分離胡楊液泡膜微囊時(shí)使用搗碎法也可以獲得較高的得率，而使用研磨法時(shí)應(yīng)注意的是保持酶活性[22]。表明這3種方法提取液泡膜微囊在產(chǎn)率上可能有差異，且關(guān)鍵在于保證提取微囊的酶活性。因此本研究在分離檉柳的液泡膜微囊，使用液氮研磨法時(shí)保持樣品處于液氮環(huán)境，待研樣結(jié)束進(jìn)行提取時(shí)也保證低溫。由于細(xì)胞破碎方法也可能會(huì)影響ATPase的翻轉(zhuǎn)比例，如果翻轉(zhuǎn)比例太高，則測(cè)定的酶活差異可能較大。於丙軍等人使用研磨法分離大麥根液泡膜和質(zhì)膜，結(jié)果V-ATPase在蔗糖梯度離心下的原位比例為84.01%，P-ATPase為53.89%[10]，表明蔗糖梯度離心結(jié)合研磨法提取的植物根液泡膜能保持較高的原位比例，是有效分離液泡膜微囊的組合。本研究中，根中V-ATPase和P-ATPase的原位比例分別為84.75%、66.98%，葉中分別為81.65%、67.64%，與大麥根中情況相似，即研磨法和蔗糖梯度離心法提取檉柳液泡膜V-ATPase時(shí)能保持較高的原位比例，P-ATPase則較小。進(jìn)一步表明蔗糖梯度離心適合分離液泡膜微囊，而不適合于質(zhì)膜的分離。

總之，檉柳根和葉液泡膜微囊的分離可以使用液氮研磨法進(jìn)行破碎細(xì)胞，并使用梯度離心和0～25%蔗糖梯度進(jìn)行分離，分離獲得的微囊原位比例較高，可以比較準(zhǔn)確地反應(yīng)膜微囊V-ATPase相關(guān)活性。對(duì)于檉柳V-ATPase，硝酸鹽抑制劑的較佳濃度為50 mmol。

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(責(zé)任編輯張坤)

The Isolation of the Tonoplast Protein of Tamarix hispida

Yang Guiyan1,2,Zhao Yulin1,Guo Yucong1,Zhao Zhen1,Gao Caiqiu1

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University), Harbin Heilongjiang 150040, China;2.College of Forestry, Laboratory of Walnut Research Center,Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling Shaanxi 712100, China)

To further understand the mechanism ofTamarixhispidaV-ATPase under stresses, in the current study， differential centrifugation and discontinuous sucrose density gradient centrifugation were used to isolate and purify theT.hispidatonoplast. The results of Western blotting showed that the ThVHAc1 protein was screened, indicating that the isolated tonoplast contained V-ATPase. Furthermore, the sensitivity of tonoplast ATPase was determined by added with inhibitors NaNO3, Na3VO3, NaN3, and V-ATPase hydrolytic activity and overturn percentage were also determined. The results showed the tonoplast was mainly distributed on the 0-25% sucrose interface, and grinding for insolating the tonoplast showed high V-ATPase hydrolytic and percentage of overturn, indicating liquid nitrogen grinding combined with differential centrifugation and discontinuous density gradient centrifugation methods was effective to isolateT.hispidatonoplast.

Tamarixhispida; tonoplast;V-ATPase;overturn percentage

2015-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000312)資助。

高彩球(1980—)，女，教授。研究方向：林木遺傳育種。Email：gaocaiqiu@nefu.edu.cn。

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.01.005

S718.46

A

2095-1914(2016)01-0028-05

第1作者：楊桂燕(1986—)，女，博士，講師。研究方向：林木抗逆分子遺傳育種。Email：yangguiyan@nwsuaf.edu.cn。