劉瑩瑩，翁仕強，盧 瑛，趙 勇，潘迎捷（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

基于TLH重組蛋白單抗的磁性免疫層析試紙條構建

劉瑩瑩，翁仕強，盧 瑛*，趙 勇，潘迎捷
（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

為了檢測不耐熱溶血毒素TLH，以His-TLH重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術制備TLH單克隆抗體，然后將純化后的單抗與磁珠偶聯(lián)制備免疫磁珠，以此免疫磁珠為標記物構建了TLH重組蛋白的磁性免疫層析檢測試紙條。結果表明，該磁性免疫層析試紙條實現了TLH重組蛋白的快速定性和定量檢測，具有快速、操作簡便、靈敏度高（檢測限12.5 ng/mL）等特點。本研究所構建的磁性免疫層析試紙條為重組溶血毒素的快速鑒定、診斷和檢測提供了一種新途徑。

副溶血性弧菌；不耐熱溶血毒素；單克隆抗體；磁性免疫層析試紙條

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種嗜鹽、革蘭氏陰性桿狀菌，廣泛分布于海洋環(huán)境和各種海產品中，食用污染該菌而又未經良好加工處理的海產品會引發(fā)突發(fā)性食物中毒，可導致傷口感染、腸痙攣、敗血癥、腹瀉、頭痛和惡心等反應［1-6］。副溶血性弧菌最重要的毒力因子是其產生的多種溶血毒素，主要有耐熱的直接溶血毒素（Thermostabledirect hemolysin，TDH），耐熱的直接相關溶血毒素（TDH-related hemolysin，TRH）和不耐熱溶血毒素（Thermolabile hemolysin，TLH）［7-8］。已有很多報道以 TDH和TRH為目標對象開展了研究［9-11］，然而，并不是所有的VP中都含有這兩種溶血毒素。研究發(fā)現TLH廣泛存在于VP中，且tlh基因具有種屬特異性，因此，該基因可作為鑒定識別VP菌株的目標基因［12-13］。

目前對TLH檢測的研究主要有兩種方式，一是建立tlh基因分子生物學和免疫學檢測方法［14-16］；二是克隆重組tlh基因，對其進行原核表達［17-18］，盡管這些方法有較好的靈敏度和特異性，但是其均需要昂貴的儀器設備以及高技術操作，并且檢測時間較長。免疫層析技術是上世紀80年代初期發(fā)展起來的一種快速檢測技術，其基本原理是將生物分子附上標志物，依賴標志物的顏色或發(fā)出的光電磁等信號放大效應進而使得微觀免疫反應的可被檢出或宏觀可視，實現檢測目標物質的目的［19］。目前各種示蹤材料發(fā)展迅速，包括膠體金、稀土元素、熒光微球、量子點、磁珠等［20］。磁性免疫層析技術以免疫磁珠（Immunomagenetic beads，IMBs）作為標記物，近年來，已有人類免疫缺陷病毒（HIV）、人血清Fe蛋白免疫磁珠快速檢測試劑盒等研究報道［21］。磁性免疫層析試紙條和其他試紙條最大的區(qū)別在于，可用磁信號閱讀儀對檢測線和質控線上的磁信號進行讀取，由于磁信號具有“穿透性”，儀器對磁信號的檢測不受膜厚度的影響，能夠檢測捕獲區(qū)域內近100%的磁信號，且磁信號不易受生物材料干擾，因而其檢測靈敏度高，結果的判定更為準確［22］。

本研究利用實驗室已建立的His-TLH重組融合表達體系及其誘導表達方法，將分離純化后的His-TLH重組蛋白免疫小鼠，制備了純度較高、特異性良好的單克隆抗體，利用TLH單抗與磁性納米材料偶聯(lián)制備了免疫磁珠；并以此免疫磁珠為標記物構建了TLH重組蛋白的磁性免疫層析檢測試紙條，探討了TLH單抗在定性和定量檢測TLH重組蛋白方面的應用可行性，為今后進一步建立快速簡便的VP現場檢測方法奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 4—6周齡BALB/c小鼠購自西普爾必凱公司；小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0-Ag14購自上海麥莎公司。

1.1.2實驗菌株 副溶血性弧菌ATCC 33846購自中國科學院微生物研究所。

1.1.3主要試劑耗材 氧化硅納米磁珠（100 nm）購自上海奧潤微納新材料科技有限公司；硼酸，四硼酸鈉，Tween-20，牛血清白蛋白（BSA），購自上海生工；辣根過氧化酶（HRP）標記羊抗鼠IgG，鄰苯二胺（OPD）片劑購自SIGMA公司；胎牛血清（FBS）、HAT、降植烷、抗體亞類鑒定試劑盒購自SIGMA公司；細胞培養(yǎng)所用耗材均購自CRONING公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；蛋白脫鹽柱、IgG抗體純化柱購自GE公司。NHS，EDC購自上海延長生化科技發(fā)展有限公司；MES購自Alafa公司；硝酸纖維素膜，樣品墊，結合墊，吸水紙購自上海捷寧生物科技有限公司；磁性分析儀購自美國Magna Bioscience公司。

1.2His-TLH重組蛋白的單抗制備、純化及其性能表征

1.2.1單克隆抗體的制備 His-TLH重組融合表達體系的構建及其誘導表達參照翁仕強等［18］實驗室的方法并運用割膠回收法［23］進行重組蛋白的純化。單抗的制備采取何勇琴［24］的方法進行，以純化的His-TLH為抗原對4—6周齡雌性BALB/c小鼠分別進行2次腹腔免疫和1次尾靜脈強化免疫?？乖⑸淞糠謩e為30μg和15μg。靜脈注射后第三天將免疫小鼠的脾淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按照K?hler等［25］建立的方法進行細胞融合。采用RPMI-FCS-HAT培養(yǎng)基進行陽性雜交瘤細胞的篩選，取篩選得到的細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，陽性雜交瘤細胞株通過無限稀釋法［26］進行細胞克隆。

1.2.2His-TLH單抗的大量制備與純化 選用雌性BALB/c小鼠，采用常規(guī)小鼠腹水法大量制備TLH單抗。所得腹水于37℃放置1 h后4℃過夜保存，然后20 min離心（4℃，3 000 r/min），所得上清液用50%硫酸銨進行富集，然后利用IgG抗體親和層析柱進行純化，得到TLH單克隆抗體。運用IsoQuickTM Kit for Mouse Monoclonal Isotyping試劑盒鑒定單抗的亞類型。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 本研究采用間接ELISA法進行小鼠抗血清的效價檢測和雜交瘤細胞的篩選。首先以10μg/mL的TLH重組蛋白為抗原包被酶標板，100μL/孔；然后每孔加入150μL PBS（pH 7.4）溶液洗滌3次后，加入250μL封閉液（含2%BSA的PBS），37℃反應1.5 h后用PBS洗滌三次；隨后加入100μL的抗血清稀釋液或雜交瘤細胞培養(yǎng)上清作為一抗，37℃反應1 h；經PBS洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶10 000），100μL/孔，37℃反應1 h；然后加入100μL的OPD底物顯色液，室溫反應10—30 min；最后每孔加入50μL終止液（2 mol/L H2SO4），用酶標儀測量490 nm的吸光值。

1.2.4單克隆抗體的特異性檢測 首先以本研究室構建并表達獲得的His-TLH、His-TDH、His-TRH、His-ALGL為抗原，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗的ELISA法分析所得單抗對其他重組蛋白的特異性反應。其次用競爭ELISA法探討了單抗對TLH重組蛋白的特異性反應。即1∶1 000稀釋后，取100μL分別與400μL不同濃度（1 300 mg/mL、130 mg/mL、13 mg/mL、6.5 mg/mL、1.3 mg/mL、0.13 mg/mL、0.013 mg/mL）的TLH重組蛋白在垂直混合儀上反應45 min，然后將該混合反應液作一抗100μL/孔。以100μL TLH單抗加400μL PBS作為對照樣本，其余部分操作同間接ELISA法。

1.3TLH重組蛋白的磁性免疫層析檢測

1.3.1免疫磁珠的制備 免疫磁珠的制備參照黃韻儀等［27］的方法進行。先用EDC和NHS活化磁珠上的羧基，然后加入一定量的His-TLH抗體與磁珠偶聯(lián)，經活化緩沖液（10 mmol/L MES，0.05%（v/v）Tween-20，pH 5.0）和偶聯(lián)緩沖液（5 mmol/L BS，0.05%（v/v）Tween-20，pH 9.0）洗滌后，最后加入BSA對磁珠上未偶聯(lián)抗體的位點進行封閉，封閉后放入保存液中保存待用。

1.3.2免疫層析試紙條的制備 按照PVC板、硝酸纖維素膜、結合墊、樣品墊、吸水紙的順序依次組裝試紙條，T線噴涂300 mg/L His-TLH，C線噴涂1 mg/mL的羊抗鼠IgG，30℃烘干后在硝酸纖維素膜上貼上覆膜，將組裝完成的試紙條進行切割，每條寬0.5 cm，于干燥處保存［28］。

1.3.3試紙條的特異性檢測 于結合墊上添加5μL免疫磁珠，然后分別加100μL（0.5g/L）的His-TLH、His-TDH和His-ALGL于樣品墊上，對照組加等量0.01 mol/L PBS。待液體完全跑到吸水紙頂端后，將試紙條與卡槽組裝，放入磁性分析儀檢測T線、C線磁信號。

1.3.4磁性免疫層析試紙條對TLH重組蛋白的定量分析 5μL免疫磁珠加在結合墊上，然后樣品墊上分別加100μL系列梯度稀釋的His-TLH（0.01—50μg的His-TLH），對照組添加100μL的10 mmol/L PBS。待液體完全跑到吸水紙頂端后，將試紙條與卡槽組裝，放入磁性分析儀檢測T線、C線磁信號。

2　結果與分析

2.1His-TLH單克隆抗體的制備與純化

三次免疫后，免疫小鼠血清效價達到1∶17 500。細胞融合后10d計算得平均融合率為21.9%。有融合細胞的孔經ELISA檢測，得到1個陽性細胞孔TLH-DB2。然后經過三次克隆篩選，最終得到1株TLH抗體細胞株。篩選完成的抗體細胞株培養(yǎng)上清經抗體亞類鑒定試劑盒鑒定，結果為IgG1，K輕鏈。腹水先后經50%硫銨和IgG抗體親和層析柱純化后，樣品純化結果顯示，只出現重鏈和輕鏈兩條帶，因此，得到的His-TLH單抗純度比較高。

2.2單克隆抗體的特異性表征

由表1可知，His-TLH抗體對His-TLH抗原具有特異性反應，對His-TDH、His-TRH、His-ALGL均無交叉反應。

表1　TLH-DB2抗體的間接　ELISA分析結果Table 1　Result of indirect ELISA of TLH-DB2 antibody

圖1　TLH-DB2競爭抑制曲線Fig.1　Competitive inhibition curve of TLH-DB2

競爭ELISA結果如圖1所示，隨著His-TLH重組蛋白競爭抗原量的增加，OD490值逐漸下降，當競爭抗原量在適宜范圍內時，OD490值呈線性變化，線性區(qū)間為1.3—10 mg/mL。

2.3磁性免疫層析試紙條的特異性檢測

由圖2可知，His-TDH、His-ALGL陰性樣品與空白PBS的T線顏色深度相當，經檢測，磁信號值皆超過1 000，而His-TLH組的T線肉眼不可見，檢測所得磁信號值低于100。由此可見，His-TLH的競爭性免疫試紙條對組氨酸和TDH均無交叉反應，對TLH具有較好的特異性反應。

2.4 磁性免疫層析試紙條對His-TLH重組蛋白的定量分析

由圖3可以看出，隨著His-TLH重組蛋白濃度的減少，T線顏色逐漸加深。取陰性T線磁信號與樣品T線磁信號的差值為縱坐標，His-TLH濃度的對數為橫坐標建立TLH蛋白的定量曲線（圖4）。從肉眼觀察，該方法的定性檢測限在30 mg/L，利用磁信號分析儀進行定量分析，其定量檢測線性范圍為0.01—50μg/mL，根據定量曲線以3倍空白值的標準偏差計算His-TLH的理論定量檢測限為12.5 ng/mL，比定性靈敏度提高了2 000多倍。

圖2　試紙條的特異性檢測結果Fig.2　Result ofspecificdetection by immunochromatographic teststrip

圖3　磁性免疫層析試紙條定量檢測　TLH重組蛋白Fig.3　Quantitativelydetecting TLH recombinant protein by MITS

圖4　TLH重組蛋白磁性免疫層析試紙條定量曲線Fig.4　Quantitative curve of TLH recombinant protein by MITS

3　討論

微生物檢測的方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學方法、分子生物學法等［29］。免疫學方法由于其準確、可靠、快速、特異、成本低的特點，適合于大批樣品的快速篩選和檢測，具有廣泛的應用前景。而在免疫學檢測方法開發(fā)中，高度特異性的單抗是關鍵要素之一。

基于TLH在VP中存在的廣泛性和種屬特異性，本研究嘗試了以重組蛋白His-TLH為抗原制備獲得了TLH的單克隆細胞株（TLH-DB2細胞株），研究發(fā)現TLH-DB2單抗對TLH重組蛋白具有高特異性反應。采用His-TLH特異性單抗和磁性納米材料構建的免疫磁珠，本研究構建了基于His-TLH的競爭性免疫層析試紙條。初步性能表征表明His-TLH單抗可以特異性檢測His-TLH重組蛋白，并可快速簡便地進行定量檢測（檢測限為0.0125 mg/L）。對水產品過敏原的檢測表明磁性免疫層析法穩(wěn)定性強，其磁信號在25℃條件下保存2年變化率 ＜10%［30］，且該方法操作簡便，定性檢測在5—10 min左右，定量檢測約30 min，因而可作為分子生物學工具，應用于重組溶血毒素的鑒定或檢測等研究領域。

本研究所獲TLH單抗對TLH重組蛋白表現出較高的特異性，可作為分子生物學檢測工具，如對重組溶血毒素進行定性或定量檢測。此外，本研究中建立的免疫層析試紙條檢測方法是在為進行任何優(yōu)化條件下的一種應用探討，今后可通過優(yōu)化抗體偶聯(lián)量、層析體系等來提高其檢測靈敏度，為開發(fā)重組溶血毒素的快速診斷和檢測提供支撐。

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（責任編輯：程智強）

Establishment of magnetic immunochromatographic teststrip based on monoclonal antibody against recombinant protein TLH

LIU Ying-ying，WENGshi-qiang，LU Ying*，ZHAO Yong，PAN Ying-jie
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Products Processing&Preservation，College of Foodscience&Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order todetect thermolabile hemolysin（TLH），the recombinant protein His-TLH was used to immunize a BALB/c mouse，the monoclonal antibody（MAb）against recombinant protein TLH was prepared by hybridoma technique，and then the purified MAb was conjugated with magnetic beads to prepare immunomagnetic beads（IMBs），thus a magnetic immunochromatographic teststrip（MITS）being established by taking the IMBs as labels for His-TLH.The test resultshowed that the MITS could be used for qualitative and quantitative assay of recombinant protein TLH，havingsuch advantages assimplicity，rapidity and highsensitivity（thedetection limit：12.5 ng/mL）.Thedeveloped MITS in thisstudy also provides a new means of rapid identification，diagnosis anddetection of recombination hemolysin.

Vibrio parahaemolyticus；Thermolabile hemolysin；Monoclonal antibody；Magnetic immunochromatographic teststrip

R446.6

A

1000-3924（2016）04-076-05

2015-06-01

上海市科技興農重點攻關項目［滬農科攻字（2009）第6-1號?；上海市科學技術委員會部分地方院校能力建設項目（11310501100）；上海市科委工程中心能力提升項目（16DZ2280300）

劉瑩瑩（1989—），女，在讀碩士，研究方向：食品生物技術。E-mail：liuyingying0112@163.com

，Tel：021-61900503，E-mail：y-lu@shou.edu.cn