隋雨菲，歐陽立明，魯洪中，莊英萍，張嗣良

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237

綜 述

黑曲霉組學(xué)研究進(jìn)展

隋雨菲*，歐陽立明*，魯洪中，莊英萍，張嗣良

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237

隋雨菲， 歐陽立明， 魯洪中， 等. 黑曲霉組學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報， 2016， 32（8）: 1010-1025.

Sui YF， Ouyang LM， Lu HZ， et al. Progress in omics research of Aspergillus niger. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1010-1025.

黑曲霉作為重要的工業(yè)發(fā)酵菌株，被廣泛用于多種有機酸和工業(yè)用酶的生產(chǎn)。隨著組學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展和成熟，黑曲霉的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等組學(xué)數(shù)據(jù)不斷增長，宣告著黑曲霉生物過程研究大數(shù)據(jù)時代的到來。從單一組學(xué)的數(shù)據(jù)分析、多組學(xué)的比較到以基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型為中心的多組學(xué)整合研究，人們對黑曲霉高效生產(chǎn)機制的理解不斷深入和系統(tǒng)，這為通過遺傳改造和過程調(diào)控對菌株的生產(chǎn)性能進(jìn)行理性的全局優(yōu)化提供了可能。本文回顧和總結(jié)了近年來黑曲霉的組學(xué)研究進(jìn)展，并提出黑曲霉組學(xué)研究未來的發(fā)展方向。

黑曲霉，基因組，轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組，代謝組，組學(xué)整合，基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型

黑曲霉 Aspergillus niger是一種絲狀子囊真菌，在環(huán)境中十分常見［1］。在自然生長狀態(tài)下，黑曲霉分泌大量多種用途的酶降解環(huán)境中的生物聚合物從而獲得營養(yǎng)。黑曲霉生產(chǎn)的工業(yè)酶在淀粉加工、發(fā)酵、釀造、飲料生產(chǎn)動物飼料和造紙行業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。此外，黑曲霉還可以作為異源蛋白的生產(chǎn)宿主及生產(chǎn)檸檬酸和葡萄糖酸的細(xì)胞工廠，因其具有高產(chǎn)、高分泌、高安全性等優(yōu)點而被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中［2］。黑曲霉基因組序列和注釋信息的公布［1-4］，大大推進(jìn)了后續(xù)的各種組學(xué)研究，使人們能夠更加深入分析這一重要黑色真菌的代謝潛力，以及應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)一步提高它的生產(chǎn)能力［5］。

1　黑曲霉基因組學(xué)進(jìn)展

黑曲霉基因組序列的發(fā)表為其他組學(xué)的研究和生物技術(shù)的應(yīng)用提供了新的平臺［5］。新一代測序技術(shù) （Next Generation Sequencing，NGS）為快速獲得多種基因組序列提供了高效的工具［3］，為基因組和轉(zhuǎn)錄組測序和分析帶來了革命性的突破。目前，已經(jīng)有 4株黑曲霉完成了全基因組測序 （表 1），分別為野生型菌株 ATCC 9029 和高產(chǎn)檸檬酸菌株ATCC 1015，經(jīng)過傳統(tǒng)誘變方法得到的高產(chǎn)酶菌株CBS 513.88，以及無孢子型糖化酶工業(yè)菌株SH2。

2000年，荷蘭帝斯曼公司率先開啟了黑曲霉的全基因組測序工作，對產(chǎn)酶菌株 CBS 513.88進(jìn)行基因組測序。結(jié)果于2007年發(fā)表。并對基因組序列進(jìn)行了較完善的功能注釋，從14 165個預(yù)測的結(jié)構(gòu)基因中識別了6 506個與代謝調(diào)控、細(xì)胞轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)降解有關(guān)的開放閱讀框。在基因組序列和注釋基礎(chǔ)上，他們重新構(gòu)建了包含 1 069個特異性反應(yīng)的黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)模型，很好地解釋了黑曲霉高效生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的機制，充分體現(xiàn)了黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)的多樣性［2］。

第二個進(jìn)行全基因組測序的黑曲霉菌株是實驗室常用的ATCC 9029。由Integrated Genom ics完成測序并于2005年發(fā)表，但是僅構(gòu)建了高度碎片化的序列草圖 （9 510個重疊群（Contigs）），沒有公開發(fā)布基因注釋或者基因預(yù)測結(jié)果［6］。

The Joint Genome Institute （JGI） 在美國能源部資助下對檸檬酸高產(chǎn)菌株ATCC 1015進(jìn)行測序［5］，通過比對發(fā)現(xiàn)其97%的基因序列與CBS 513.88一致，有0.8 Mb新序列，并存在較多的基因組重排、缺失、菌株特異性水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。而且兩種菌株之間單核苷酸多態(tài)性（SNP）水平很高 （平均：7.8 SNPs/kb；最大：160 SNPs/kb）。相比于其他曲霉，黑曲霉具有大量特異性蛋白參與蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸以及類異戊二烯等次級代謝途徑的代謝，反映了黑曲霉作為細(xì)胞工廠的多功能性。不過，不同曲霉屬絲狀真菌間與細(xì)胞運輸、蛋白分泌和蛋白壽命有關(guān)的特異性蛋白數(shù)量基本不變［2］。

2014年華南理工大學(xué)對無孢子糖化酶高產(chǎn)菌株SH2進(jìn)行基因組測序，識別了約11 517個開放閱讀框。通過比較基因組學(xué)分析了黑曲霉SH2和CBS 513.88菌株的不同，發(fā)現(xiàn)SH2菌株缺失與無性孢子形成有關(guān)的基因 （PrpA）。另外細(xì)胞壁多糖合成和細(xì)胞壁完整性信號通路相關(guān)基因出現(xiàn)了序列變異。比較代謝基因組學(xué)表明黑曲霉具有較高的代謝特異性，含有超過1 100個編碼酶的特異性基因［3］。

表1　已發(fā)表的黑曲霉基因組aTab le 1 The pub lished genom es of Aspergillus niger strains

越來越多的曲霉屬基因組測序是開展比較基因組學(xué)研究的堅實基礎(chǔ)?；蚪M序列及注釋信息和基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建使得其他單一組學(xué)的數(shù)據(jù)分析以及多組學(xué)整合成為可能。

2　黑曲霉轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)展

全轉(zhuǎn)錄組層次的數(shù)據(jù)分析可以使研究者更加精確地評估細(xì)胞表型與基因表達(dá)的關(guān)系，加深對細(xì)胞代謝的理解［7］。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，近年來越來越多轉(zhuǎn)錄組研究采用新一代的高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù) （RNA sequencing，RNA-seq）。相比于基因芯片，RNA-Seq技術(shù)能夠獲得新轉(zhuǎn)錄本，可變剪切等更多的基因結(jié)構(gòu)和功能信息，提高測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。測序技術(shù)的日益進(jìn)步推動了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展及其在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.1用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究黑曲霉高產(chǎn)酶機制

黑曲霉作為生產(chǎn)工業(yè)用酶的重要生產(chǎn)菌株，深入研究其高效產(chǎn)酶機制和分泌機制具有重要的現(xiàn)實意義。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析廣泛地應(yīng)用于分析不同環(huán)境變量，不同產(chǎn)酶水平菌株之間產(chǎn)酶量差異的關(guān)鍵因素，尋找起到關(guān)鍵調(diào)控作用的基因或基因簇，為后續(xù)的菌種改造提高黑曲霉產(chǎn)酶性能提供潛在的靶點。

2011年Andersen等［8］對產(chǎn)酸株ATCC 1015和產(chǎn)酶株CBS 513.88進(jìn)行相同培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析，結(jié)果表明產(chǎn)酶菌株 CBS 513.88的參與糖酵解途徑，TCA循環(huán)和氨基酸代謝有關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，尤其與蘇氨酸、絲氨酸和色氨酸這 3個氨基酸合成途徑相關(guān)的基因上調(diào)顯著，而這些氨基酸在葡萄糖淀粉酶 （又名糖化酶，Glucoamylase，GlaA），tRNA合成酶，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運子中含量較高；ATCC 1015中參與生物氧化和電子傳遞鏈、碳水化合物和有機酸轉(zhuǎn)運的基因顯著上調(diào)。代謝流分析結(jié)果表明CBS 513.88中3種氨基酸生物合成途徑的通量至少是ATCC 1 015的2倍，與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果吻合。

為了從全基因組角度分析黑曲霉蛋白分泌途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Kwon等［4］發(fā)現(xiàn)相比于野生型，glaA過表達(dá)菌株中GlaA的mRNA和胞外GlaA水平顯著提高，同時還伴隨著772個基因轉(zhuǎn)錄水平提高，815個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。GO （Gene ontology） 富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因主要涉及 4類功能：內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （ER） 跨膜運輸、蛋白質(zhì)糖基化、囊泡運輸和離子平衡。為通過遺傳改造手段增強目的蛋白的生產(chǎn)能力提供了有力的參考信息。

J?rgensen等［9］設(shè)計了一個新的細(xì)胞截留裝置，可以在高流速下實現(xiàn)幾乎全部細(xì)胞的截留。轉(zhuǎn)錄組分析用于探索低比生長速率下產(chǎn)物合成的潛力。比生長速率接近0時 （＜0.005 h-1），比生長得率穩(wěn)定在最小值 （0.20 g干重/g麥芽糖）。選擇保留培養(yǎng)3個生理學(xué)特征明顯的階段 （0、2、8 d） 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明，比生長速率接近于零時，細(xì)胞表現(xiàn)出從生長階段到繁殖階段的過渡，編碼分泌型水解酶和細(xì)胞周期蛋白的基因下調(diào)表達(dá)，許多編碼分泌型富含半胱氨酸的小蛋白和次級代謝產(chǎn)物的基因上調(diào)表達(dá)。通過以上結(jié)果，預(yù)測比生長速率接近 0條件下培養(yǎng)黑曲霉更適于生產(chǎn)次級代謝物和富含半胱氨酸的蛋白。為研究優(yōu)化黑曲霉中酶蛋白的生產(chǎn)條件提供新的方向。

2.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示黑曲霉在不同碳源條件下的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)

轉(zhuǎn)化復(fù)雜的纖維素和半纖維素成為菌體可利用的簡單碳源是生產(chǎn)二代生物燃料的主要挑戰(zhàn)［9］。真菌是生產(chǎn)植物多糖降解酶類，如纖維素酶和半纖維素酶的重要來源。這些酶在生物燃料的制造過程中有重要應(yīng)用，也是生物燃料制造成本中的重要部分。目前的轉(zhuǎn)錄組研究表明，碳源的種類和水平可以極大地影響黑曲霉中多糖降解酶類的生產(chǎn)。

J?rgensen等［10］在恒化培養(yǎng)且比生長速率相同的條件下，比較木糖和麥芽糖分別作為碳源時黑曲霉的轉(zhuǎn)錄組情況，發(fā)現(xiàn)以麥芽糖作為底物時，胞外酶的生產(chǎn)速率是木糖作為底物時的 3倍，且蛋白分泌增強。轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)的基因中有90個以上與蛋白分泌途徑相關(guān)。這些基因的功能涉及蛋白質(zhì)從核糖體運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)、折疊、N端糖基化、質(zhì)量控制、囊泡包裝以及從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體之間的運輸?shù)冗^程。另外還有大約890個基因的表達(dá)差異倍數(shù)小于2倍，包括分泌途徑和中心代謝途徑的基因。在不同條件下表達(dá)差異較小是細(xì)胞基本功能基因的特點。

Yuan等［11］研究表明AmyR是黑曲霉中重要的麥芽糖依賴型轉(zhuǎn)錄因子，它的減少使得胞外水解酶 （α-淀粉酶 （AamA），α-葡萄糖苷酶（AgdA和 AgdB），以及葡萄糖淀粉酶 （GlaA））酶量降低，這些酶能夠?qū)Ⅺ溠刻寝D(zhuǎn)化為葡萄糖。胞外水解酶的減少導(dǎo)致可利用的葡萄糖減少從而產(chǎn)生一種信號使得葡萄糖轉(zhuǎn)運子也下調(diào)表達(dá)。Vongsangnak等［12］的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生理學(xué)數(shù)據(jù)證實了Yuan的結(jié)論，表明黑曲霉利用AmyR轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控系統(tǒng)而非 MAL調(diào)節(jié)系統(tǒng)激活胞外水解酶類，如葡萄糖淀粉酶 （GlaA），從而提高菌體對麥芽糖的利用。MAL調(diào)節(jié)系統(tǒng)在米曲霉中存在，但在黑曲霉中不存在［12］。

降解植物細(xì)胞壁多糖的酶主要分為 3類：葡萄糖苷水解酶 （GH）、糖酯酶 （CE） 和多糖裂解酶 （PL）［13］。Souza等［14］考察了以甘蔗渣作為碳源時的轉(zhuǎn)錄組，與以葡萄糖為碳源時的轉(zhuǎn)錄組相比，黑曲霉中18個纖維素酶基因和21個半纖維素酶基因 （各占黑曲霉基因組中預(yù)測為纖維素酶和半纖維素酶基因數(shù)量的 58%） 表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)。Pullan等［15］研究黑曲霉在速生柳 （一種能源植物） 誘導(dǎo)下的基因表達(dá)譜，并且與之前研究過的小麥秸稈誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種情況下編碼糖活性酶（Carbohydrate active enzyme， CAZyme） 的基因表達(dá)都大幅上調(diào)。黑曲霉受小麥秸稈誘導(dǎo)時編碼GH62 （阿拉伯呋喃糖酶） 和CE1 （阿魏酸酯酶） CAZyme家族酶的基因表達(dá)水平更高；而受柳樹誘導(dǎo)時，編碼屬于GH5家族的纖維素內(nèi)切酶的兩個基因表達(dá)水平更高。

碳饑餓條件能夠誘導(dǎo)黑曲霉中部分多糖降解酶類的分泌，使其在嚴(yán)峻的條件下通過降解自身細(xì)胞壁或較難利用的碳源來維持細(xì)胞生長。Delmas等［13］發(fā)現(xiàn)暴露于小麥秸稈24 h后，編碼植物細(xì)胞壁降解酶的基因表達(dá)量很高 （約占全部mRNA的20%），然而葡萄糖對降解酶類的基因表達(dá)有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)新的糖酯酶和表面相互作用蛋白，可能具有降解植物細(xì)胞質(zhì)酶的功能。為研究降解酶基因的誘導(dǎo)順序，作者構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子X lnR （木聚糖降解激活子，調(diào)節(jié)木糖誘導(dǎo)的糖苷水解酶和糖酯酶），CreA（碳代謝物阻遏因子） 基因分別缺失的兩個突變株。發(fā)現(xiàn)碳源饑餓條件可以誘導(dǎo)黑曲霉釋放一小部分碳源降解酶類。這些酶起到偵查復(fù)雜的植物多糖的作用，降解細(xì)胞壁釋放少量結(jié)構(gòu)簡單的糖和低聚糖，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)黑曲霉表達(dá)完整的降解酶系。碳源饑餓培養(yǎng)條件誘導(dǎo)黑曲霉分泌對植物多糖具有活性的 CAZyme，這一現(xiàn)象和誘導(dǎo)機制在 Munster等［16］的工作中也得到了證實。碳源饑餓不僅誘導(dǎo)黑曲霉分泌多糖降解酶類，也對細(xì)胞形態(tài)的發(fā)育分化產(chǎn)生極大影響。Nitsche等［17］首次從系統(tǒng)水平分析黑曲霉液體發(fā)酵時碳源饑餓引起的生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平改變。饑餓條件引起了復(fù)雜的形態(tài)改變和細(xì)胞差異，形成空菌絲和分生孢子，而未分支的細(xì)小菌絲獲得二次生長取代老菌絲。與對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)錄組相比，碳源饑餓條件下 3個取樣點 （16、60和140 h） 中至少有1個取樣點中52%的基因 （7 292個） 發(fā)生了差異表達(dá)。其中，自噬和分生孢子形成途徑的基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到明顯的誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄組和分泌蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)表明，饑餓條件高度誘導(dǎo)編碼水解酶的基因轉(zhuǎn)錄使得水解酶 （包括幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶、磷脂酶等） 分泌水平提高，從而有助于降解細(xì)胞壁為菌體的生長提供碳源。

黑曲霉中轉(zhuǎn)錄因子A raR調(diào)控降解植物多糖主要的纖維素/半纖維素酶基因系統(tǒng)。Souzaa等［18］研究了黑曲霉中受到轉(zhuǎn)錄激活因子（X lnR，A raR） 調(diào)控的基因群。應(yīng)用野生株、黑曲霉轉(zhuǎn)錄因子 AraR （L-阿拉伯糖合成途徑特異性調(diào)控子） 和X lnR （木聚糖/纖維素降解系統(tǒng)特異性調(diào)控子） 基因缺失突變株，比較它們分別以D-木糖/L-阿拉伯糖單糖混合物和蒸汽爆破的甘蔗渣作為碳源時的轉(zhuǎn)錄組差異。確認(rèn)了受到XlnR和AraR調(diào)控的基因群，它們的功能主要涉及纖維素和半纖維素的降解和酶蛋白的轉(zhuǎn)運。

不同的碳源條件對黑曲霉表達(dá)多糖降解酶類具有不同的激活和抑制作用，因此尋找適合工業(yè)生產(chǎn)的碳源不僅可以有效地提高酶的產(chǎn)量還能夠降低生產(chǎn)成本。

2.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析黑曲霉孢子萌發(fā)時的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)

黑曲霉在不同發(fā)育狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄組差異很大，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析能夠揭示孢子從休眠到萌發(fā)以及萌發(fā)過程中胞內(nèi)基因表達(dá)譜的變化。

Novodvorska等［19］首次采用RNA-Seq技術(shù)研究了黑曲霉不同發(fā)育狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組變化，研究結(jié)果揭示出休眠孢子與萌發(fā)孢子的轉(zhuǎn)錄組差異很大，而主要的改變發(fā)生在孢子萌發(fā)的第一個小時內(nèi)。休眠的打破與參與蛋白質(zhì)合成，RNA轉(zhuǎn)錄和呼吸代謝等基因轉(zhuǎn)錄水平的提高有關(guān)。休眠孢子的轉(zhuǎn)錄組含有參與糖異生作用和乙醛酸循環(huán)的基因，有利于黑曲霉在饑餓條件誘導(dǎo)的分生孢子形成過程中利用非糖類碳源獲得能量，或用于休眠過程中維持菌體的生命活動。此外，休眠孢子的轉(zhuǎn)錄組含有重要的反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，推測這些反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)調(diào)控功能與孢子從休眠過渡到完全萌發(fā)狀態(tài)密切相關(guān)。

Leeuwen等［20］研究黑曲霉孢子萌發(fā)的前 8小時內(nèi)抗真菌物質(zhì)納他霉素對孢子轉(zhuǎn)錄組的影響。當(dāng)分別用3和10 μmol/L納他霉素處理黑曲霉孢子后，菌絲的兩極分化、芽管形成和有絲分裂受到抑制，10 μmol/L時菌體的同向生長也受到影響。納他霉素阻礙了細(xì)胞內(nèi)甘油和葡萄糖濃度的提高，顯著影響了萌發(fā)前 2小時轉(zhuǎn)錄譜的改變，在這一階段，與轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、能量和細(xì)胞循環(huán)、DNA修飾相關(guān)的基因表達(dá)明顯上調(diào)。在3和10 μmol/L納他霉素條件下分別發(fā)現(xiàn)280和2 586個差異表達(dá)基因。參與麥角固醇合成的基因下調(diào)表達(dá)，但是參與內(nèi)吞作用，相容性溶質(zhì)代謝、編碼保護(hù)蛋白的基因上調(diào)表達(dá)，是黑曲霉在內(nèi)吞作用被納他霉素抑制時的應(yīng)激反應(yīng)。

3　黑曲霉蛋白質(zhì)組學(xué)研究

黑曲霉中蛋白的生產(chǎn)和分泌是一個十分復(fù)雜的過程，且同源和異源蛋白的產(chǎn)量差異很大，同源蛋白的產(chǎn)量是異源蛋白產(chǎn)量的 10-100倍［21］。說明真菌在表達(dá)和分泌異源蛋白過程中遇到瓶頸。為從全局水平研究外源蛋白在黑曲霉中表達(dá)和分泌受限的機制，需要借助現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)研究環(huán)境、基因表達(dá)調(diào)控與蛋白合成及轉(zhuǎn)運之間的復(fù)雜關(guān)系。真菌蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為工業(yè)菌種改造和改進(jìn)工業(yè)發(fā)酵過程提供新的途徑。

3.1培養(yǎng)基對黑曲霉胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的影響

前文已提到，碳源的種類和水平極大地影響了黑曲霉的產(chǎn)酶能力。除了碳源，培養(yǎng)基中的其他成分也可能顯著影響黑曲霉的蛋白質(zhì)組。S?rensen等［22］采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明在含有硝酸鹽和淀粉的培養(yǎng)基中添加乳酸鹽能夠顯著提高黑曲霉產(chǎn)伏馬菌素B2 （Fumonisin B2，F(xiàn)B2） 的產(chǎn)量。在分別含有3%淀粉，3%淀粉和3%乳酸鹽，3%乳酸鹽這3種培養(yǎng)條件下黑曲霉的蛋白質(zhì)組差異很大。共識別到56個與中心代謝途徑相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中大部分涉及磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)、銨同化、脂肪酸合成以及氧化脅迫保護(hù)過程，這些生物過程影響了胞內(nèi)acetyl-CoA和NADPH的水平。淀粉和乳酸鹽可能改變胞內(nèi)代謝物平衡，使得流向acetyl-CoA的碳流提高，NADPH再生能力提高?；谝陨辖Y(jié)論推測黑曲霉 FB2中伏馬菌素的生物合成受到acetyl-CoA調(diào)控。

3.2黑曲霉分泌蛋白質(zhì)組

黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因 （glaA） 啟動子和glaA信號肽序列廣泛用于異源表達(dá)載體的構(gòu)建。然而培養(yǎng)基中的碳源種類對glaA的表達(dá)有不同作用。研究發(fā)現(xiàn)，木糖強烈抑制glaA的表達(dá)，然而麥芽糖是 glaA基因啟動子的強誘導(dǎo)劑［21］。Lu等［21］發(fā)現(xiàn)木糖或麥芽糖對分泌蛋白質(zhì)組的組分影響很大，但是對胞內(nèi)蛋白質(zhì)組影響較小。另一方面，培養(yǎng)基條件的差異對胞內(nèi)蛋白質(zhì)組影響很大。強化表達(dá)分子伴侶，低表達(dá)折疊酶和高表達(dá)空泡蛋白酶使得受控制的反應(yīng)器比搖瓶更有利于蛋白的生產(chǎn)。

2011年以前，對黑曲霉蛋白分泌途徑的研究主要在單一蛋白水平開展，而 Oliveira等［23］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來研究高水平分泌條件下黑曲霉分泌蛋白質(zhì)組和微粒體蛋白質(zhì)組分（M icrosomal protein composition） 的改變。共識別了102個分泌蛋白和1 126個微粒體酶。以山梨醇作為碳源時，D-麥芽糖和D-木糖的誘導(dǎo)分別提高了胞外淀粉降解酶，木聚糖降解酶和微粒體酶的產(chǎn)量，如D-麥芽糖誘導(dǎo)GlaA，D-木糖誘導(dǎo) β-木糖酶。在麥芽糖誘導(dǎo)下與翻譯、囊泡運輸和代謝作用相關(guān)的微粒體蛋白表達(dá)水平更高，而木糖誘導(dǎo)下，與線粒體相關(guān)的微粒體蛋白表達(dá)水平更高。在兩種誘導(dǎo)條件下高表達(dá)的微粒體酶主要作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（ER-associated degradation，ERAD） 途徑和線粒體蛋白，促進(jìn)了ATP依賴型蛋白酶體的裝配。

Braaksma等［24］通過結(jié)合其他相似曲霉的基因模型進(jìn)行預(yù)測，提高了黑曲霉預(yù)測的分泌蛋白質(zhì)組蛋白的數(shù)量，避免基因模型不準(zhǔn)確造成的預(yù)測困難。作為計算機模擬預(yù)測的補充，采用鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué) （Shotgun proteom ics） 分析與生長、碳源消耗相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)組。其中，預(yù)測的 200個帶有信號肽的蛋白被確認(rèn)是分泌蛋白。對蛋白質(zhì)組中缺少同源序列的蛋白信號肽預(yù)測的準(zhǔn)確度達(dá)到 85%。最終通過實驗確認(rèn)了計算機模擬的預(yù)測結(jié)果。

K rijgsheld等［25］將黑曲霉N402菌落劃分為5個同心圓區(qū)域，采用穩(wěn)定的二甲基同位素標(biāo)記處于 5個同心圓區(qū)域的分泌蛋白質(zhì)組，培養(yǎng)條件為以木糖作為碳源、經(jīng)過或未經(jīng)過放線菌酮處理。放線菌酮阻斷了菌落的邊緣蛋白的分泌，但是，相比于未被處理的菌落，經(jīng)放線菌酮處理過的菌落的中心區(qū)域酶分泌能力增強，因為細(xì)胞壁被局部降解。在放線菌酮處理過的菌落中共識別到124個蛋白，其中19個分泌蛋白此前從未被識別，中心區(qū)域和鄰近邊緣區(qū)域的 35個蛋白的表達(dá)量是非添加放線菌酮條件下的 4倍以上，且53個蛋白不存在于非放線菌酮處理條件下的菌落。此外，每個同心區(qū)域的分泌組的組分都有差異，說明黑曲霉蛋白分泌具有空間特異性。在之前研究的基礎(chǔ)上，Krijgsheld等［26］繼續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)孢子形成可抑制蛋白分泌。分別構(gòu)建了ΔflbA和ΔbrlA （分生孢子形成的中心調(diào)節(jié)子基因缺失） 的黑曲霉N402突變株。ΔflbA突變株影響了整個菌落的孢子形成和蛋白分泌，但是 ΔbrlA突變株沒有改變蛋白的空間分泌。通過定量蛋白質(zhì)組分析ΔflbA突變株5個同心圓區(qū)域的分泌組，共識別到 138個帶有信號肽序列的分泌蛋白，18個蛋白從未在黑曲霉的分泌蛋白質(zhì)組中被報道過，101個蛋白之前沒有在野生型黑曲霉N402菌落中被識別。flbA基因失活改變了分泌蛋白在不同空間的分布，并獲得了一個更加復(fù)雜的分泌蛋白質(zhì)組。

蛋白糖基化對其在細(xì)胞中的生物活性和分揀具有重要的作用，但是目前在大多數(shù)真菌中已知的 N端糖基化位點非常有限。Wang等［27］通過應(yīng)用一個采用酰肼基修飾的磁珠對固相的糖肽進(jìn)行富集，提出了第一個黑曲霉N端糖基化位點大規(guī)模圖譜。在黑曲霉的分泌蛋白質(zhì)組和全細(xì)胞裂解液中分析N端糖基化位點，從330 個N端糖蛋白中識別到847個N端糖基化位點。從全細(xì)胞裂解液中識別的N糖蛋白主要位于原生質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體和液泡內(nèi)，說明N糖蛋白在蛋白分泌途徑中的重要作用。此外，序列比對發(fā)現(xiàn)，這些糖蛋白還參與很多生物過程，如基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白折疊和裝配、蛋白修飾和糖代謝途徑等。N端糖基化位點的廣泛分布，且部分多糖占據(jù)了許多蛋白的特殊位點，為從功能上研究蛋白質(zhì)的N端糖基化作用，及其在黑曲霉中的生物技術(shù)應(yīng)用提供了重要的初始信息。

3.3黑曲霉跨膜蛋白質(zhì)組

目前，對木質(zhì)纖維素水解酶以及調(diào)控這類酶表達(dá)的分子機制已經(jīng)得到廣泛的研究，但是對于黑曲霉中葡萄糖的轉(zhuǎn)運機制研究較少。理解黑曲霉的轉(zhuǎn)運組對提高菌種改造水平和優(yōu)化過程設(shè)計非常重要。Sloothaak等［28］首次研究黑曲霉跨膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)組，采用新開發(fā)的隱馬爾可夫模型 （Hidden markov model， HMM） 分析pH 3.5時，高濃度和低濃度葡萄糖條件下黑曲霉跨膜相關(guān)的蛋白質(zhì)組。通過結(jié)合黑曲霉跨膜蛋白質(zhì)組的蛋白豐度值與 HMMgluT值，識別到兩個新的可能的高親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運子。并通過釀酒酵母葡萄糖轉(zhuǎn)運子敲除突變株確定了MstG和M stH的功能和生化特性，為研究提高底物利用率提供了新的角度。

4　黑曲霉代謝物組學(xué)研究

代謝物組定義為一個生物體或一群細(xì)胞在特定時空條件下所有代謝物的集合，這些代謝物是與生物體生理表型相關(guān)度最高的一個組學(xué)層次?？煽康陌麅?nèi)代謝物組數(shù)據(jù)的獲取和代謝通量分析是揭示細(xì)胞真實代謝狀態(tài)的直接證據(jù)，對于提高代謝工程和工業(yè)發(fā)酵過程優(yōu)化的理論和實踐水平也具有重要意義。

本實驗室［29］通過研究黑曲霉產(chǎn)酶突變株GAM 15和模式株CBS 513.88在氧限制的條件下發(fā)酵生理參數(shù)和代謝流分布的差異，確定了黑曲霉生產(chǎn)糖化酶過程中的一些限制性因素。對副產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，突變株的副產(chǎn)物 （草酸和檸檬酸） 積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生株。此外，還發(fā)現(xiàn)草酸的形成與菌體的比生長速率具有協(xié)同關(guān)系，因此進(jìn)入氧限制條件后，草酸的合成速率降低使得更多的碳流流向糖化酶合成，這也成為氧限制條件下糖化酶產(chǎn)量提高的重要原因。基于本實驗室構(gòu)建的黑曲霉中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)，利用代謝流平衡分析 （Flux balance analysis，F(xiàn)BA） 計算胞內(nèi)代謝通量分布。結(jié)果表明，核糖和還原力是限制菌體生長的主要因素。在氧限制階段，糖化酶前體氨基酸的供給成為合成糖化酶主要的限制性因素，因此可通過改造氨基酸合成相關(guān)的基因提高氨基酸的合成，從而加速糖化酶的合成并提高底物利用效率。

此外，本實驗室［30］結(jié)合同位素標(biāo)記和13C代謝流分析方法，研究黑曲霉糖化酶高產(chǎn)菌株DS03043和野生株CBS 513.88的代謝流差異和調(diào)控機制。發(fā)現(xiàn)黑曲霉DS03043細(xì)胞生長速率、葡萄糖利用率和糖化酶產(chǎn)量更高，但是草酸和檸檬酸積累較少。這是因為相比于野生株，高產(chǎn)菌株DS03043中更多的碳流流向氧化磷酸化途徑從而降低了TCA循環(huán)的碳流，減少了副產(chǎn)物的積累，從而提高了糖化酶的產(chǎn)量。這一結(jié)論也與之前的研究結(jié)果吻合。而野生菌 CBS 513.88的氧化還原水平較高，NADH的再生和消耗無法平衡，導(dǎo)致了副產(chǎn)物草酸的積累，同時使得草酰乙酸 （OAA） 和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） 在胞內(nèi)積累，從而降低了葡萄糖的攝入速率，對產(chǎn)物的合成不利。

Wu等［31］發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌和黑曲霉共培養(yǎng)可以顯著提高兩種菌株抗生素的生產(chǎn)能力。采用基于核磁共振 （Nuclear magnetic resonance，NMR） 的代謝物組學(xué)與多元數(shù)據(jù)結(jié)合分析的方法揭示了共培養(yǎng)方式影響黑曲霉和天藍(lán)色鏈霉菌中次級代謝途徑的機理。黑曲霉在共培養(yǎng)方式下可以合成環(huán)二肽環(huán) （Phe-Phe）、2-羥基苯乙酸和苯乙酸這 3種在黑曲霉單獨培養(yǎng)條件下無法合成的化合物。這是由于黑曲霉苯基丙氨酸代謝途徑受到天藍(lán)色鏈霉菌分泌的物質(zhì)的誘導(dǎo)，啟動了Phe-Phe和苯乙酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)。因此，微生物共培養(yǎng)與基于NMR的代謝物組學(xué)結(jié)合的方法可能成為發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物的有效途徑。

5　基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型

基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型 （Genome-scale metabolic network model， GSMM） 是由基因-蛋白質(zhì)-生化反應(yīng)關(guān)聯(lián)組成的特定的微生物代謝網(wǎng)絡(luò)，能夠幫助更全面地理解細(xì)胞的生理特性和代謝能力，并通過整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)分析細(xì)胞的遺傳，表觀遺傳和代謝特性，從全局水平上指導(dǎo)高效、定向調(diào)控和優(yōu)化工業(yè)微生物的生產(chǎn)過程和菌種改造［32-33］。高質(zhì)量的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建是菌株設(shè)計和多層次組學(xué)縱向整合的重要基礎(chǔ)。大量組學(xué)數(shù)據(jù)的涌現(xiàn)為黑曲霉基因組網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和升級提供了必要的基礎(chǔ)條件。

基于黑曲霉基因組和文獻(xiàn)組數(shù)據(jù)，帝斯曼首次構(gòu)建了含有 1 069個反應(yīng)的黑曲霉 CBS 513.88中心代謝途徑的網(wǎng)絡(luò)模型。通過重新構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)解釋了黑曲霉高效生產(chǎn)檸檬酸，葡萄糖酸的機制［2］。2007年，孫際賓等對黑曲霉菌株ATCC9029原始的基因組序列進(jìn)行注釋?；贑BS 513.88和ATCC 9029這兩株黑曲霉的基因組注釋信息，首次構(gòu)建了黑曲霉全基因規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，包括988個特異性酶、2 443個反應(yīng)和2 349個代謝物［5］。

Nielsen小組［34］2008年發(fā)表在Mol Syst Biol的文章在黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)模型研究方面具有里程碑式的意義?；诤谇刮墨I(xiàn)組 371篇文獻(xiàn)重新構(gòu)建的黑曲霉 iMA 871代謝網(wǎng)絡(luò)模型并繪制了代謝網(wǎng)絡(luò)圖包含 1 190個生物化學(xué)特異反應(yīng)，871個開放閱讀框，同工酶的存在使得反應(yīng)數(shù)提高到2 240個。相比于之前Sun等［5］自動構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)，Nielsen等人工重新構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)雖然在規(guī)模上有所減小，但是準(zhǔn)確性更高。采用文獻(xiàn)中的得率、通量分布和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)對模型的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證，證明了模型的可靠性。

在 2008年黑曲霉基因組網(wǎng)絡(luò)模型的基礎(chǔ)上，本實驗室根據(jù)最新的黑曲霉基因組注釋結(jié)果和生理學(xué)實驗數(shù)據(jù)對其進(jìn)行升級。在原有模型的基礎(chǔ)上對所有的代謝物進(jìn)行了重新的注釋整理并對化學(xué)反應(yīng)方程式重新配平。重新測定了黑曲霉的詳細(xì)菌體組成并對能量參數(shù)進(jìn)行重新的擬合。和原有模型比較，新模型中總反應(yīng)總數(shù)從1 380個增加至1 727個，獨立代謝物個數(shù)由775個增加至868個，獨立ORF個數(shù)由871個增加至1 138個，反應(yīng)區(qū)間在胞外、胞質(zhì)和線粒體的基礎(chǔ)上增加了過氧化物酶體反應(yīng)區(qū)間。在原有模型基礎(chǔ)上我們大幅增加了維生素和輔因子的胞內(nèi)合成途徑，進(jìn)一步完善了細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)功能。對于升級的基因組網(wǎng)絡(luò)模型，我們利用恒化實驗數(shù)據(jù)，13C代謝流和代謝物組學(xué)數(shù)據(jù)對模型進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)新模型的預(yù)測值與生理實驗數(shù)據(jù)吻合，表明新模型具有良好的預(yù)測性能。利用升級的模型，我們能夠預(yù)測黑曲霉在大部分碳源的生長情況，同時還預(yù)測了菌株生長的必需基因，最后利用該模型我們預(yù)測了氧限制對有機酸分泌的影響。上述研究表明，升級的黑曲霉基因組網(wǎng)絡(luò)模型在規(guī)模和應(yīng)用范圍等方面有較好的改進(jìn)，為黑曲霉的系統(tǒng)代謝工程改造提供了有力的基礎(chǔ)［35］。

6　多組學(xué)的整合研究與應(yīng)用

在微生物從反應(yīng)器提供的環(huán)境吸取營養(yǎng)進(jìn)行繁殖并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的過程中，基因組是穩(wěn)定的信息源，環(huán)境是可控的物質(zhì)源，兩者相互作用后依次產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝物組和代謝流等組學(xué)數(shù)據(jù)，并以宏觀生理參數(shù) （包括菌絲形態(tài)、耗糖速率、耗氧速率等） 來體現(xiàn)其群體的生長和生理狀態(tài)。各組學(xué)數(shù)據(jù)之間有密切關(guān)系，也各有其優(yōu)缺點。比如轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在降解速度快的問題，影響到測序解析的準(zhǔn)確性，也有許多轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并不翻譯為功能性蛋白質(zhì)；而蛋白質(zhì)組學(xué)中對許多微量蛋白質(zhì)的分離鑒定還存在技術(shù)難度；代謝物組對發(fā)酵產(chǎn)物中復(fù)雜的小分子化合物的準(zhǔn)確定量也未盡如人意等。因此，將多層次組學(xué)結(jié)合起來，互相參考，有助于提高數(shù)據(jù)分析的可靠性，對于菌株的全局理性設(shè)計和遺傳改造有指導(dǎo)意義。

目前黑曲霉中轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組相結(jié)合的研究方法比較常見。黑曲霉分泌系統(tǒng)具有一個良好的蛋白酶質(zhì)量控制機制，與高效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解ERAD途徑密切相關(guān)。而且黑曲霉的分泌系統(tǒng)與哺乳動物和釀酒酵母的分泌系統(tǒng)部分相似［2］。Jacobsa等［32］比較了黑曲霉出發(fā)菌株與3株過表達(dá)菌株 （分別是異源脂肪酶、同源的蛋白酶和水解酶） 的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，通過相關(guān)性分析尋找與酶表達(dá)量正相關(guān)的、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)變化趨勢一致的基因。發(fā)現(xiàn)在酶過表達(dá)菌株中，蛋白和基因水平一致上調(diào)的蛋白主要包括參與碳和氮代謝的蛋白、（氧化） 壓力響應(yīng)蛋白、參與蛋白折疊和 ERAD有關(guān)的蛋白?？赡芤馕吨诿父弋a(chǎn)菌株中，營養(yǎng)代謝、氧化供能、蛋白質(zhì)合成和折疊加工等途徑的活力都有明顯上升。其中只有蛋白降解途徑的蛋白在所有過表達(dá)菌株中都上調(diào)表達(dá)，說明該途徑是進(jìn)行菌種改造最有潛力的途徑。根據(jù)這一研究結(jié)果，他們通過采用gus （編碼β-葡萄糖醛酸酶） 作為報告基因來研究黑曲霉中異源蛋白的生產(chǎn)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜擴大以及液泡數(shù)量增多等方面的影響。在過表達(dá)gus的黑曲霉菌株中敲除了ERAD調(diào)控因子doaA基因以減少目的蛋白的降解，并過表達(dá)寡糖基轉(zhuǎn)移酶sttc基因以增加目的蛋白的糖基化有助于蛋白折疊，結(jié)果確實小幅提高了GUS的表達(dá)。Carvalho等［33］在原始菌株——含有單拷貝或多拷貝葡萄糖氧化酶葡萄糖醛酸酶 （GlaGus） 融合基因的黑曲霉中構(gòu)建了ERAD途徑部分基因的缺失突變株。敲除多拷貝GlaGus過表達(dá)菌株中的derA基因使得細(xì)胞內(nèi)GlaGus蛋白量提高了6倍。以上結(jié)果提示，敲除ERAD途徑的一些基因，結(jié)合異源蛋白的多拷貝表達(dá)可促進(jìn)目的蛋白在胞內(nèi)的積累，同時降解程度降低，因此不失為在曲霉屬宿主中提高異源蛋白表達(dá)量的良策。

以各組學(xué)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)可以分別構(gòu)建得到轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)、分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑網(wǎng)絡(luò)等，它們可以通過基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型互相聯(lián)接，因此構(gòu)建以基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型為中心，能反映細(xì)胞內(nèi)各組分相互作用關(guān)系的全細(xì)胞模型未來的發(fā)展方向。但由于難度很大，目前全細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型的建立仍處于初級階段，僅有少數(shù)幾個模式菌報道過細(xì)胞整合網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建［36］。

Vongsangnak等［37］通過全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型來整合分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和代謝流計算結(jié)果，確定了米曲霉中參與α-淀粉酶合成和分泌、核苷酸代謝和氨基酸代謝重要的組分 （基因、酶、蛋白和代謝物），可能是提高工業(yè)菌株酶產(chǎn)量的潛在靶點。

為分析黑曲霉環(huán)境pH和產(chǎn)酸之間的關(guān)系，Andersen等［38］將全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)與比較基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合，從系統(tǒng)水平分析黑曲霉高效產(chǎn)酸機制。優(yōu)化了的胞外質(zhì)子生成的全基因組網(wǎng)絡(luò)模型，能夠再現(xiàn)檸檬酸和草酸合成偏好的pH值。分析pH 2.5、4.5和 6.0這3種條件下的轉(zhuǎn)錄組差異并進(jìn)行聚類分析，共識別了162個基因簇，它們在不同pH條件下具有不同的轉(zhuǎn)錄模式。識別到了pH依賴型順式作用啟動子元件以及4種受pH調(diào)控的次級代謝產(chǎn)物基因簇。此外，通過比對發(fā)現(xiàn)，構(gòu)巢曲霉 pH調(diào)控Pal/PacC途徑也存在于黑曲霉中。多組學(xué)數(shù)據(jù)與代謝網(wǎng)絡(luò)模型的整合分析，為指導(dǎo)黑曲霉高效產(chǎn)酸，研究工業(yè)生產(chǎn)過程中pH響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了理論依據(jù)。

7　曲霉屬基因組數(shù)據(jù)庫

至今為止，已經(jīng)完成數(shù)百個真菌基因組的測序工作，基因組測序數(shù)據(jù)正在呈井噴式增長。豐富的基因組信息為研究真菌的多樣性提供了新方向。然而，進(jìn)一步解析和理解真菌生活模式這一復(fù)雜的生物學(xué)機制，需要超越基因組的功能研究。組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，能夠通過高通量的方法獲得大量的真菌基因功能數(shù)據(jù) （轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組等等）。但是由此產(chǎn)生的大量組學(xué)數(shù)據(jù)對數(shù)據(jù)處理和分析是一種挑戰(zhàn)［39］。近年來，隨著曲霉菌屬公共數(shù)據(jù)庫的建立，能夠更加有效地管理和處理海量的基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)曲霉菌屬序列間的科學(xué)關(guān)聯(lián)，為曲霉菌屬比較基因組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

CADRE數(shù)據(jù)庫 （http://www.cadre-genomes. org.uk） 建立于 2001年，是一個用于儲存和分析曲霉菌屬基因組數(shù)據(jù)公共的數(shù)據(jù)庫。它可以保存完整的煙曲霉注釋后的基因組序列，并提供搜索，分析和可視化真菌基因組特征的工具。CADRE以Ensembl數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，用來管理測序信息，進(jìn)行輔助注釋并且通過合并構(gòu)巢曲霉和其他曲霉菌種的基因組數(shù)據(jù)，促進(jìn)之后的比較組學(xué)研究［40］。自從 2004年首次發(fā)布后，CADRE數(shù)據(jù)庫已經(jīng)擴展到包含8種其他曲霉的注釋序列，為國際曲霉研究組提供更多必要的支持。Gilsenan等升級了數(shù)據(jù)庫和軟件集，不僅可以更好的管理更加復(fù)雜的數(shù)據(jù)集，通過提供基因組比較數(shù)據(jù)和高通量數(shù)據(jù)還可以改進(jìn)注釋信息［41］。

曲霉屬基因組數(shù)據(jù)庫 （AspGD；http://www.aspgd.org） 是一個免費的在線曲霉菌屬數(shù)據(jù)庫，也是整個真菌研究機構(gòu)重要的信息來源。AspGD除了作為一個數(shù)據(jù)庫以及訪問基因組、轉(zhuǎn)錄組和多態(tài)性數(shù)據(jù)的中心，還擁有全面的比較基因組工具，在20個現(xiàn)有的曲霉屬基因組中探索預(yù)先計算的直系同源基因。AspGD管理員基于構(gòu)巢曲霉、米曲霉、煙曲霉和黑曲霉這 4種關(guān)鍵曲霉菌種的文獻(xiàn)信息完成了基因注釋。通過分析公共的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，表達(dá)序列標(biāo)簽，管理員已經(jīng)反復(fù)提高了曲霉菌基因組的結(jié)構(gòu)注釋信息?；谧罱腞NA-Seq數(shù)據(jù)，報道了構(gòu)巢曲霉、米曲霉和煙曲霉基因組結(jié)構(gòu)注釋信息重大的改進(jìn)，更新了超過2 600個位點的信息［42-43］。

Park等［44］采用標(biāo)準(zhǔn)化的流程對真菌轉(zhuǎn)錄因子 （Transcription Factors， TFs） 注釋，于 2008年構(gòu)建了真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 （FTFD）（http://ftfd.snu.ac.kr）。數(shù)據(jù)庫從 61個真菌和 3個卵菌全基因組數(shù)據(jù)中預(yù)測了75 131個潛在的真菌TFs分別屬于61個家族，數(shù)據(jù)庫還能夠比較分析 TFs在相同菌種和不同菌種之間的分布以及結(jié)構(gòu)差異，構(gòu)建所有 TFs的系統(tǒng)進(jìn)化樹。數(shù)據(jù)庫包含 7種曲霉菌種，其中黑曲霉 ATCC 1015和CBS 513.88分別識別到633和708個轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（Transcription Factor Binding Site， TFBS） 是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)的重要組成部分，為深入研究轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的作用機制，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要收集、整理已發(fā)現(xiàn)的多種TFs和TFBS信息，形成轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫［45］。轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建為系統(tǒng)分析真菌轉(zhuǎn)錄因子，研究從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)起到重要的推動作用。

8　討論與展望

細(xì)胞的生命活動是多層次網(wǎng)絡(luò)相互調(diào)節(jié)作用的結(jié)果，單一組學(xué)的數(shù)據(jù)不足以全面、真實地反映細(xì)胞的代謝活動?；诨蚪M信息構(gòu)建的全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型在很大程度上只是提供了細(xì)胞代謝活動的可能性，具有很大的不確定性。相比于基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究更具有時間和空間特異性。細(xì)胞在不同的生長階段，特定的條件下，轉(zhuǎn)錄組都具有一定差異。通過新一代RNA-Seq技術(shù)能夠提供基因結(jié)構(gòu)，基因功能，新轉(zhuǎn)錄本，可變剪切現(xiàn)象等更多的信息。分析基因的差異表達(dá)能夠幫助研究者深入理解環(huán)境和生物過程對基因表達(dá)的重要影響。分析黑曲霉在蛋白分泌表達(dá)、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、營養(yǎng)物利用和生長生育等方面的差異，為調(diào)控產(chǎn)物的合成途徑，為黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌株的改造提供靶點，為過程調(diào)控提供分子機制的依據(jù)。但是轉(zhuǎn)錄組學(xué)目前還存在取樣點合理性、RNA降解快難以提取高質(zhì)量RNA和無高精度參考基因組條件下轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果準(zhǔn)確性等問題，為轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展提出了挑戰(zhàn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)也搭建起蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)之間的橋梁，因為單一的蛋白質(zhì)組學(xué)不足以清楚地鑒定基因功能，需要轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)加以印證。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)雖然一定程度上能間接反映菌體狀態(tài)的變化，但由于酶的活力受變構(gòu)反饋控制以及胞內(nèi)代謝物濃度的影響，mRNA和蛋白質(zhì)豐度往往無法與胞內(nèi)代謝通量直接關(guān)聯(lián)。代謝物組學(xué)技術(shù)采用高通量和高靈敏度的分析手段，基因和蛋白表達(dá)極小的變化都能在代謝產(chǎn)物上得到放大，所以代謝物組學(xué)是理解生理過程的有效途徑，它能真正地反映菌株的表型，可以用來彌補基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不足［17］。胞內(nèi)代謝通量和胞內(nèi)代謝物池大小的變化提供了細(xì)胞代謝活動的直接證據(jù)且與目標(biāo)產(chǎn)物的合成密切相關(guān)，因此開展以13C代謝流和代謝物組學(xué)為核心的縱向組學(xué)整合研究十分必要。研究表明，僅僅基于基因注釋構(gòu)建的全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型不足以準(zhǔn)確地反映細(xì)胞代謝過程，精確預(yù)測菌體表型，因此從系統(tǒng)生物學(xué)的角度將多層次組學(xué)整合起來，構(gòu)建全細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)模型以從全局高度指導(dǎo)細(xì)胞工廠的理性設(shè)計和發(fā)酵過程優(yōu)化是將來極具吸引力的發(fā)展方向，但數(shù)據(jù)整合和模型化的數(shù)學(xué)方法仍需探索。比如轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與 GSMM 的整合上已有GeneForce， PROM 和 Regulatory FBA （rFBA） 3種算法，integrative om ics-metabolic analysis （IOMA） 算法用于分析蛋白質(zhì)-代謝物組整合的基因組代謝網(wǎng)絡(luò)［46］。

另外，目前的黑曲霉的組學(xué)研究較多集中在碳源種類和水平的影響，以及分泌途徑的組分和調(diào)控等，而發(fā)酵過程中關(guān)鍵生理參數(shù)變化時期的組學(xué)響應(yīng)還缺乏系統(tǒng)深入的研究。例如，黑曲霉在液體發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出多變的菌體形態(tài)［47］，主要分為分散菌絲、成簇、成團(tuán)結(jié)球 3類［48］。絲狀真菌的形態(tài)變化帶來的粘度變化直接影響發(fā)酵過程氧和營養(yǎng)的傳遞過程，進(jìn)一步誘導(dǎo)了菌絲形態(tài)分化，并且與產(chǎn)物的大量合成也密切相關(guān)。因此，研究黑曲霉發(fā)酵過程中生理參數(shù) （比生長速率、呼吸熵、糖耗速率和菌絲形態(tài)等等） 轉(zhuǎn)變時期的多組學(xué)響應(yīng)，揭示過程調(diào)控手段對菌體代謝和產(chǎn)物合成的作用機制，對優(yōu)化黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)過程調(diào)控和菌株遺傳改造也具有重要意義。

REFERENCES

［1］ Baker SE. Aspergillus niger genom ics: past，present and into the future. M ed M ycol， 2006，44（Suppl 1）: 17-21.

［2］ Pel HJ， de W inde JH， A rcher DB， et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88， Nat Biotechnol， 2007， 25（2）: 221-231.

［3］ Yin C， Wang B， He P， et al. Genom ic analysis of the aconidial and high-performance protein producer， industrially relevant Aspergillus niger SH2 strain. Gene， 2014， 541（2）: 107-114.

［4］ Kwon M J， Jorgensen TR， Nitsche BM， et al. The transcriptom ic fingerprint of glucoamylase over-expression in Aspergillus niger. BMC Genom ics， 2012， 13: 701.

［5］ Sun JB， Lu X， Ursula R， et al. Metabolic peculiarities of Aspergillus niger disclosed by comparative metabolic genom ics. Genome Biol，2007， 8（9）: R182.

密切觀察患者各生命體征，所有患者實施CT增強掃描過程中護(hù)理人員需觀察其一次穿刺率與造影劑外滲率，其中前者評價標(biāo)準(zhǔn)為對患者穿刺后，觀察到回血后注入藥液，注射液無外滲則說明穿刺成功；反之穿刺失?。缓笳咧匾u價標(biāo)準(zhǔn)為完成穿刺后注射液無泄漏情況，但增強掃描時造影劑有外滲情況產(chǎn)生，導(dǎo)致患者存在局部疼痛感。

［6］ Andersen MR， Nielsen J. Current status of systems biology in Aspergilli. Fungal Genet Biol，2009， 46（Suppl 1）: 180-190.

［7］ Shi SB， Chen T， Zhao XM. Transcriptome platforms and application to metabolic engineering， Chin J Biotech， 2010， 26（9）: 1187-1198 （in Chinese）.

史碩博， 陳濤， 趙學(xué)明. 轉(zhuǎn)錄組平臺技術(shù)及其在代謝工程中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報， 2010， 26（9）: 1187-1198.

［8］ Andersen， MR， Salazar， MP， Schaap， PJ. Comparative genom ics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88. Genome Res，2011， 21（6）: 885-897.

［9］ J?rgensen TR， Nitsche BM， Lamers GE， et al. Transcriptom ic Insights into the physiology of Aspergillus niger approaching a specific grow th rate of zero. Appl Environ M icrob. 2010， 76（16）：5344-5355.

［10］ J?rgensen TR， Goosen T， van den Hondel CA， et al. Transcriptom ic comparison of Aspergillus niger grow ing on two different sugars reveals coordinated regulation of the secretory pathway. BMC Genom ics， 2009， 10（1）: 44.

［11］ Yuan XL， van der Kaaij RM， van den Hondel CAM JJ， et al. Aspergillus niger genome-w ide analysis reveals a large number of novel alpha-glucan acting enzymes w ith unexpected expression profiles. M ol Genet Genom ics， 2008，279（6）: 545-561.

［12］ Vongsangnak W， Salazar M， Hansen K， et al. Genome-w ide analysis of maltose utilization and regulation in aspergilli. M icrobiology， 2009，155（12）: 3893-3902.

［14］ de Souza WR， de Gouvea PF， Savoldi M， et al. Transcriptome analysis of Aspergillus niger grown on sugarcane bagasse. Biotechnol Biofuels，2011， 4（1）: 40.

［15］ Pullan ST， Daly P， Delmas S， et al. RNA-sequencing reveals the complexities of the transcriptional response to lignocellulosic biofuel substrates in Aspergillus niger. Fungal Biol Biotechnol， 2014， 1（1）: 3.

［16］ van Munster JM， Dalya P， Delmas S， et al. The role of carbon starvation in the induction of enzymes that degrade plant-derived carbohydrates in Aspergillus niger. Fungal Genet Biol， 2014， 72: 34-47.

［17］ Nitsche BM， J?rgensen TR， Akeroyd M， et al. The carbon starvation response of Aspergillus niger during submerged cultivation: insights from the transcriptome and secretome， BMC Genom ics，2012， 13: 380.

［18］ de Souzaa WR， Maitan-A lfenasb GP， de Gouvêa PF， et al. The influence of Aspergillus niger transcription factors A raR and X lnR in the gene expression during grow th in D-xylose，L-arabinose and steam-exploded sugarcane bagasse. Fungal Genet Biol， 2013， 60: 29-45.

［19］ Novodvorska M， Hayer K， Pullan ST， et al. Transcriptional landscape of Aspergillus niger at breaking of conidial dormancy revealed by RNA-sequencing. BMC Genom ics， 2013， 14（1）: 246.

［20］ van Leeuwen MR， K rijgsheld P， W yatt TT， et al. The effect of natamycin on the transcriptome of conidia of Aspergillus niger. Stud M ycol， 2012，74（1）: 71-85.

［21］ Lu X， Sun JB， Nim tz M， et al. The intra- and extracellular proteome of Aspergillus niger grow ing on defined medium w ith xylose or maltose as carbon substrate. M icrob Cell Fact，2010， 9（17）: 23.

［22］ S?rensen LM， Lametsch R， Andersen MR， et al. Proteome analysis of Aspergillus niger: lactate added instarch-containing medium can increase production of themycotoxin fumonisin B2by modifying acetyl-CoA metabolism. BMC M icrobiol， 2009， 9: 255-274.

［23］ de Oliveira JMPF， van Passel MW J， Schaap P， et al. Proteom ic analysis of the secretory response of Aspergillus niger to D-maltose and D-xylose. PLoS ONE， 2011， 6（6）: e20865.

［24］ Braaksma M， Martens-Uzunova ES， Punt PJ， et al. An inventory of the Aspergillus niger secretomeby combining in silico predictions w ith shotgun proteom ics data. BMC Genom ics， 2010， 11（1）: 584.

［25］ K rijgsheld P， A ltelaar AFM， Post H， et al. Spatially resolving the secretome w ithin the mycelium of the cell factory Aspergillus niger. J Proteome Res， 2012， 11（5）: 2807-2818.

［26］ Krijgsheld P， Nitsche BM， Post H， et al. Deletion of flbA results in increased secretome complexity and reduced secretion heterogeneity in colonies of Aspergillus niger. J Proteome Res， 2013， 12（4）: 1808-1819.

［27］ W ang L， A ryal UK， Dai ZY， et al. M apping N-linked glycosylationsites in the secretome and whole cells of Aspergillus niger using hydrazide chem istryand mass spectrometry. J Proteome Res，2012， 11: 143-156.

［28］ Sloothaak J， Odoni DI， de Graaff LH， et al. Aspergillus niger membrane-associated proteome analysis for the identification of glucose transporters. Biotechnol Biofuels， 2015， 8: 150.

［29］ Chen XF， Lu HZ， Tang W J et al. Comparison of two Aspergillus niger mutant and w ild strains based on q-rate and flux balance analysis. J Chin Biotechnol， 2014， 34（8）: 35-40 （in Chinese）.

陳香粉， 魯洪中， 唐文俊. 基于比速率及代謝流的黑曲霉突變株和野生株分析， 中國生物工程雜志， 2014， 34（8）: 35-40.

［30］ Lu HZ， Liu XY， Huang MZ， et al. Integrated isotope-assisted metabolom ics and13C metabolic flux analysis reveals metabolic flux redistribution for high glucoamylase production by Aspergillus niger. M icrob Cell Fact， 2015， 14（1）: 147.

［31］ W u CH， Zacchetti1 B， Ram AFJ， et al. Expanding the chem ical space for natural products by Aspergillus-Streptomyces co-cultivation and biotransformation. Sci Rep， 2015， 5: 10868.

［32］ Jacobsa DI， Olsthoorna MMA， Maillet I， et al. Effective lead selection for improved protein production in Aspergillus niger based on integrated genom ics. Fungal Genet Biol， 2009，46（Suppl 1）: S141-S152.

［33］ Carvalho NDSP， A rentshorst M， Kooistra R， et al. Effects of a defective ERAD pathway on grow th and heterologous protein production in Aspergillus niger. Appl M icrobiol Biotechnol，2011， 89（2）: 357-373.

［34］ Andersen MR， Nielsen ML， Nielsen J. Metabolic model integration of the bibliome， genome，metabolome and reactome of Aspergillus niger. M ol Syst Biol， 2008， 4: 178.

［35］ Lu HZ， Ouyang LM， Xia JY， et al. A comprehensive reconstruction and verification of Aspergillus niger genome-scale metabolic network model. ME Summ it 2015 Abstracts，2015: 120.

［36］ Xu ZX， Zheng P， Sun JB. Reconstruction of whole cell network and design of cell factory. Prog Biochem Biophys， 2014， 41（2）: 105-114（in Chinese）.

徐自祥， 鄭平， 孫際賓. 全細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)重建與細(xì)胞工廠設(shè)計. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2014，41（2）: 105-114.

［37］ Vongsangnak W， Hansen K， Nielsen J. Integrated analysis of the global transcriptional response to α-Amylase over-production by Aspergillus oryzae. Biotechnol Bioeng， 2011， 108（5）: 1130-1139.

［38］ Andersen MR， Linda L， Nielsen J， et al. System ic analysis of the response of Aspergillus niger to ambient pH. Genome Biol， 2009， 10（5）: R47.

［39］ Aguilar-Pontes MV， de Vries R， Zhou MM. （Post-） Genom ics approaches in fungal research. Brief Func Genom ics， 2014， 13（6）: 424-439.

［40］ Mabey JE， Anderson M J， Giles PF， et al. CADRE: the central Aspergillus data REpository. Nucleic Acids Res， 2004， 32（Database issue）: D401-D405.

［41］ Gilsenan JM， Cooley J， Bow yer P. CADRE: the central Aspergillus data REpository 2012. Nucleic Acids Res， 2011， 12: 1-7.

［42］ Arnaud MB， Cerqueira GC， Inglis DO， et al. The Aspergillus genome database （AspGD）: recent developments in comprehensive multispecies curation， comparative genom ics and community resources. Nucleic Acids Res， 2012， 40（Databaseissue）: D653-D659.

［43］ Cerqueira GC， Arnaud MB， Inglis DO， et al. The Aspergillus genome database: multispecies curation and incorporation of RNA-Seq data to improve structural gene annotations. Nucleic Acids Res， 2014， 42（Database issue）: D705-D710.

［44］ Park J， Park J， Jang S， et al. FTFD: an informatics pipeline supporting phylogenom ic analysis of fungal transcription factors. Bioinformatics， 2008，24（7）: 1024-1025.

［45］ Chen HF， Wang JK. The databases of transcription factors. Hereditas， 2010， 32（10）: 1009-1017 （in Chinese）.

陳鴻飛， 王進(jìn)科. 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)數(shù)據(jù)庫. 遺傳，2010， 32（10）: 1009-1017.

［46］ Liu LM， Liu T， Zou W. Constraint-based algorithms for genome scale metabolic model-a review. Chin J Bioproc Eng， 2012， 10（6）: 70-77（in Chinese）.

劉立明， 劉婷， 鄒偉. 基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的約束算法及其應(yīng)用. 生物加工過程， 2012，10（6）: 70-77.

［47］ Tang W J， Xia JY， Chu J， et al. Development and application of morphological analysis method in Aspergillus niger fermentation. Chin J Biotech，2015， 31（2）: 291-299 （in Chinese）.

唐文俊， 夏建業(yè)， 儲炬， 等. 黑曲霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的分析方法建立及應(yīng)用. 生物工程學(xué)報， 2015， 31（2）: 291-299.

［48］ Metz B， Kossen NWF. The grow th of molds in the form of pellets-a literature review. Biotechnol Bioeng， 1977， 19（6）: 781-799.

（本文責(zé)編 陳宏宇）

Progress in omics research of Aspergillus niger

Yufei Sui*, Liming Ouyang*, Hongzhong Lu, Yingping Zhuang, and Siliang Zhang

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering， East China University of Science and Technology， Shanghai 200237， China

Aspergillus niger， as an important industrial fermentation strain， is widely applied in the production of organic acids and industrial enzymes. With the development of diverse omics technologies， the data of genome， transcriptome，proteome and metabolome of A. niger are increasing continuously， which declared the coming era of big data for the research in fermentation process of A. niger. The data analysis from single omics and the comparison of multi-omics， to the integrations of multi-omics based on the genome-scale metabolic network model largely extends the intensive and systematic understanding of the efficient production mechanism of A. niger. It also provides possibilities for the reasonable global optimization of strain performance by genetic modification and process regulation. We reviewed and summarizedprogress in om ics research of A. niger， and proposed the development direction of om ics research on this cell factory.

December 3， 2015； Accepted: February 17， 2016

Yingping Zhuang. Tel: +86-21-64251257； E-mail: ypzhuang@ecust.edu.cn

Aspergillus niger， genome， transcriptome， proteome， metabolome， om ics integration， genome-scale metabolic network model

Supported by: Open Funding Project of the State Key Laboratory of Bioreactor Engineering.

*These authors contributed equally to this study.

生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室開放課題資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-03-07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160307.0956.001.html