杜金城,徐　敏,李柏良,丁秀云,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

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具有抑制大腸桿菌作用的乳酸菌的初步篩選及其益生潛能的研究

杜金城,徐敏,李柏良,丁秀云,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

為了篩選出具有抑制致病性大腸桿菌作用的乳酸菌,本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌ATCC25922作為指示菌,抑菌實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法。通過(guò)發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌ATCC25922的抑菌實(shí)驗(yàn),初步篩選出三株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌ATCC25922具有抑制作用,經(jīng)過(guò)對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)這三株乳桿菌均為嗜酸乳桿菌。隨后又對(duì)這三株嗜酸乳桿菌進(jìn)行了耐酸、耐膽鹽及抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:KLDS1.0901酸耐受性最強(qiáng),而KLDS1.0902和KLDS1.1003與LactobacillusacidophilusNCFM酸耐受性接近;對(duì)照菌株LactobacillusacidophilusNCFM膽鹽耐受能力最強(qiáng),KLDS1.0901和KLDS1.1003與LactobacillusacidophilusNCFM膽鹽耐受能力差異不顯著,KLDS1.0902膽鹽耐受能力最弱;對(duì)于抗生素敏感性,三株嗜酸乳桿菌展現(xiàn)出類似的結(jié)果,對(duì)氨基糖苷類的抗生素展現(xiàn)出耐受;相比于KLDS1.0902,KLDS1.0901和KLDS1.1003有著更好的益生作用潛能,因此隨后將對(duì)這兩株菌在細(xì)胞和動(dòng)物模型中對(duì)抗病原菌的作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

嗜酸乳桿菌,16SrRNA,ATCC25922,牛津杯法,益生作用潛能

腸道疾病主要是由病原微生物引起的,在發(fā)展中國(guó)家,有志賀氏桿菌、霍亂弧菌、病原性大腸桿菌及輪狀病毒所造成感染對(duì)人的生命造成了嚴(yán)重威脅[1]。世界范圍內(nèi),每年有四百萬(wàn)的學(xué)齡前兒童死于急性感染的痢疾,并且大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[2]。對(duì)于大腸桿菌所造成的感染,傳統(tǒng)方法是服用抗生素進(jìn)行治療,但抗生素的使用也隨之帶來(lái)了一些問(wèn)題,抗生素在使用過(guò)程中會(huì)使菌株出現(xiàn)耐藥性,并且病原菌的耐藥性基因存在著水平基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),再加上服用抗生素一段時(shí)間之后常會(huì)出現(xiàn)抗生素相關(guān)的痢疾,既二次腹瀉[3]。因此急需替代的解決方法,乳酸菌一些種屬是腸道的固有菌群,加上長(zhǎng)期安全使用的歷史,使得乳酸菌來(lái)治療大腸桿菌引起的腹瀉就成為了研究的熱點(diǎn)[4],加上乳酸菌可以應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中,擁有巨大的商業(yè)價(jià)值潛能,更是促進(jìn)這一領(lǐng)域的研究發(fā)展。在體外篩選出能抑制致病性大腸桿菌的乳酸菌就顯得尤為重要。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn),來(lái)篩選出能夠抑制致病性大腸桿菌的乳酸菌,并對(duì)篩選出的乳酸菌進(jìn)行酸耐受性、膽鹽耐受性及抗生素敏感性的實(shí)驗(yàn),研究其在人和動(dòng)物體能發(fā)揮對(duì)抗病原菌作用的潛能。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

KLDS1.0901、KLDS1.0902、KLDS1.1003東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)。指示菌大腸桿菌ATCC25922和對(duì)照菌株LactobacillusacidophilusNCFM來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院姜毓君教授的友情贈(zèng)送。

鹽酸國(guó)產(chǎn)分析純;牛膽粉Biotopped公司;氯化鈉上?；菔郎噭┯邢薰?95%乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物英國(guó)Oxoid公司;MRS液體培養(yǎng)基；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;DNA提取試劑盒天根生物試劑有限公司;抗生素的藥敏紙片按YY/T1191-2011抗菌劑藥敏紙片標(biāo)準(zhǔn)制備杭州濱和微生物試劑有限公司。

離心機(jī)GL-21M上海市離心機(jī)研究所;潔凈工作臺(tái)VD-1320北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272上海一恒科技有限公司;DYY-10C電泳儀北京六一儀器廠;遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱YH-2S天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;快速混勻器XK96-A姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司;DU800紫外分光光度計(jì)美國(guó)Beckman公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1上清液的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1無(wú)細(xì)胞上清液的制備將過(guò)夜培養(yǎng)的乳酸菌以2%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中,在37 ℃下靜置培養(yǎng)到穩(wěn)定期。離心(8000 r/min,4 ℃,12 min),收集上清液。之后用0.22 μm濾器過(guò)濾上清液,以除去菌體及其它雜質(zhì)。無(wú)細(xì)胞上清液裝入無(wú)菌的1.5 mL的離心管中,-4 ℃冰箱中備用。

1.2.1.2抑菌實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法[5]測(cè)定乳酸菌對(duì)大腸桿菌ATCC25922生長(zhǎng)繁殖的抑制作用,先在平板內(nèi)加入15 mL含1.5%瓊脂的無(wú)菌水,在滅菌臺(tái)中靜置60 min,之后在平板上放入牛津杯,接下來(lái)調(diào)整大腸桿菌的濃度為1×108CFU/mL,將指示菌菌懸液注入用中試管分裝好的,溫度在50～55 ℃的10 mL滅菌LB培養(yǎng)基中,充分震蕩混勻后,將混合物傾倒于已放有牛津杯的平板中,并在無(wú)菌臺(tái)中室溫保持60 min待培養(yǎng)基凝固后,無(wú)菌條件下將上清液200 μL加入牛津杯中。在4 ℃冰箱中放入2 h后,放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后,記錄培養(yǎng)基上小孔周圍抑菌圈的直徑,作為乳酸菌抑制指示菌生長(zhǎng)的指標(biāo)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)孔周圍形成2 mm寬清晰可見(jiàn)的抑菌圈時(shí),可認(rèn)為有抑菌效果。每株菌做3次重復(fù),取平均值。以抑菌圈的大小表示菌株抑制病原菌生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱[6]。

1.2.2利用16S rRNA的基因?qū)θ晔人崛闂U菌進(jìn)行鑒定

1.2.2.1細(xì)菌基因組DNA的提取根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒的說(shuō)明,進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取。

1.2.2.2對(duì)16S rRNA的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增以三株乳桿菌DNA為模板,利用通用引物27F和1492R對(duì)菌株的16S rRNA的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,反向引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增體系具體如下:滅菌ddH2O,9.5 μL;2×TaqPCR MasterMix,12.5 μL;基因組DNA,1 μL;上游引物,1 μL;下游引物,1 μL。PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;4 ℃保溫。

1.2.2.3PCR結(jié)果檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.4對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析將測(cè)序獲得的基因序列與GenBank中已知16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì),并利用Mega5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。其中,系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用Neighbor-Joining法,隨機(jī)抽樣1000次[7]。

1.2.3嗜酸乳桿菌的酸耐受性實(shí)驗(yàn)三株嗜酸乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)16 h后,進(jìn)行離心(8000 r/min,4 ℃,12 min)收集菌體,菌體用pH為7.2的磷酸鹽的緩沖溶液重懸兩次。處理后的菌體分別放入裝有pH為2和3的無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液的試管中,并調(diào)整菌體的濃度在109CFU/mL。之后將試管放在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,并在0、1、2、3 h分別取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),根據(jù)不同時(shí)間段嗜酸乳桿菌的菌體濃度與各自0 h的菌體濃度作比較,來(lái)評(píng)價(jià)嗜酸乳桿菌對(duì)酸耐受能力的強(qiáng)弱[8]。同時(shí)用LactobacillusacidophilusNCFM作為對(duì)照。

1.2.4嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)通過(guò)以嗜酸乳桿菌NCFM作為對(duì)照菌株,將三株對(duì)大腸桿菌具有抑菌能力的嗜酸乳桿菌及對(duì)照菌株以2%接種量,接種在含有0.3%牛膽粉的MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,同時(shí)以不加牛膽粉的MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯作為對(duì)照。將其放在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,每隔一小時(shí)測(cè)定OD620 nm處的吸光度,連續(xù)測(cè)定8 h。分別記錄乳酸菌在含有0.3%牛膽粉和不含有牛膽粉的MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,OD620 nm的吸光度增加0.3個(gè)單元所需的時(shí)間。膽鹽耐受能力用含有0.3%牛膽粉MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,OD620 nm處的吸光度達(dá)到0.3個(gè)單元所需的時(shí)間,減去不加牛膽粉的MRS的營(yíng)養(yǎng)肉湯中OD620 nm處的吸光度達(dá)到0.3個(gè)單元所需的時(shí)間來(lái)表示,又稱滯后時(shí)間[9]。

1.2.5嗜酸乳桿菌的抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)采用瓊脂片擴(kuò)散法,對(duì)三株嗜酸乳桿菌分別進(jìn)行青霉素G(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、利福平(5 μg/片)、萬(wàn)古霉素(30 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)的敏感性實(shí)驗(yàn)。先將含有1.5%瓊脂的MRS固體培養(yǎng)基滅菌,待其溫度降至50～55 ℃時(shí),再將培養(yǎng)16 h以后達(dá)到穩(wěn)定期的嗜酸乳桿菌加入MRS固體培養(yǎng)基中,保證嗜酸乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基中的濃度為107CFU/mL,之后向平板倒入20 mL的混合液。放置1 h待其凝固之后,用無(wú)菌鑷子將按YY/T1191-2011抗菌劑藥敏紙片標(biāo)準(zhǔn)制備的藥敏紙片貼在MRS固體培養(yǎng)基上,隨后放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,36 h之后用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈的直徑,參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[10]確定菌株對(duì)抗生素是敏感、中介或者耐受。

2　結(jié)果與討論

2.1上清液抑菌實(shí)驗(yàn)

利用雙層瓊脂平板打孔法,對(duì)乳酸菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),其中KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌ATCC25922展現(xiàn)出抑制,抑菌圈的直徑分別為22.1±0.5 mm、20.3±0.4 mm和21.6±0.6 mm。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～圖3。普遍公認(rèn)的起抑菌作用的物質(zhì)有有機(jī)酸(主要是乳酸和乙酸)、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素和類細(xì)菌素物質(zhì)[11],在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)會(huì)對(duì)起抑菌作用的物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖1　KLDS1.0901發(fā)酵上清液對(duì)ATCC25922的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1　The inhibition of the culture supernatant from KLDS1.0901 against ATCC25922

圖2　KLDS1.0902發(fā)酵上清液對(duì)ATCC25922的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2　The inhibition of the culture supernatant from KLDS1.0902 against ATCC25922

圖3　KLDS1.1003發(fā)酵上清液對(duì)ATCC25922的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3　The inhibition of the culture supernatant from KLDS1.1003 against ATCC25922

2.2菌株鑒定的結(jié)果

2.2.116S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由圖4可知,KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的16S rRNA基因片段的PCR產(chǎn)物的條帶清晰,說(shuō)明該擴(kuò)增具有特異性,PCR產(chǎn)物片段的大小分別約為1500 bp,與預(yù)期要求的序列大小相符,可以進(jìn)行純化和測(cè)序。

圖4　菌株KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4　Electrophoresis of PCR products of 16S rRNA gene of the strains KLDS1.0901,KLDs1.0902 and KLDS4.1102注:Lane M,Maker DL5000;Lane 1,KLDS1.0901的16S rRNA gene;Lane 2,KLDS1.0902的16S rRNA gene;Lane 3,KLDS1.1003的16S rRNA gene。

2.2.2三株嗜酸乳桿菌16S rRNA基因序列同源性分析16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹如圖,根據(jù)16S rRNA基因序列分析,三株乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.10003均與LactobacillusacidophilusNCFM聚群,并且可信度值為100,由此可以鑒定三株菌均為嗜酸乳桿菌。

圖5　基于16S rRNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.3三株嗜酸乳桿菌的酸耐受性結(jié)果

由圖6所示,當(dāng)受試菌在pH2的PBS緩沖液中孵育1 h后,四株菌的活菌數(shù)都在104以上,表現(xiàn)出較強(qiáng)的酸耐受性。KLDS1.0902和KLDS1.1003展現(xiàn)出與LactobacillusacidophilusNCFM相似的酸耐受性,但KLDS1.0901酸耐受性更強(qiáng),在pH為2的磷酸鹽緩沖溶液中2 h和3 h分別展現(xiàn)出103和102以上的活菌數(shù)。

圖6　嗜酸乳桿菌對(duì)pH2的酸耐受性Fig.6　The tolerance of Lactobacillus acidophilus to pH2

由圖7所示,在pH3時(shí),所有菌株均表現(xiàn)出了良好的酸耐受能力。在pH3的PBS緩沖液中孵育3 h后,所有菌株的存活量仍均超過(guò)109CFU/mL,在pH為3的PBS緩沖溶液中展現(xiàn)出相似的酸耐受性結(jié)果。

表1　四株嗜酸乳桿菌對(duì)膽鹽耐受能力的結(jié)果

注:每組觀測(cè)值都為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同列數(shù)據(jù)之間標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

圖7　嗜酸乳桿菌對(duì)pH3的酸耐受性Fig.7　The tolerance of Lactobacillus acidophilus to pH3

2.4三株嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受性

表1展示了四株嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受性結(jié)果,所有菌株都能在含有0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng),展現(xiàn)出良好的膽鹽耐受能力。在滯后時(shí)間上KLDS1.0901、KLDS1.1003和LactobacillusacidophilusNCFM差異不顯著,表明三株菌有相似的膽鹽耐受能力.但KLDS1.0902的滯后時(shí)間與其它三株菌差異顯著(p<0.05),明顯落后于其它三株菌,表明KLDS1.0902有較弱的膽鹽耐受能力。

2.5三株嗜酸乳桿菌的抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株對(duì)抗生素的敏感性被認(rèn)為是能安全使用的先決條件[12],因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)三株嗜酸乳桿菌進(jìn)行抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)?？股氐拿舾行詫?shí)驗(yàn)結(jié)果參照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)[10],分別選取了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和其它等5類10種抗生素,進(jìn)行抗生素敏感性實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2。KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003都表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類中慶大霉素和卡那霉素耐受。而對(duì)于氨基糖苷類中的鏈霉素,KLDS1.0901和KLDS1.1003表現(xiàn)出耐受,KLDS1.0902表現(xiàn)出敏感。對(duì)于其它的七種抗生素,三株嗜酸乳桿菌均表現(xiàn)出敏感。三株嗜酸乳桿菌表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類抗生素耐受這可能和菌體存在天然抗藥性基因有關(guān),Soliman A. H.等人[13]對(duì)嗜酸乳桿菌抗生素敏感性測(cè)試,結(jié)果也展現(xiàn)出對(duì)慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素的耐受。

表2　三株嗜酸乳桿菌對(duì)10種抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:其中S表示敏感,I表示中介(表格中沒(méi)有此結(jié)果),R表示耐受,數(shù)字代表抑菌圈的直徑,單位是mm。

3　結(jié)論

本文主要對(duì)能抑制致病性大腸桿菌的乳酸菌進(jìn)行初步篩選,并對(duì)益生潛能進(jìn)行研究。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可得到以下結(jié)論。篩選出三株嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003的上清液均能抑制大腸桿菌ATCC25922,抑菌能力KLDS1.0901>KLDS1.1003>KLDS1.0902;通過(guò)16S rRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,得出三株菌均為嗜酸乳桿菌;對(duì)于酸耐受性結(jié)果可以得出KLDS1.0901酸耐受性最強(qiáng),強(qiáng)于KLDS1.0902、KLDS1.1003和LactobacillusacidophilusNCFM;對(duì)于膽鹽耐受性結(jié)果可以得出對(duì)照菌株LactobacillusacidophilusNCFM對(duì)膽鹽的耐受性最強(qiáng),KLDS1.0902膽鹽耐受能力最弱。但KLDS1.0901和KLDS1.1003與LactobacillusacidophilusNCFM膽鹽耐受能力差異不顯著(p>0.05),表現(xiàn)出相似的膽鹽耐受能力;對(duì)于抗生素敏感性的結(jié)果表明:KLDS1.0901、KLDS1.0902和KLDS1.1003對(duì)大部分抗生素均表現(xiàn)出敏感,而對(duì)一些氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)耐,這是嗜酸乳桿菌普遍存在的現(xiàn)象。以上實(shí)驗(yàn)表明KLDS1.0901和KLDS1.1003有著更強(qiáng)的抑菌作用及益生作用潛能,接下來(lái)會(huì)在細(xì)胞和動(dòng)物模型中,KLDS1.0901和KLDS1.1003對(duì)抗病原菌作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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Preliminary screening of lactic acid bacteria againstEscherichiacoliand the research of probiotic potential for the screening bacteria

DU Jin-cheng,XU Min,LI Bai-liang,DING Xiu-yun,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to select lactic acid bacteria which have the ability to inhibit the growth ofEscherichiacoli,ATCC25922 was used as the indicator bacterium,the culture supernatant from lactic acid bacteria were used to determine if there were antimicrobial activities to the pathogenicEscherichiacoli,using Oxford-cup tests. Three lactic acid bacteria were screened and all of these were determined asLactobacillusacidophilusby phylogenetic analyses of 16S rRNA gene. Subsequently,the tolerance to gastric acidity and bile salts and antibiotic sensitivity of theLactobacillusacidophiluswere further evaluated. The results showed that KLDS1.0901 had the best tolerance to gastric acidity,KLDS1.0902 and KLDS1.1003 had the closer tolerance ability to gastric acidity,comparedLactobacillusacidophilusNCFM. For the tolerance to bile salts,LactobacillusacidophilusNCFM had the best bile tolerance ability and KLDS1.0902 had the weakest ability,there were no considerable differences among KLDS1.0901,KLDS1.1003 andLactobacillusacidophilusNCFM for bile tolerance ability. All of strains showed similar results in the sensitivity to antibiotics,showing tolerance to aminoglycoside antibiotics. Therefore KLDS1.0901 and KLDS1.1003 had the better probiotic potential,compared KLDS1.0902. The antimicrobial effects of KLDS1.0901 and KLDS1.1003 against the pathogenicEscherichiaColishould be further studied in cellular and animal models.

Lactobacillusacidophilus;16S rRNA;ATCC25922;Oxford-cup tests;probiotic potential

2016-01-27

霍貴成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：gchuo58@126.com。

杜金城(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：dujincheng@126.com。

國(guó)家863計(jì)劃(2012AA022108)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.022