何鳳平,潘永貴,李藝筱

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

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同時測定鮮切荸薺黃化組織中柚皮素和圣草酚的高效液相色譜條件探究

何鳳平,潘永貴*,李藝筱

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱,通過考察流動相、柱溫、流速等色譜條件建立了能同時測定鮮切荸薺黃化組織中柚皮素和圣草酚的高效液相色譜法。色譜條件為柱溫:40 ℃;流動相:0.5%冰醋酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min,10%→20% B;10～15 min,20%→30% B;15～25 min,30%→40% B;25～35 min,40%→50% B);流速:1 mL·min-1;進樣量:10 μL;檢測波長:280 nm。此色譜條件下,柚皮素和圣草酚均能得到有效分離,分別在5.60～28.00 μg·mL-1(r=1.0000)、3.20～16.00 μg·mL-1(r=0.9999)范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性關(guān)系良好,加標回收率分別在99.49%～100.71%、98.68%～101.65%(n=6)。本研究所得的高效液相色譜條件簡便快捷、準確可靠,重現(xiàn)性好,能排除其中所含其他物質(zhì)色譜和其他物質(zhì)產(chǎn)生的干擾,因此可用于同時測定鮮切荸薺黃化組織中的柚皮素及圣草酚。

鮮切荸薺,柚皮素,圣草酚,色譜條件,高效液相色譜法

荸薺(Eleocharistuberose),別稱馬蹄、鳧茈、地栗、烏芋等,為多年生草本植物莎草科荸薺屬形成的地下球莖。荸薺不僅質(zhì)脆多汁、營養(yǎng)豐富,而且還可入藥,對多種疾病具有輔助治療的作用。荸薺經(jīng)去皮、切分處理之后即可食用,具有方便、快捷等優(yōu)點,但是經(jīng)過鮮切處理之后,切割表面短期內(nèi)會變黃,嚴重影響了產(chǎn)品外觀品質(zhì)及其他價值。研究發(fā)現(xiàn),引起鮮切荸薺黃化的主要原因是組織中某些物質(zhì)經(jīng)過苯丙烷代謝途徑生成黃酮類物質(zhì)所致,隨著黃色的加深,鮮切荸薺中總黃酮的含量相應(yīng)增加[1]。進一步通過對黃化物質(zhì)進行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,表明鮮切荸薺切割表面的黃化可能主要與圣草酚和柚皮素兩種黃酮類物質(zhì)有關(guān)[2]。因此,建立一種能夠同時測定鮮切荸薺黃化組織中圣草酚和柚皮素含量的方法,是進一步研究鮮切荸薺黃化機制的基礎(chǔ)。

近年來,國內(nèi)外有關(guān)于柚皮素、圣草酚檢測及其含量測定的文獻報道,主要是高效液相色譜法(HPLC),或是與其他方法聯(lián)用[3-6],但是HPLC法主要集中于中草藥中單一柚皮素或圣草酚的檢測及其含量測定,這些條件并不一定適用于鮮切荸薺黃化組織中的柚皮素和圣草酚檢測及其含量測定[7-12]。另外,目前也尚未見到HPLC法測定鮮切荸薺黃化組織中柚皮素或圣草酚的報道,更未曾有同時測定鮮切荸薺黃化組織中柚皮素及圣草酚的報道。

因此,本研究將通過考察色譜條件(包括流動相、柱溫、流速等),使鮮切荸薺黃化組織中柚皮素及圣草酚達到較好的分離,探尋能夠同時測定鮮切荸薺黃化組織中柚皮素和圣草酚及其含量的高效液相色譜條件。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

柚皮素標準品(Naringenin,西力生物公司),CAS號:480-41-1,純度98.0%;圣草酚標準品(Eriodictyol,西力生物公司),CAS號:552-58-9,純度98.0%。

甲醇、乙腈購自美國TEDIA公司,色譜純;水為超純水;冰醋酸、甲酸、磷酸、無水乙醇購自廣州化學(xué)試劑廠,分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀包括G1367E自動進樣器、G1312B二元泵、G1316E柱溫箱、G1314C可變波長紫外檢測器、Agilent 1260LC化學(xué)工作站美國Agilent公司;TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海申生科技有限公司;SB-5200D超聲波清洗機寧波新芝生物科技股份有限公司;AR124CN電子天平奧豪斯儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準品溶液的制備分別精確稱取標準品柚皮素0.70 mg、圣草酚0.40 mg置于5 mL棕色容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成標準品儲備液。精確量取標準品儲備液各1 mL置于5 mL棕色容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得濃度為柚皮素28 μg·mL-1、圣草酚16 μg·mL-1的混合標準品溶液,4 ℃避光保存,備用。

1.2.2樣品制備樣品制備參照Pan等[2]的方法。取新鮮荸薺去皮、切分,置于16 ℃溫度條件下貯藏,待其表面黃化,用不銹鋼刀具削下表面黃化部分,并精確稱取其30.00 g,置于三角瓶中,按料液比為1∶5加入無水乙醇150 mL,40 ℃下超聲波提取30 min,4000 r/min離心分離15 min,取上清液;殘渣同法提取一次。合并上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。將濃縮部分用4 mL甲醇溶解,0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液即為待測樣品溶液。

1.2.3色譜條件的選擇色譜柱為Aglient Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),進樣量為10 μL。最佳檢測波長采用紫外可見分光光度計對“1.2.1”項中制備的柚皮素和圣草酚標準品溶液分別在190～400 nm范圍內(nèi)掃描進行確定;流動相中,比較梯度洗脫1(0～30 min,5%→100%有機相,30～45 min,100%有機相)和梯度洗脫2(0～10 min,10%→20%有機相;10～15 min,20%→30%有機相;15～25 min,30%→40%有機相;25～35 min,40%→50%有機相)以及乙腈-0.5%冰醋酸、甲醇-0.5%冰醋酸、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-1%甲酸、甲醇-1%磷酸、甲醇-水六種流動相體系對柚皮素和圣草酚混標分離效果的影響,確定最終流動相;通過對流速(0.5～1.5 mL·min-1)和柱溫(20～40 ℃)對柚皮素和圣草酚混標分離效果及峰形的影響,確定適宜的流速和柱溫。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析各個指標測定均重復(fù)至少3次。運用Excel2007計算平均值、標準誤(SD)和相關(guān)系數(shù)(r)。運用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法進行差異顯著性分析(p<0.05有顯著差異,p<0.01有極顯著差異)。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長的選擇按照“1.2.3”項中方法進行全波段掃描,結(jié)果見圖1。由圖1所示,柚皮素和圣草酚均在239 nm、280 nm附近有較大吸收,但是由于280 nm波長附近吸收曲線較平穩(wěn),故選擇檢測波長280 nm。

圖1　柚皮素和圣草酚標準品紫外光譜圖Fig.1　UV spectra of naringenin and eriodictyol

2.1.2流動相的選擇為了提高黃化鮮切荸薺中柚皮素和圣草酚的分離效果及結(jié)果的準確度,分別研究了流動相比例和流動相組成對分離的影響。首先,比較了“1.2.3”項中梯度洗脫1和梯度洗脫2對柚皮素和圣草酚混標的分離效果的影響,研究結(jié)果表明柚皮素和圣草酚在梯度洗脫2條件下均能達到有效的分離,故最終選擇梯度洗脫2。此外,乙腈-0.5%冰醋酸、甲醇-0.5%冰醋酸、甲醇-1%冰醋酸、甲醇-1%甲酸、甲醇-1%磷酸、甲醇-水六種流動相體系在梯度洗脫2下對柚皮素和圣草酚標準品分離效果及色譜峰形的影響見圖2。由圖2可以看出,當(dāng)有機相組成為甲醇時,柚皮素和圣草酚出峰時間較晚,且峰形不佳,然而有機相乙腈代替之后,柚皮素和圣草酚不僅出峰時間大大提前,而且峰形變得更尖銳,基線變得平穩(wěn)。從出峰時間、峰形及基線情況考慮,最終選擇乙腈-0.5%冰醋酸體系為流動相。

圖2　不同流動相的圣草酚(1)和柚皮素(2)標準品HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of naringenin and eriodictyolstandard substance analyzed by varied mobile phases

2.1.3流速的選擇流速改變不僅可能影響柚皮素和圣草酚的出峰時間及色譜峰形,也可能影響色譜圖中基線的穩(wěn)定程度[13],因此研究了不同流速對柚皮素和圣草酚分離效果的影響。由圖3知,隨著流速的增加,柚皮素和圣草酚的出峰時間極顯著縮短(p<0.01),而且拖尾現(xiàn)象減輕;另外峰寬極顯著變小(p<0.01),從而使得峰形變得更加尖銳。但是當(dāng)流速達到1.2 mL·min-1時,也許是流速太大致使泵壓力不穩(wěn),使得基線不穩(wěn)。因此最終選擇最佳流速為1.0 mL·min-1。

圖3　不同流速對柚皮素及圣草酚峰形(A)和保留時間(B)的影響Fig.3　Effect of varied flow rate on peak sharp(A) and retention time(B)of naringenin and eriodictyol standard substance

2.1.4柱溫的選擇色譜柱溫的改變會引起溶劑的密度、粘度等物理性質(zhì)改變,譜圖中峰的分離效果、峰形及出峰時間均會因此而受到影響[13],由此進一步研究了不同柱溫對柚皮素和圣草酚分離效果的影響。由圖4可以看出,隨著柱溫升高,柚皮素和圣草酚的出峰時間均前移,與柱溫20 ℃相比,柱溫40 ℃時柚皮素和圣草酚的出峰時間均極顯著縮短(p<0.01),且縮短時間大約為6 min,從而節(jié)省了分析時間;峰寬同樣也極顯著減小(p<0.01),峰形變得更佳。而且適當(dāng)升高柱溫也利于降低柱壓、保護色譜柱,可延長其使用壽命,這與馬建剛等[14]報道結(jié)果一致。故最終選擇40 ℃為理想柱溫。

圖4　不同柱溫對柚皮素及圣草酚峰形(A)和保留時間(B)的影響Fig.4　Effect of varied column temperature on peak sharp(A) and retention time(B)of naringenin and eriodictyol standard substance

2.1.5色譜條件的確定根據(jù)以上實驗結(jié)果,確定同時測定鮮切荸薺黃化表面中柚皮素和圣草酚的HPLC色譜條件如下:

色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:0.5%冰醋酸溶液(A)-乙腈(B),流動相使用前需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾并超聲脫氣;流速:1 mL·min-1;進樣量:10 μL;檢測波長:280 nm;梯度洗脫條件見表1。

表1　梯度洗脫條件

2.2液相檢測方法驗證

液相檢測方法的驗證參照藥典方法[15]并作一些修改。

2.2.1標準曲線及線性關(guān)系實驗取柚皮素和圣草酚標準品混合溶液,配制成柚皮素5.60～28.00 μg·mL-1、圣草酚3.20～16.00 μg·mL-1一系列濃度的標準品混合溶液,按照“2.1.5”項中確定的色譜條件測定色譜峰峰面積,分別以柚皮素和圣草酚濃度X(μg ·mL-1)為橫坐標,色譜峰面積Y為縱坐標進行線性回歸得到回歸方程,以3倍信噪比(3 S/N)計算檢出限,10倍信噪比(10 S/N)計算測定下限[16],結(jié)果見表2。柚皮素和圣草酚具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r≥0.9999,可滿足檢測要求。

表2　柚皮素和圣草酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和測定下限(n=5)

2.2.2精密度實驗取柚皮素和圣草酚標準品混合溶液,按照“2.1.5”項中確定的色譜條件測定,連續(xù)進樣6次,分別記錄柚皮素和圣草酚保留時間及色譜峰面積。求得柚皮素和圣草酚保留時間RSD分別為0.03%和0.02%,色譜峰面積RSD分別為0.90%和0.86%(n=6)。柚皮素和圣草酚保留時間和峰面積的相對偏差RSD均小于1%,表明該儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性實驗取待測樣品溶液,分別在制備后0～8 h內(nèi)進樣,然后每隔2 h在“2.1.5”項中確定的色譜條件下進樣分析,記錄柚皮素和圣草酚的色譜峰面積,求得柚皮素和圣草酚色譜峰面積的平均值分別為121.49和228.71,相對偏差RSD分別為0.65%和0.78%(n=5)。柚皮素和圣草酚峰面積相對偏差RSD均小于1%,說明待測樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4重現(xiàn)性實驗取同一批鮮切荸薺黃化樣品,平行6份,按照“1.2.2”項方法制備待測樣品溶液,然后在“2.1.5”項中確定的色譜條件下測得柚皮素平均含量為8.33 μg·g-1,RSD為0.65%(n=6);圣草酚平均含量為3.47 μg·g-1,RSD為0.62%(n=6)。結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.2.5加標回收率實驗精確稱取已知柚皮素和圣草酚含量的同一批鮮切荸薺黃化樣品6份,每份精確稱取30.00 g,適量加入柚皮素和圣草酚標準品儲備液,按照上述“1.2.2”項方法制備待測樣品溶液,在“2.1.5”項中確定的色譜條件下進樣分析,計算出柚皮素含量加標回收率和圣草酚含量回收率結(jié)果見表3。本方法測得柚皮素含量加標回收率在99.46%～100.71%,RSD=0.44%(n=6);圣草酚含量回收率為98.68%～101.54%,RSD=1.09%,表明本方法簡便快捷、準確可靠。

2.3樣品分析

取同一批的鮮切荸薺黃化表面樣品各3份,按1.2.2方法制備,然后在確定的色譜條件進樣分析,用外標法計算樣品中柚皮素和圣草酚含量,結(jié)果見表4,色譜圖見圖5。由表4和圖5可以看出,盡管鮮切荸薺黃化表面中含有很多不同的其他組分,但是其中確實存在柚皮素和圣草酚,而且含量較高。

表3　鮮切荸薺黃化組織中柚皮素和圣草酚回收率(n=6)

研究中,曾對提取樣品的試劑進行了研究,荸薺中多糖含量豐富,若提取劑醇濃度太低,提取液會比較粘稠,不易進樣分析,故選擇高濃度的無水乙醇;還比較了無水乙醇和甲醇試劑的提取效果,發(fā)現(xiàn)無水乙醇提取的效果優(yōu)于甲醇。另外,稀釋10倍、100倍和未稀釋的待測樣品進樣分析之后,發(fā)現(xiàn)稀釋10倍的待測樣品雜峰較少,且峰形良好。

表4　鮮切荸薺黃化組織中柚皮素和圣草酚含量±SD)

圖5　標準品(a)和鮮切荸薺黃化樣品(b)的HPLC色譜圖Fig.5　HPLC chromatograms of standard substance(a) and fresh-cut Chinese water-chestnut etiolation sample(b)

3　結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法對鮮切荸薺黃化組織中的柚皮素和圣草酚進行分離測定,研究表明在色譜條件為:柱溫40 ℃,流動相0.5%冰醋酸溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫,流速1 mL·min-1,進樣量10 μL,檢測波長280 nm時柚皮素和圣草酚的分離效果良好。所得的色譜條件簡便快捷,結(jié)果準確可靠,能排除鮮切荸薺黃化組織中所含其他物質(zhì)色譜和其他物質(zhì)產(chǎn)生的干擾,為鮮切荸薺黃化組織中柚皮素和圣草酚測定提供了一定的理論依據(jù)。

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Exploration of simultaneous determination for naringenin and eriodictyol in etiolation tissues of fresh-cut Chinese water-chestnut

HE Feng-ping,PAN Yong-gui*,LI Yi-xiao

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

To explore the simultaneous determination of naringenin and eriodictyol in etiolation extract of fresh-cut Chinese water-chestnut,HPLC was established by optimizing the chromatographic conditions including mobile phase,column temperature,flow rate,etc. in using Agilent Eclipse XDB-C18column. The optimal simultaneous determination conditions were the mobile phase composed of 0.5%(v/v)acetic acid in water(eluent A)and acetonitrile(eluent B)in a linear gradient program of 0～10 min,10%～20% B,10～15 min of 20%～30% B,15～25 min of 30%～40% B and 25～35 min of 40%～50%B at a continual flow rate of 1.0 mL·min-1at a column temperature of 40 ℃,the injection volume was 10 μL,and the UV detection was performed at 280 nm,which could make naringenin and eriodictyol separate successfully. Naringenin and eriodictyol revealed high correlation between 5.60～28.00 μg·mL-1(r=1.0000)and between 3.20～16.00 μg·mL-1(r=0.9999)and exhibited recovery range of 99.49%～100.71% and 98.68%～101.65%(n=6),respectively. The chromatographic conditions were simple,accurate and reliable,with good reproducibility,which can eliminate the chromatography of other substances contained and interference of other substances produced,so it can be used as a method that simultaneously determine naringein and eriodictyol in etiolation tissues of fresh-cut Chinese water-chestnut.

fresh-cut Chinese water-chestnut;naringenin;eriodictyol;chromatographic condition;high performance liquid chromatography(HPLC)

2015-12-08

何鳳平(1991-)，女，碩士，研究方向：果蔬采后生理及保鮮，E-mail:hfping123@126.com。

潘永貴(1970-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生理和貯運保鮮技術(shù)，E-mail:yongui123@126.com。

國家自然科學(xué)基金項目(31360414)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)13-0271-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.047